CN112680797B - 一种去除高丰度rna的测序文库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于高通量测序技术领域，公开了一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法。所述构建方法包括以下步骤：(1)提取样品中的总RNA，将所有RNA连接3’接头；(2)RNA片段化处理；(3)RNA连接5’接头；(4)设计DNA探针，并与高丰度RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂交链；(5)切割DNA：RNA杂交链，使高丰度RNA断开与3’接头的连接；(6)经反转录和PCR扩增，得到去除高丰度RNA的测序文库。该构建方法能够去除高通量测序文库中高丰度RNA，大大降低高丰度RNA的比例，并具有实验步骤简单、成本低、效果好的优势，可提升大规模RNA平行测序文库的质量，节约成本。

Description

一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法。

背景技术

相对于Sanger测序法(双脱氧终止法)每次只能确定几个至数百个脱氧核糖核酸(DNA)分子的序列，新一代高通量测序技术每次能够检测数以百万计的DNA序列，该方法以高通量方法在异质性DNA片段上连接测序接头(高通量DNA文库构建)，以生化反应结合影像技术对DNA标签进行序列测定。DNA文库主要来源于两个：1)在短的基因组DNA片段两边直接加测序接头；2)RNA片段化之后需反转录成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转录成cDNA，然后再片段化并加上接头。而RNA平行测序所采用的方法主要为后者，构建标签库时所用RNA的来源多样，如mRNA、新生链RNA、ncRNA、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和siRNA等。

如今，科学界已越来越多地应用大规模高通量测序技术来研究生物学问题，如：1)在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(De novo sequencing)，获得该物种的基因组参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；2)对已有基因组参考序列的物种，进行全基因组重测序(Resequencing)，在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现不同品种和个体差异的分子基础，进而为物种进化规律提供重要的证据和参考依据；3)与染色质免疫共沉淀(ChIP)和表观遗传标记免疫共沉淀技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组和组蛋白上的表观遗传位点；4)在转录组水平上进行全转录组测序(Whole transcriptome sequencing)，可以开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究；5)进行小分子RNA测序(Small RNA sequencing)，通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子等；6)进行新生链RNA测序，通过多种方法提取RNA聚合酶II(Pol II)转录产生的新生链RNA，用于构建标签库，可以分析细胞在不同生长发育阶段和环境条件下Pol II实时转录动态变化过程。

要想研究以上和RNA组学相关的生物学问题，最基础和重要的是构建高质量的RNA标签库，用于高通量测序得到RNA序列。然而细胞总RNA中含有各种不同的RNA，特别是大量非编码/高丰度的RNA。如核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、细胞核小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)和小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)等。RNA聚合酶I(Pol I)转录rRNA的前体：5.8S、18S和28S rRNA，上述RNA约占细胞总RNA的75％；而RNA聚合酶II(Pol II)转录产生mRNA、大部分snRNA及一些参与调控的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，mRNA只占细胞质RNA的2-5％；而RNA聚合酶III(Pol III)转录的tRNA、5S rRNA和其它一些小RNA，如snRNA和snoRNA，它们约占细胞质RNA的25％；此外，植物细胞还有两类特有的RNA聚合酶：Pol IV和Pol V，转录加工产生siRNA。虽然这些非编码RNA没有起到蛋白质基因功能的作用，然而在很多的生物学过程中起到了至关重要的功能，如siRNA在RNA介导DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)的途径中起作用，miRNA在细胞生长发育中有重要的功能。

然而想要研究各种RNA的结构、功能和作用机制，我们必须从细胞总RNA中富集目标RNA，用于构建标签库。这主要有两种方法，一是通过特定的手段把目标RNA从总RNA中挑选出来，如通过电泳把总RNA分离成能区分大小的弥散带RNA，把大小约为24核苷酸的miRNA片段切割回收、细胞核逃逸(nuclei run on)实验中生物素标记新生链RNA并通过识别生物素的磁珠亲和纯化新生链RNA、利用多聚胸腺嘧啶磁珠富集mRNA而进行RNA-seq建库等。二是在总RNA中去除非目标的其它RNA，如利用生物素标记的探针与高丰度的rRNA杂交，然后用识别生物素的磁珠把这些RNA去除掉；或者利用核糖核酸酶H切割RNA：DNA杂交链中的RNA等。

