JP2011500092A - 非ランダムプライマーを用いたcDNA合成の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的核酸分子を選択的に増幅する方法および標的核酸分子の増幅をプライムするのに有用なオリゴヌクレオチドに関する。
遺伝子発現解析では、出発核酸分子の増幅を伴うことが多い。核酸分子の増幅は逆転写(RT)、インビトロ転写(IVT)またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、単独でまたはこれらの組み合わせで達成されうる。出発核酸分子は、mRNA分子であってよく、これは、相補的cDNA分子をまず初めに合成し、次いで第一のcDNA分子に相補的な第二のcDNA分子を合成し、これによって二本鎖cDNA分子を作出することにより増幅される。第一鎖cDNAの合成は通例、逆転写酵素を用いて達成され、第二鎖cDNAの合成は通例、DNAポリメラーゼを用いて達成される。二本鎖cDNA分子を用いてRNAポリメラーゼにより相補的RNA分子を作製し、オリジナルの出発mRNA分子の増幅をもたらすことができる。RNAポリメラーゼは、RNA合成の開始を指令するためにプロモーター配列を必要とする。相補的RNA分子は例えば、さらなる相補的DNA分子を作製するための鋳型として使用されうる。あるいは、二本鎖cDNA分子は、例えば、PCRによって増幅されてもよく、増幅されたPCR産物は、シーケンシング用の鋳型としてまたはマイクロアレイ解析で使用されてもよい。
一つの局面において、本発明は、核酸分子のより大きな非標的集団内の核酸分子の標的集団(例えば、最も高度に発現されるRNA種を除く、ある細胞型で発現される全てのRNA分子)を選択的に増幅するための方法を提供する。本発明のこの局面の各方法は、(a) 逆転写酵素およびオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団を用いて哺乳類被験体から単離されたサンプル中のRNA鋳型分子の集団から合成される一本鎖プライマー伸長産物の集団を提供する段階であって、ここでオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団中の各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ部分、およびハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分を含み、ここでRNA鋳型分子の集団が核酸分子の標的集団および核酸分子の非標的集団を含む段階; (b) DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団を用いて段階(a)による一本鎖プライマー伸長産物の集団から二本鎖cDNAを合成する段階であって、ここでオリゴヌクレオチドの第二の集団中の各オリゴヌクレオチドが、6、7または8ヌクレオチドのうちの一つからなるハイブリダイズ部分と、ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列とを含み、ここでハイブリダイズ部分が、規定の条件の下で、合成された一本鎖cDNA中の核酸分子の非標的集団とハイブリダイズしない、6、7または8ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択される段階を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの第一の集団中の各オリゴヌクレオチドは、ランダムなハイブリダイズ部分およびハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列を含む。
本明細書において具体的に定義されていなければ、本明細書において用いられる全ての用語は、本発明の分野における当業者に対するのと同じ意味を有する。当技術分野の定義および用語に関しては、当業者は、特に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York; およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York, 1999を参照されたい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの第一の集団は、6ヌクレオチドまたは7ヌクレオチドまたは8ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの第一の集団は、6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチド、または7ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチド、または8ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドのみを含みうる。任意で、オリゴヌクレオチドの第一の集団は、6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチド、または7ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチド、または8ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドに加えて、他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。通例、オリゴヌクレオチドの第一の集団の各成員は、30ヌクレオチド長以下である。
6ヌクレオチドの長さを有する4,096種の可能なオリゴヌクレオチド、7ヌクレオチドの長さを有する16,384種の可能なオリゴヌクレオチド、および8ヌクレオチドの長さを有する65,536種の可能なオリゴヌクレオチドが存在する。オリゴヌクレオチドの集団を構成するオリゴヌクレオチドの配列は、Microsoft Word (登録商標)などのコンピュータプログラムによって容易に作出することができる。
第一のオリゴヌクレオチドの亜集団は、第一のオリゴヌクレオチドの亜集団の成員が規定の条件の下で標的核酸の集団とハイブリダイズするが、同一の規定の条件の下で非標的集団とハイブリダイズしない能力に基づき、オリゴヌクレオチドの集団から選択される。増幅されるサンプルは、(例えば、逆転写を用いて)増幅されるべき標的核酸分子(例えば、RNAまたはDNA分子)を含み、増幅されるべきでない非標的核酸分子も含む。第一のオリゴヌクレオチドの亜集団は、それぞれが、規定の条件の下で、増幅されるべき核酸分子の集団全体に分布している標的配列とハイブリダイズするが、同一の規定の条件の下で、増幅されるべきでない非標的核酸分子のほとんど(またはいずれも)とハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドから構成される。第一のオリゴヌクレオチドの亜集団は、規定の条件の下で、意図的に回避されたもの(非標的配列)以外の標的核酸配列とハイブリダイズする。
第一のオリゴヌクレオチドの選択された亜集団(例えば、SEQ ID NO:1〜749)を用いて、RNA分子の標的集団の逆転写をプライムし、第一鎖cDNAを作出することができる。あるいは、各オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの選択された亜集団の成員の配列を含み、さらなる規定の核酸配列も含む、第一のオリゴヌクレオチドの集団をプライマーとして用いることもできる。さらなる規定の核酸配列は、通例、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団の成員の配列の5'側に位置している。通例、オリゴヌクレオチドの集団は、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団の全成員の配列を含む(例えば、オリゴヌクレオチドの集団は、SEQ ID NO:1〜749に記載の配列の全てを含むことができる)。
オリゴヌクレオチドの第二の集団の選択過程は、オリゴヌクレオチドの第一の集団の選択で上述した過程と似ているが、異なるのは、6ヌクレオチド、7ヌクレオチドまたは8ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分が、規定の条件の下で標的RNAから逆転写された第一鎖cDNAとハイブリダイズするように、かつ規定の条件の下で非標的RNAから逆転写された第一鎖cDNAとハイブリダイズしないように選択されるという点である。オリゴヌクレオチドの第二の集団は、上述の方法を用いて、例えば、公的に入手可能なリボソームRNA配列を用いて選択することができる。オリゴヌクレオチドの第二の集団は、オリゴヌクレオチドの第一の集団の逆相補体(抗NSR)として作出することもできる。
第二のオリゴヌクレオチドの選択された亜集団(例えば、SEQ ID NO:750〜1498)を用いて、標的集団である第一鎖cDNA分子の第二鎖cDNA合成をプライムすることができる。あるいは、各オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの選択された亜集団の成員の配列を含み、さらなる規定の核酸配列も含む、第二のオリゴヌクレオチドの集団をプライマーとして用いることもできる。さらなる規定の核酸配列は、通例、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団の成員の配列の5'側に位置している。通例、オリゴヌクレオチドの集団は、オリゴヌクレオチドの選択された亜集団の全成員の配列を含む(例えば、オリゴヌクレオチドの集団は、SEQ ID NO:750〜1498に記載の配列の全てを含むことができる)。
本発明の実践において、第一のオリゴヌクレオチドの集団は、オリゴヌクレオチドの集団の成員が、規定の条件の下で標的核酸集団とハイブリダイズするが、同一の規定の条件の下で非標的核酸集団とハイブリダイズしない能力に基づき、オリゴヌクレオチドの集団から選択される。規定のハイブリダイゼーション条件は、第一のオリゴヌクレオチドが、リボソームRNAを除く、サンプル中に存在する全ての核酸分子と特異的にハイブリダイズすることを許容する。通例、ハイブリダイゼーション条件は、未変性二重鎖の融解温度(Tm)より25℃から30℃(例えば、10℃)低い。約100塩基を超える核酸分子に対するTmは、式Tm = 81.5 + 0.41%(G+C) - log(Na+)によって計算することができ、式中、(G+C)は、核酸分子のグアノシンおよびシトシン含量である。長さが100塩基未満のオリゴヌクレオチド分子の場合、例示的なハイブリダイゼーション条件は、Tmより5℃から10℃低い。平均して、短いオリゴヌクレオチド二重鎖のTmは、およそ(500/オリゴヌクレオチド長)℃だけ低下する。本発明のいくつかの態様において、ハイブリダイゼーション温度は、40℃から50℃の範囲内である。適切なハイブリダイゼーション条件は、必要以上の実験操作を行うことなく経験的に特定することもできる。