根据研究目标，我们可以采取不同的方法得到目标RNA，进行标签库的构建，从而得到高质量的测序数据。然而在有些情况下，我们很难从总RNA中挑选出目标RNA，一些高丰度的非编码RNA总会夹杂在其中，例如，从染色质RNA中提取新生链RNA是很难的一个过程，可行的方法是去除掉染色质RNA中大量的rRNA、snRNA和snoRNA，从而使得新生链RNA的比例增加。

现有去除高丰度RNA的方法主要有：1)设计生物素标记的探针与高丰度的非编码RNA杂交，然后用识别生物素的磁珠把这些RNA去除掉；2)设计单链DNA探针与非编码RNA杂交，利用识别并结合RNA:DNA的单抗S9.6抗体，对这些RNA进行免疫沉淀，并去除掉；3)设计单链DNA探针与非编码RNA杂交，利用核糖核酸酶H切割RNA:DNA杂交链中的RNA，从而去除掉非编码RNA；4)双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease，DSN)可以剪切DNA-RNA复合物中的DNA，通过控制反应条件来调节切除非编码RNA的反转录cDNA，从而降低这类RNA在文库中的丰度。

在上述四种方法中，第一种方法需要合成生物素标签的核酸探针，当需要合成的探针较多时，成本比较高，例如，合成一个包含生物素修饰的引物需要约500元，如果有20个高丰度RNA，合成20条引物，则需要花费近一万元，而植物细胞中含有几百条高丰度的非编码RNA，因此花费巨大。第二种方法需要设计特异的单链DNA探针和S9.6抗体进行免疫沉淀，成本相对较高，实验较为复杂。第三种方法利用核糖核酸酶H切割RNA:DNA杂交链中的RNA，需要合成较长的单链DNA探针，因为如果不去除整条RNA，将会有剩余的RNA被克隆到文库中，影响质量，因此使用大量DNA探针和核糖核酸酶H，成本较高。第四种方法利用DSN酶在特定条件下切割RNA:DNA杂交链中的DNA链，商业化DSN酶供货来源单一，价格很高。同时对一次处理，需要优化特定的酶切条件，操作复杂、特异性难以控制。

因此，发明一种低成本、高效和快速去除高丰度/非编码RNA的方法对于构建高质量RNA测序文库是非常重要的，可以使得目标RNA的比例增加，提高文库和测序质量，降低昂贵的测序成本。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种去除高丰度RNA的测序文库及其构建方法，该构建方法能够去除高通量测序文库中高丰度RNA，大大降低高丰度RNA的比例，并具有实验步骤简单、成本低、效果好的优势，可提升大规模RNA平行测序文库的质量，节约成本，为各种与RNA组学相关的研究和应用(如疾病诊断、个性化治疗、遗传疾病筛查等)提供了技术支持。

本发明提出一种去除高丰度RNA的测序文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的总RNA，将所有RNA连接3’接头；

(2)将连接有3’接头的RNA进行片段化处理；

(3)将片段化处理后的RNA连接5’接头；

(4)设计DNA探针，并与高丰度RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂交链；

(5)用RNaseH切割DNA：RNA杂交链，使高丰度RNA断开与3’接头的连接；

(6)经反转录和PCR扩增，得到去除高丰度RNA的测序文库。

本发明利用RNA连接酶对所有RNA(即高丰度RNA和目的RNA)进行3’核酸接头连接；然后对连接有3’接头的所有RNA进行片段化处理；再设计能与高丰度RNA3’端区域互补的单链DNA，进行杂交后形成DNA：RNA杂交链；再用核糖核酸酶H(RNaseH)切割DNA：RNA杂交链，将高丰度RNA与3’核酸接头切断，因而经反转录和PCR扩增后，高丰度RNA便不会被构建到测序文库中，测序文库中只含有目的RNA片段。

优选的，步骤(1)中所述3’接头的核苷酸序列为：

5’-rApp/NNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3’(SEQ ID NO.1)。其中N为随机碱基。

优选的，步骤(2)中所述片段化处理的方法为碱水解。

优选的，步骤(3)中连接5’接头前，采用T4多聚核苷酸激酶对片段化后的RNA的5’末端进行磷酸化修饰，以便发生连接反应。

优选的，步骤(3)中所述5’接头的核苷酸序列为：

5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN-3’(SEQ ID NO.2)。其中N为随机碱基。

优选的，步骤(4)中DNA探针的长度为20-30nt。

优选的，步骤(6)中反转录所用引物的核苷酸序列为：

5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(SEQ ID NO.33)。

优选的，步骤(6)中PCR扩增所用引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’(SEQID NO.34)；

下游引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(SEQ ID NO.35)。所述下游引物中所示第18-23个核苷酸为测序barcoding序列。

优选的，步骤(1)连接3’接头后和/或步骤(3)连接5’接头后，进行RNA纯化并去除多余接头。

本发明还提供了一种去除高丰度RNA的测序文库，由以上构建方法制得。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)在当前利用探针去除高丰度RNA的方法中，往往需要对非编码RNA的全长序列进行合成反义探针、合成修饰探针、利用特殊的抗体或核酸酶，成本高、操作困难、特异性难以控制。而本发明通过巧妙的设计，首先将RNA中连接3’接头和5’接头，再通过在RNA的3’端设计短的特异单链DNA探针与之杂交。因此，对每一个高丰度RNA，只需合成一条短DNA互补探针，灵活性和通用性强，并且使用核糖核酸酶H也会相应下降，使得成本大大降低(例如合成一条长度为20nt的探针仅需花费25元左右，远远低于其他现有的技术手段)。

(2)相比于传统RNA测序文库的构建，本申请仅增加了核酸杂交、核糖核酸酶H酶切和RNA纯化步骤，实验过程简单。

(3)相比于采用传统技术直接对高丰度RNA进行杂交链酶切时，如果有未降解完全的RNA片段，也会进到最终文库里，因此需要更多核糖核酸酶H的参与，不仅提高了成本，也同样难以实现对高丰度RNA的有效去除。而本发明在降解杂交链中的RNA时，只需要有一个切口就能达到在cDNA文库中去除高丰度RNA的目的，效果更佳，成本更低。

附图说明

图1表示构建RNA测序文库中去除高丰度RNA的方法示意图；其中A表示预实验，B表示正式实验。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1

本实施例提供一种去除高丰度RNA的测序文库，本实施例中所去除的高丰度RNA为snoRNA(核仁小RNA)，该构建方法包括：

一、预实验

图1中A所示为预实验的实验流程，通过预实验把所有RNA都进行文库构建后，采用高通量测序确定得到高丰度snoRNA的序列。

二、正式实验

图1中B所示为正式实验的实验流程，具体构建去除高丰度snoRNA的测序文库，包括以下步骤：

(1)连接3’接头：从样品中提取染色质总RNA后，取100ng总RNA溶于5μL无核糖核酸酶的水中，以65℃处理5min，然后放冰上3min；再加入以下试剂：

2μL T4 RNA连接缓冲液，

2μL三磷酸腺苷(10mmol/L)，

8μL 50％聚乙二醇8000，

1.5μL 3’接头(10mmol/L)，该3’接头的核苷酸序列为：5’-rApp/NNNNGTAGCCTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3’(SEQ ID NO.1)，其中N为随机碱基；

0.5μL核糖核酸酶抑制剂，

1μL T4 RNA连接酶1(M0351L，NEB)，

混匀后，25℃孵育2h，实现RNA连接3’接头的处理。

(2)RNA的片段化

在连接有3’接头的RNA中加入5μL 5倍片段化缓冲液(250mM Tris-HCl；pH 8.3；30mM MgCl₂，375mM KCl)，混匀后，94℃反应7min。