本発明の実践において、標的核酸集団の第一亜集団の増幅は、規定の増幅条件の下で行われる。ハイブリダイゼーション条件は、前記のように選択することができる。通例、規定の増幅条件には、逆転写酵素を用いた第一鎖cDNA合成が含まれる。逆転写反応は、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の規定の濃度の存在下で行われる。いくつかの態様において、dNTP濃度は、参照により本明細書に組み入れられる、2006年10月27日付で出願された同時係属中の米国特許出願第11/589,322号に記述されているように、増幅された産物を標的遺伝子に関して濃縮するために、約1000から約2000 μMの範囲内である。
本発明の実践において有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、所望の反応をプライムできる限りにおいて、DNA、RNA、PNA、キメラ混合物、またはこれらの誘導体もしくは修飾型とすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格の位置で修飾されてもよく、所望の増幅反応を依然としてプライムできる限りにおいて、他の付加基または標識を含んでもよい。
第二のDNA分子の合成は、図1Dに示されているように、第一のDNA分子が第二のDNA分子とハイブリダイズされる二本鎖DNA分子の集団を与える。通例、二本鎖DNA分子は、第二のプライマーの全てまたは実質的に全て(すなわち、通例、99%超)など、50塩基対よりも短い実質的に全ての核酸分子を除去するために精製される。好ましくは、精製方法は、実質的に二本鎖であるDNA分子を選択的に精製し、一本鎖プライマーなどの、対を形成していない実質的に全ての一本鎖核酸分子を除去する。精製はサイズ分画カラムを通じた溶出によってなど、当技術分野で認められた任意の手段によって達成することができる。次いで、精製された第二のDNA分子を、例えば、沈殿させ、本発明のこの局面の方法の次の段階に適した緩衝液に再溶解させることができる。
本発明のこの局面の方法の実践において、二本鎖DNA分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて酵素的に増幅される鋳型として利用される。ポリメラーゼ連鎖反応をプライムするために、任意の適当なプライマーを用いることができる。通例、二つのプライマーが使用され、一方のプライマーは第一のプライマー配列の規定の部分と(またはその相補鎖と)ハイブリダイズし、他方のプライマーは第二のプライマー配列の規定の部分と(またはその相補鎖と)ハイブリダイズする。
一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応中の増幅サイクルの数が多くなるほど、得られる増幅されたDNAの量は多くなる。他方で、増幅サイクルが多すぎると、二本鎖DNAのランダムに偏った増幅がもたらされる可能性がある。したがって、いくつかの態様において、増幅サイクルの望ましい数は、5から35などの、5から40増幅サイクルの間、例えば10から30増幅サイクルなどである。
DNAチップをスクリーニングするために使われるプローブなどの、ハイブリダイゼーション実験におけるプローブとしての使用を容易にするために、増幅されたDNA分子は、任意で、色素分子により標識されてもよい。蛍光発光体および化学発光体などの、任意の適当な色素分子を利用することができる。増幅されたDNA分子に色素分子を付着させるための例示的な方法は、実施例5に示されている。
本実施例では、哺乳類細胞で発現される全てのまたは実質的に全てのRNA分子とハイブリダイズするが、核リボソームRNA (18Sおよび28S rRNA)またはミトコンドリアリボソームRNA (12Sおよび16S mt-rRNA)とハイブリダイズしない、749種の6merオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:1〜749)の第一の集団(Not-So-Random、「NSR」)の選択について記述する。NSRオリゴの逆相補体である抗NSRオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:750〜1498)の第二の集団も作出した。NSRオリゴの集団は第一鎖cDNA合成をプライムするために用いることができ、抗NSRオリゴの集団は第二鎖cDNA合成をプライムするために用いることができる。
図1Aに示されるように、ランダムな6mer (N6)はRefSeqデータベース由来の(「ヌクレオチド配列」として表した)転写物配列のすべてのヌクレオチド位置でアニールすることができる。逆相補体が核リボソームRNA (18Sおよび28S rRNA)ならびにミトコンドリアリボソームRNA (12Sおよび16S mt-rRNA)に完全に一致する6merを差し引いた後、残りのNSRオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:1〜749)は、図1Bに示されるように、RefSeqデータベース内の(「ヌクレオチド配列」として表した)核酸配列の4〜5ヌクレオチドごとに完全な一致を示す。
各ヌクレオチドがA、T (もしくはU)、CまたはGである、全4,096種の可能な6merオリゴヌクレオチドをコンピュータ処理した。下記表1に示すように、各6merオリゴヌクレオチドの逆相補体を、18Sおよび28S rRNAのヌクレオチド配列と比較し、12Sおよび16SミトコンドリアrRNAのヌクレオチド配列と比較した。
ヒト以外の哺乳類(例えば、ラット、マウス)細胞の遺伝子プロファイリングのため、各哺乳類種から18Sおよび28Sに対応する遺伝子のリボソーム核rRNAを差し引くことにより、ならびに12Sおよび16Sに対応する遺伝子のリボソームミトコンドリアrRNAを差し引くことにより、類似の手法を行うことができる。
本実施例は、NSRプライマーおよび抗NSRプライマーを用いた全RNAの増幅によって、望ましくない、非標的リボソーム配列のプライミングが選択的に低減されることを示す。
新たなプライマーライブラリーを構築するため、プライマーを以下のように個別に合成した。
いくつかの態様において、第一鎖cDNA合成で用いるNSRプライマー(SEQ ID NO:1〜749)の第一のプライマーセットは、以下の5'プライマー結合配列:
5'末端に共有結合的に付着された(別名「尾状の」) PBS#1: 5' TCCGATCTCT 3' (SEQ ID NO:1499)
をさらに含み、
以下の構成:
5' PBS#1 (SEQ ID NO:1499) + NSR-6mer (SEQ ID NO:1〜749) 3'
を有するオリゴヌクレオチドの集団をもたらす。
5' PBS#1 (SEQ ID NO:1499) + (N1〜10) + NSR-6mer (SEQ ID NO:1〜749) 3'。
いくつかの態様において、第二鎖cDNA合成で用いる抗NSR-6merプライマー(SEQ ID NO:750〜1498)の集団は、以下の5'プライマー結合配列:
抗NSR-6merプライマーの5'末端に共有結合的に付着された(別名「尾状の」) PBS#2: 5' TCCGATCTGA 3'(SEQ ID NO:1500)、
をさらに含み、
以下の構成:
5' PBS#2 (SEQ ID NO:1500) + 抗NSR-6mer (SEQ ID NO:750〜1498) 3'
をもたらす。
5' PBS#2 (SEQ ID NO:1500) + (N1〜10) + 抗NSR-6mer (SEQ ID NO:750〜1498) 3'。
PBS#1 (SEQ ID NO:1499)で尾部付けしたNSR-6merおよびPBS#2 (SEQ ID NO:1500)で尾部付けした抗NSR-6merを用いて作出された二本鎖cDNAを増幅するために、以下のフォワードおよびリバースプライマーを合成した。
NSR_F_SEQプライマー1:
ここで各N = G、A、CまたはT。
NSR_R_SEQプライマー1:
ここで各N = G、A、CまたはT。
ランダムプライマーのプールで増幅された対照反応物を増幅するために、以下のプライマーを用いた。
Y4R-N7 (第1鎖cDNA):
[ここでN = A、G、CまたはT]
Y4R-NSR (第1鎖cDNA):
グロビン(αまたはβ)に対する完全な一致なし、rRNA (18S、28S)に対する完全な一致なしの6-mer NSRオリゴのコアセットを含むNSRプライマーに共有結合的に付着された
Y4F-N9 (第2鎖cDNA合成):
[ここでN = A、G、CまたはT]
。
プライマーを上記のように個別に合成し、以下の構成でプールし、次いでプライマープールを用いて、下記のように全RNAから増幅された核酸のライブラリーを作出した。
PM = プライマーの最も3'側の6ntで完全な一致
R = rRNA (18Sまたは28S)
M = mt-rRNA (12Sまたは16S)
G = グロビン(HBA1、HBA2、HBB、HBD、HBG1、HBG2)
プロトコルには次のように3段階の増幅手法が含まれた: (1) 第一のプライマー結合部位(PBS#1)を含むNSRプライマーでプライムされる逆転写によってRNAから第一鎖cDNAを作出し、NSRプライム第一鎖cDNAを作出した; (2) 第二のプライマー結合部位(PBS#2)を含む抗NSRプライマーで第二鎖cDNA合成をプライムした; かつ(3) 合成されたcDNAを、第一および第二のプライマー結合部位に結合するフォワードおよびリバースプライマーを用いてPCR増幅し、増幅DNA (aDNA)を作出した。
細胞株Jurkat (Tリンパ球、ATCC番号TIB-152)およびK562 (慢性骨髄性白血病、ATCC番号CCL-243)の場合、Ambion, Inc. (Austin, Texas)から全RNAを入手した。
第一鎖逆転写を以下のように行った。
・1 μg/μlのJurkat全RNA鋳型(Ambion, Inc. (Austin, Texas)から入手した) 1 μl
・100 μMのNSRプライマープール原液(表2に記述したように) 2 μl
・最終容量を10 μlとするためにH2O 7 μl。
・5×First Strand Buffer (250 mM Tris-HCL, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 4 μl
・25 mM dNTP (高) 1.6 μlまたは10 mM dNTP (低) 1.0 μl
・H2O 1 μl
・0.1 M DTT 1 μl
・RNAse OUT (Invitrogen) 1 μl
・MMLV逆転写酵素(200単位/μl) (SuperScript III(商標) (SSIII), Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) 1 μl。
第二鎖合成カクテルを以下のように調製した:
・10×Klenow緩衝液10 μl
・抗NSRプライマー(100 μM) 4 μl
・10 mM dNTP 5.0 μl
・H2O 56.7 μl
・Klenow酵素(5 U/μl) 0.33 μl
得られた二本鎖cDNAを、Ambion (Message Amp(商標) II aRNA Amplification Kit, Ambion Cat #AM1751)から入手したSpin Cartridgeおよびキット中に供給されている緩衝液により、製造元の指示書にしたがって精製した。全容量30 μlをカラムから溶出し、このうち20 μlを以後のPCRに用いた。
精製されたcDNA鋳型(5分の1希釈した) 1 μlに以下の混合液を添加した:
・5×Roche Expand Plus PCR Buffer 10 μl
・10 mM dNTPS 2.5 μl
・フォワードPCRプライマー(10 μM原液) (SEQ ID NO:1501) 2.5 μl
・リバースPCRプライマー(10 μM原液) (SEQ ID NO:1502) 2.5 μl
・Taq DNAポリメラーゼ酵素0.5 μl
・H2O 27 μl
・25 mM MgCl2 4 μl。
PCRプログラム#1:
94℃、2分間
94℃、10秒間
以下を8サイクル:
・60℃、10秒間
・72℃、60秒間
・72℃、60秒間
・94℃、15秒間
以下を17サイクル:
・60℃、30秒間
・72℃、60秒間 + 10秒/サイクル
仕上げのために72℃、5分間、それから4℃で冷却した。
94℃、2分間
94℃、10秒間
以下を2サイクル:
・40℃、10秒間
・72℃、60秒間
・72℃、60秒間
・94℃、10秒間
以下を8サイクル:
・60℃、30秒間
・72℃、60秒間
・72℃、60秒間
・94℃、15秒間
以下を15サイクル:
・60℃、30秒間
・72℃、60秒間 + 10秒/サイクル
仕上げのために72℃、5分間、それから4℃で冷却した。
結果を(1) 増幅されたDNA「aDNA」収量の測定; (2) cDNA中の種の集団が等しく提示されたことを確認するためのアガロースゲル上でのaDNAのアリコットの評価; および(3) qPCRによる選択したレポーター遺伝子の増幅レベルの測定(実施例3に記述されているように)という点で解析した。
本実施例は、第一鎖cDNA合成用の749種のNSR 6-mer (SEQ ID NO:1〜749) (5'末端に共有結合的に付着されたPBS#1 (SEQ ID NO:1499に加えてNスペーサー)をそれぞれが有する)、その後、749種の抗NSR 6-mer (SEQ ID NO:750〜1498) (5'末端に共有結合的に付着されたPBS#2 (SEQ ID NO:1500に加えてNスペーサー)をそれぞれが有する)によって、全RNAを含有するサンプル中に存在するトランスクリプトームのかなりの部分の増幅がプライムされることを示す。
実施例2に記述のPCR増幅の後、各PCR反応液を、Qiagen MinEluteスピンカラムを用いて精製した。カラムを80%エタノールで洗浄し、溶出用緩衝液20 μLで溶出した。NanoDrop機器を用いUV/VIS分光計で収量を定量化した。次いでサンプルを希釈し、以下のアッセイ法を用いて定量的PCR (qPCR)により特徴付けた。
図3Aはランダムプライマーを用いて作出された非増幅cDNAと比べて(N8 = 100%)、表4に示した各種のNSRプールを用いて作出された第一鎖cDNAの合成に関する18S、28S、12Sおよび16Sの相対存在量(遺伝子およびN8に対して規準化した)を示した対数目盛のヒストグラムプロットである。図3Aに示されるように、第一鎖cDNA合成用のNSR#1 + NSR#3 (mt-rRNAまたはrRNAとハイブリダイズしないNSR-6mer)を含むプライマープールならびに第二鎖合成用のプライマープール抗NSR#5および抗NSR#7を用いて作出されたcDNAは、ランダムな8-merで作出されたcDNAと比べてrRNAの存在量の大幅な減少(0.086% 18S; 0.673% 28S)ならびにmt-rRNAの存在量の減少(1.807% 12S; および8.512% 16S)を示した。
これらの結果は、NSR #1+#3プライマープール(SEQ ID NO:1〜749)および抗NSRプライマープール(SEQ ID NO:750〜1498)が、それぞれ、第一鎖および第二鎖cDNA合成のために驚くべき効果を発揮し、不要なrRNAおよびmt-rRNAが低レベル(10%未満)のままで、標的遺伝子(ポリアデニル化および非ポリアデニル化RNAを含む)が実質的に濃縮されている二本鎖cDNA産物をもたらすことを実証している。
本実施例は、第一鎖cDNA合成用の749種のNSR-6mer (SEQ ID NO:1〜749) (スペーサーNおよび5'末端に共有結合的に付着されたPBS#1 (SEQ ID NO:1499)をそれぞれが有する)の使用、ならびに749種の抗NSR-6mer (SEQ ID NO:750〜1498) (スペーサーNおよび5'末端に共有結合的に付着されたPBS#2 (SEQ ID NO:1500)をそれぞれが有する)の使用により、増幅されたcDNAの配列解析によって判定した場合に、トランスクリプトーム(ポリA+およびポリA-の両方)のかなりの部分の増幅がプライムされ、全RNA中に存在する不要な非標的配列ではプライムされないことを示す。
実施例2に記述されている方法により、表8に示した各種のプライマープールとともに、第一鎖cDNA合成用の749種のNSR-6mer (SEQ ID NO:1〜749) (スペーサーNおよび5'末端に共有結合的に付着されたPBS#1 (SEQ ID NO:1499)をそれぞれが有する)を用い、749種の抗NSR-6mer (SEQ ID NO:750〜1498) (スペーサーNおよび5'末端に共有結合的に付着されたPBS#2 (SEQ ID NO:1500)をそれぞれが有する)を用いて、cDNAを作出した。
表9は、表8に示した各種のプライマープールを用いて合成されたcDNAから作出されたPCR産物の配列解析の結果を示す。
1 = 公開データベースとの配列アライメントによって判定した場合にエキソン、イントロンおよびUTR領域を含め任意の公知遺伝子またはmRNAと重複することを測定した。
2 = 公開データベースとの配列アライメントによって判定した場合に遺伝子間領域とのアライメントまたは反復要素と重複することを測定した。