(3)纯化和去除多余的3’接头

a.步骤(2)反应完成后，继续加入加入52μL补充缓冲液(1.538mol/L NaCl；5.77％PEG8000)，53μL纯化磁珠和70μL异丙醇，快速混匀；

b.静置5min，然后放磁力架上5min，吸去上清，加入180μL 75％乙醇，30s后吸出，再加入180μL 75％乙醇，30s后吸出；

c.彻底吸掉残留液，风干3-5min，用25μL无核糖核酸酶的水洗脱RNA。

d.重复一次a-c步骤，最后将RNA溶于17.5μL无核糖核酸酶的水中。

(4)T4多聚核苷酸激酶反应修饰RNA的5’末端

a.往17.5μL RNA样品中加入2.5μL 10X T4多聚核苷酸激酶缓冲液，2.5μL三磷酸腺苷(10mmol/L)，0.5μL核糖核酸酶抑制剂，2μL T4多聚核苷酸激酶(M0201L，NEB)，混匀，37℃孵育30min。

b.用纯化磁珠回收RNA，采用步骤(3)中a-c步骤进行一次纯化，最后将RNA溶于5μL无核糖核酸酶的水。

(5)连接5’接头：

在5μL RNA样品中加入以下试剂：

2μL 10倍T4 RNA连接酶缓冲液，

2μL三磷酸腺苷(10mmol/L)，

8μL 50％聚乙二醇8000，

1.5μL 5’接头(10mmol/L)，该5’接头的核苷酸序列为：5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN-3’(SEQ ID NO.2)，其中N为随机碱基；

0.5μL核糖核酸酶抑制剂，

1μL T4 RNA连接酶1(M0204L，NEB)，

混匀后，25℃孵育2小时。

(6)纯化和去除多余的5’接头:

继续按照步骤(3)中a-c步骤纯化一次RNA，最后将RNA溶于11μL无核糖核酸酶的水中。

(7)去除snoRNA

a.在RNA样品中加入2.5μL snoRNA探针(部分探针序列如SEQ ID NO.3-SEQ IDNO.32所示，浓度为245ng/μL)、0.6μL氯化钠溶液(5mol/L)和1.5μL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(1mol/L，pH7.5)；混匀后，于95℃反应2min，然后每秒钟降0.1℃，降至50℃后，孵育5min。

b.继续加入1.8μL无核糖核酸酶的水、0.2μL氯化镁溶液(1mol/L)和15单位的杂交种耐热核糖核酸酶H(Lucigen，H39500)，50℃孵育30min。

c.然后用磁珠纯化，加入24μL纯化磁珠和44μL异丙醇进行纯化，快速混匀，静置5min，然后放磁力架上5min，吸去上清，加入180μL 75％乙醇，30s后吸出，再加入180μL75％乙醇，30s后吸出，彻底吸掉残留液，风干3-5min，用12μL无核糖核酸酶的水洗脱RNA。

(8)反转录

往12μL RNA样品中加入以下试剂：

1μL脱氧核糖核苷三磷酸混合液，

2.5μL反转录引物(10μmol/L)，该反转录引物的核苷酸序列为：5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(SEQ ID NO.33)。

混匀后，55℃孵育5min；接着加入以下试剂：

3μL二硫苏糖醇(0.1mol/L)，

5μL 5倍反转录缓冲液，

0.5μL核糖核酸酶抑制剂，

1μL反转录酶III(Invitrogen，18080044)；

混匀后，48℃孵育50min，然后85℃失活5min，得到反转录产物cDNA。

(9)纯化和PCR扩增cDNA文库

a.磁珠纯化:取25μL cDNA样品，加入20μL纯化磁珠，45μL异丙醇，快速混匀，静置5min；然后放磁力架上5min，吸去上清，加入180μL 75％乙醇，30s后吸出，再加入180μL75％乙醇，30s后吸出，彻底吸掉残留液，风干3-5min，用16.25μL无核糖核酸酶的水洗脱。

b.PCR扩增cDNA文库:

在16.25μL cDNA样品中加入以下试剂：

1μL PCR扩增引物，所用PCR扩增引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’(SEQID NO.34)；

下游引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(SEQ ID NO.35)；

5μL 5倍高保真缓冲液，

1μL脱氧核糖核苷三磷酸(10μmol/L)，

0.75μL高保真复制酶(KAPA Biosystems，KE2502)，

混匀，总共25μL；

PCR循环的反应条件如下:

95℃预变性3min；

(98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s)运行16-21循环；

72℃延伸60s。

(10)cDNA回收

将扩增后的cDNA产物用6-8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶回收，切割范围为150–230碱基大小的凝胶。用1mL枪头研碎胶，用1-2倍胶体积的DNA胶溶解缓冲液(300mM NaCl和1mMEDTA)浸泡摇晃过夜。然后上清过0.22μm离心柱(sigma)，用上清三倍体积的无水乙醇、1μg蓝色乙二醇和上清1/10体积的醋酸钠(3mol/L)混匀沉淀，放-80℃两小时或过夜。12000g，4℃离心15min；吸去上清，加入1mL 75％冰冻的乙醇，12000g，4℃离心5min，再用75％乙醇洗一次，最后风干5min，加入15μL水溶解cDNA，即制得去除高丰度snoRNA的测序文库。

本实施例以去除染色质RNA中的snoRNA为例，构建一种去除高丰度snoRNA的RNA测序文库。由于染色质RNA中不仅包含了Pol II转录出来的低丰度新生链RNA，还包含了大量高丰度的snoRNA，科研人员为了研究基因转录的实时动态变化过程，往往只需要检测新生链RNA，然而高丰度的snoRNA被克隆到新生链RNA文库后，将占有很高的比例，不仅影响新生链RNA测序质量，还需要多花费十几倍的测序成本。

因此，在构建染色质新生链RNA文库的时候，如何有效去除这些snoRNA是一个很大的难题。在动物细胞研究中，有研究人员用生物素标记DNA寡核苷酸与20个最高丰度的成熟RNA的3’端互补，通过核酸杂交用链霉亲和素偶联磁珠去除这些snoRNA单链cDNA文库序列。然而设计这种生物素标记的单链DNA寡核苷酸的成本较高，一个生物素修饰的引物需要约500元，而植物细胞的染色质中含有大量的snoRNA，初步研究结果发现拟南芥染色质RNA中有约300个snoRNA，如果用该方法去除snoRNA，将要花费较高的成本，仅这一实验成本就需要花费五万至十五万的经费，因此，这会极大限制染色质新生链RNA测序技术的应用。

若采用本实施例中的技术方案去除snoRNA，将大大降低实验成本和测序成本。经计算，为去除高丰度的snoRNA，设计和合成引物探针的成本在2000-5000元之间，并且可使用近200次，即每次实验的成本为10-25元，极大降低了实验成本。

SEQUENCE LISTING

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<400> 30

acatgtaagg gcttttgaat gc 22

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aaaattggtg gtccagctgg 20

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aactcagaga atgcttatgt agcttat 27

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gccttggcac ccgagaattc ca 22

<210> 34

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga 50

<210> 35

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

caagcagaag acggcatacg agagtgactg gagttccttg gcacccgaga attcca 56

Claims (8)

1.一种去除高丰度RNA的测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取样品中的总RNA，将所有RNA连接3’接头；所述3’接头的核苷酸序列为：5’-rApp/NNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/-3’（SEQ ID NO.1）；

（2）将连接有3’接头的RNA进行片段化处理；

（3）将片段化处理后的RNA连接5’接头；所述5’接头的核苷酸序列为：

5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN-3’（SEQ ID NO.2）；

（4）设计DNA探针，并与高丰度RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂交链；部分探针序列如SEQID NO .3-SEQ ID NO .32所示；

（5）用RNaseH切割DNA：RNA杂交链，使高丰度RNA断开与3’接头的连接；

（6）经反转录和PCR扩增，得到去除高丰度RNA的测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述片段化处理的方法为碱水解。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中连接5’接头前，采用T4多聚核苷酸激酶对片段化后的RNA的5’末端进行磷酸化修饰，以便发生连接反应。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中DNA探针的长度为20-30nt。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（6）中反转录所用引物的核苷酸序列为：

5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（SEQ ID NO.33）。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（6）中PCR扩增所用引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’（SEQ IDNO.34）；

下游引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’（SEQ ID NO.35）。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）连接3’接头后和/或步骤（3）连接5’接头后，进行RNA纯化并去除多余接头。

8.一种去除高丰度RNA的测序文库，其特征在于，由权利要求1-7中任一项所述的构建方法制得。