これらの結果は、実施例2に記述されるようにNSR 6-mer (SEQ ID NO:1〜749)、および抗NSR6-mer (SEQ ID NO:750〜1498)を用いて作出された二本鎖cDNA鋳型から増幅されたaDNA (PCR産物)が核リボソームRNAおよびミトコンドリアリボソームRNAと比べて標的遺伝子の濃縮を維持したことを実証する。
本実施例は、遺伝子発現モニタリングの用途で引き続き用いるためaDNA (PCR産物)を標識するのに有用である方法について記述する。
Cy3 およびCy5直接標識キットをMirus (Madison, Wisconsin, キットMIR製品番号3625および3725)から入手した。
四つのaDNAサンプルを上記のように標識し、蛍光を測定した。0.9〜1.5%の範囲の標識保持が全四つの標識aDNAサンプルにおいて認められた(言い換えれば0.9〜1.5%の標識化効率といえる)。これらの結果は、aaUTP標識され、インビトロ翻訳され、増幅されたRNAで通例認められる1%〜3%の標識化効率の範囲内にある。
方法:
実施例2に記述されているようにNSRプライマーおよび抗NSRプライマーを用いて作出されたaDNA PCR産物1 μgを、次のようにPCR反応混合液に添加する:
・100〜1000 μMのaadUTP+dCTP+cATP+dGTP+dUTP (aadUTP〜dUTPの最適バランスは日常の実験操作を用いて経験的に判定することができる)
・4 mM MgCl2
・400〜1000 nMのフォワードプライマーのみまたはリバースプライマーのみ、しかし両方ともにではない。
5〜20サイクルのPCR (94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒)。その間に二本鎖PCR鋳型の片鎖のみが合成される。PCRの各サイクルはaa標識された一本鎖aDNAの一コピーをもたらすものと予想される。次いでこのPCR産物を精製し、Cy3またはCy5標識を標準的な化学的カップリングによって取り込む。
方法:
実施例11に記述されているようにNSR7プライマープールを用いて作出されたaDNA PCR産物1 μgを、次のようにPCR反応混合液に添加する:
・100〜1000 μMのaadUTP+dCTP+cATP+dGTP+dUTP (aadUTP〜dUTPの最適バランスは日常的な実験操作を用いて経験的に判定することができる)
・4 mM MgCl2
・400〜1000 nMのフォワードおよびリバースプライマー(例えば、フォワード: SEQ ID NO:1501; またはリバース: SEQ ID NO:1502)。
5〜20サイクルのPCR (94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒)。その間に二本鎖PCR鋳型の両鎖が合成される。次いで二本鎖の、aa標識aDNA PCR産物を精製し、Cy3またはCy5標識を標準的な化学的カップリングによって取り込む。
本実施例は、遺伝子発現解析用の一本鎖DNA分子を作出するのに有用な増幅された核酸鋳型を作出するための、NSR-6merに共有結合的に連結されたハイブリッドRNA/DNAプライマーの使用について記述する。
本発明の選択的増幅方法の一つの態様において、第一鎖cDNA合成のための第一のオリゴヌクレオチド集団の規定の配列部分(例えば、PBS#1)、および/または第二鎖cDNA合成のための第二のオリゴヌクレオチド集団の規定の配列部分(例えば、PBS#2)は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,946,251号に記述されているように、鎖置換を用いてDNA産物の複数コピーを作出するのに適した、増幅された核酸鋳型を作出するためのRNA部分を含む。ハイブリッドNSRプライマー(PBS#1(RNA/DNA)/NSR)を用いて第一鎖cDNAを合成し、それによって、鋳型RNAに相補的な配列を有する一本鎖DNAの合成用の鋳型として用いるのに適した産物を作出することができる。あるいは、以下でさらに詳細に記述するように、RNA/DNAハイブリッドプライマー尾部を第二鎖合成後に付加することもできる。
1. 第一鎖cDNA合成のためのRNA:DNAハイブリッドNSR
いくつかの態様において、第一鎖cDNA合成で用いるNSRプライマー(SEQ ID NO:1〜749)の集団は、ハイブリッドPBS#1などの、5'プライマー結合配列(RNA)をさらに含むことができる:
NSRプライマーの5'末端に共有結合的に付着されたハイブリッドPBS#1 (RNA)
。
5'ハイブリッドPBS#1 (RNA) (SEQ ID NO:1557) + NSR6-mer (DNA) (SEQ ID NO:1〜749) 3'。
5'ハイブリッドPBS#1 (RNA) (SEQ ID NO:1557) + (N1〜10) (DNA) + NSR6-mer (SEQ ID NO:1〜749) (DNA) 3'。
(ここで、プライマーの5'部分が第一鎖cDNA上の所定の配列とハイブリダイズする少なくとも11個のRNAヌクレオチド(下線を引いた)からなり、3'部分が少なくとも3個のDNAヌクレオチドからなる)を添加することによって作出することができる。
本実施例は、NSRプライマーを用いて全RNAから増幅されたcDNA中のポリA+およびポリA-転写物の堅固な検出について記述する。
トランスクリプトーム全体、すなわち、所与の瞬間に細胞および組織内に存在するRNA分子の一群全体は、RNAが収集された瞬間の、サンプルの生物学的状態に関する豊富な痕跡を保有している。しかしながら、全RNAに関する生化学的な現実は、そのうちの圧倒的多数が、細胞活動に関する情報を相対的にほとんど与えない細胞質リボソームおよびミトコンドリアリボソームの構造サブユニットをコードしているということである。その結果、大規模の転写研究のために、非リボソームRNAに対する親和性タグとしての3'ポリアデニル化配列の活用などの、より情報量の多い低コピー転写物を濃縮する分子技術が開発されている。ポリA+ RNA転写物の標的化シーケンシングは、現行の遺伝子モデルの基礎となるcDNA断片の豊富な礎になっている(例えばHsu F. et al., Bioinformatics 22:1036-1046 (2006)を参照のこと)。ポリA配列からのcDNA合成のプライミングも、最もよく実践されているゲノム規模のRNAプロファイリング法に使われている。
概観:
上記にしたがって、本発明者らは、リボソームRNA (rRNA)配列に対する完全な一致のある全てのヘキサマーが除去された「not-so-random」(「NSR」)プライミングライブラリーに依るサンプル調製手順を開発した。NSR選択的プライミングが全トランスクリプトーム・プロファイリング技術として有用であるためには、非リボソームRNA転写物を忠実に検出しなければならない。NSRプライミングの性能について調べるため、全トランスクリプトームcDNAライブラリーを構築した。汎用の尾部配列とともに第一鎖合成をプライムして、PCR増幅およびIllumina 1G Genome Analyzerを用いた下流のシーケンシングを容易にするために、アンチセンスNSRヘキサマー(「NSR」プライマー)を合成した。第2鎖合成をプライムするために、NSRプライマーの第一のセットに相補的な、尾部付けしたNSRヘキサマー(「抗NSR」プライマー)の第二のセットを作出した。第一および第二鎖NSRプライマーに用いた固有の尾部配列によって、増幅およびシーケンシングの間の鎖方向の保持が可能になった。本研究の場合、シーケンシングの読み出しは全て、鋳型RNAに対して3'から5'方向に配向されたが、逆鎖の読み出しは、汎用のPCR増幅プライマーを改変することによって容易に得ることができる。
実施例1に記述されているように、(SEQ ID NO:1〜749)のそれぞれに共有結合的に付着されたNSR-6merプライマー5' (SEQ ID NO:1499)の第一の集団を第一鎖の増幅に用い、(SEQ ID NO:750〜1498)のそれぞれに共有結合的に付着された抗NSR-6merプライマー(SEQ ID NO:1500)の第二の集団を第二鎖cDNA合成で用いた。プールする前に、オリゴを脱塩し、100 μMで水に再懸濁した。
概観:
NSRプライミングは、ポリA+およびポリA-転写物を含む非リボソームRNA画分を選択的に捕捉する。二ラウンドのNSRプライミング選択性をライブラリー構築の間に適用した。第一に、NSRオリゴヌクレオチド(アンチセンス)は、not-so-random鋳型部位で逆転写を開始する。RNA鋳型を除去するためのリボヌクレアーゼ処理の後、抗NSRオリゴヌクレオチド(センス)は、not-so-random鋳型部位で一本鎖cDNAにアニールし、Klenowを介した第二鎖合成を指令する。非対照のフォワードおよびリバースプライマーによるPCR増幅は、鎖方向を保持し、下流末端のシーケンシングのための末端部位を付加する。次いで、フォワード増幅プライマーの一部分を用いてcDNA断片の3'末端からアンチセンスタグシーケンシングを行う。次に、ペアワイズアライメントを用いて、ヒトゲノムに対しタグ配列の逆相補体をマッピングする。
全脳由来の全RNAをFirstChoice(登録商標) Human Total RNA Survey Panel (Ambion, Inc.)から入手した。Universal Human Reference (UHR)細胞株RNAをStratagene Corpから購入した。Superscript(商標) III逆転写キット(Invitrogen Corp)を用いて全RNAをcDNAに変換した。3'から5'方向のエキソKlenow断片(New England Biolabs Inc.)により第二鎖合成を行った。Expand High FidelityPLUS PCR System (Roche Diagnostics Corp.)を用いてDNAを増幅した。
TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays (Applied Biosystems)を用いてqPCRにより、個々のrRNAおよびmRNA転写物を定量化した。qPCRアッセイは以下の表10に示した試薬を用いて行った。
NSRプライミングまたはランダム配列による非選択的プライミング対照の、尾状ヘプタマーを用いて全脳の全RNAから作出されたcDNAライブラリーの比較によって、NSRプライムライブラリーにおけるrRNAの有意な枯渇および同時に標的mRNAの濃縮が明らかになった。具体的には、NSRプライマーの設計に用いたコンピュータフィルタに組み込んだrRNA転写物の全4種の存在量で95%を上回る減少が認められた(データ不掲載)。
NSRプライムライブラリーにおけるrRNA枯渇に関する詳細な知見を得るために、Illumina 1G Genome Analyzer (Illumina, Inc.)を用いてNSRプライム(260万個の)およびランダムプライム(380万個の) cDNAライブラリーから36ヌクレオチド・アンチセンスの読み出しとしてタグ配列を作出した。配列タグを特徴付けるために、各読み出しの5'末端のジヌクレオチド・バーコード(CT)を除去し、32 ntのアライメントあたり2つまでのミスマッチを許容するELANDマッピングプログラム(Illumina, Inc.)を用いていくつかの配列データベースに対し塩基番号2〜34の逆相補体を整列させた。
非rRNAゲノム領域に対し整列された5400万を上回る高品質な32ヌクレオチドタグ配列の読み出しは、二つの個別に調製された全脳ライブラリーおよび単一のUHRライブラリーから得た。これらの読み出しのうちの77%が単一のゲノム部位にマッピングされた。RefSeq mRNAデータベース(Pruitt K.D. et al, Nucleic Acids Res. 33:D501-504 (2005))中の22,785種のモデル転写物のうち、検索したサンプルの少なくとも一部において10種またはそれ以上の配列タグの読み出しにより87%超が提示され、全三種のライブラリーにおいて10種またはそれ以上の読み出しにより69%が提示された。
NSRプライミングを用いて作出された全トランスクリプトームcDNA配列の一群を集めて全脳およびUHRに対する包括的発現マップを構築することができる。そのような包括的発現マップを構築するために、全ての非リボソームRNAタグ配列を、下記表14に示した最新のゲノム注釈に基づいて、重複のない六つの分類のうちの一つに割り当てた。
本実施例において実証されるように、NSRプライムcDNAライブラリーに超ハイスループットシーケンシングを適用することで、従来の方法がもたらす情報の範囲を凌ぐ、包括的転写内容に関する不偏性の照合が可能になる。シーケンシングによる転写物の発見では、相当のデータ処理およびその後の実験的検証を要する交差ハイブリダイゼーションによる悪影響を起こしやすい、ゲノムタイリングアレイを用いては達成できない特異性のレベルで情報が得られる(例えばRoyce T. E. et al., Trends Genet 21:466-475 (2005)を参照のこと)。しかし、非常に複雑な全トランスクリプトームライブラリーにおいて希少な転写物の十分な網羅度を得るために必要なサンプリングの難解さから、シーケンシングを行って多数の組織を素早く調査する可能性には限界がある。対照的に、発現プロファイリングマイクロアレイでは、プローブの選択を進めるために質の高い配列情報が存在するなら、多くのサンプルでの転写物レベルの定量的解析が容易とされる。
Claims (52)
- 以下の段階を含む、RNA鋳型分子の集団内の核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法:
(a) 逆転写酵素およびオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団を用いて哺乳類被験体から単離されたサンプル中のRNA鋳型分子の集団から合成される一本鎖プライマー伸長産物の集団を提供する段階であって、オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団中の各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、RNA鋳型分子の集団が、核酸分子の標的集団と核酸分子の非標的集団とを含む、段階; ならびに
(b) DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団を用いて段階(a)による一本鎖プライマー伸長産物の集団から二本鎖cDNAを合成する段階であって、オリゴヌクレオチドの第二の集団中の各オリゴヌクレオチドが、6、7または8ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、規定の条件の下で一本鎖プライマー伸長産物の集団中の核酸分子の標的集団とハイブリダイズし、かつ規定の条件の下で核酸分子の非標的集団とハイブリダイズしない、6、7または8ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択される、段階。 - オリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団のハイブリダイズ部分が、規定の条件の下で一本鎖プライマー伸長産物の集団中の非標的核酸集団とハイブリダイズしない、6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドを含むように選択される、請求項1記載の方法。
- 核酸分子の非標的集団が、RNA鋳型分子の集団中の最も豊富な核酸分子から本質的になる、請求項1記載の方法。
- 最も豊富な核酸分子が、リボソームRNA、ミトコンドリアリボソームRNAおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第一の集団のハイブリダイズ部分が、6、7、8または9個のランダムヌクレオチドのうちの一つからなり、かつ規定の配列部分が、PCR増幅のための第一のプライマー結合部位を含む、請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、規定の条件の下でRNA鋳型分子の集団中の非標的核酸分子とハイブリダイズしない、6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1記載の方法。
- サンプルが全RNAを含む、請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分が、長さが10ヌクレオチドから20ヌクレオチドに及ぶPCR増幅のためのプライマー結合部位からなる、請求項1記載の方法。
- 第一または第二のプライマー結合部位の少なくとも一つが転写プロモーターを含む、請求項8記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第二の集団中の各オリゴヌクレオチドが、1〜10個のランダムヌクレオチドからなるスペーサー配列部分をさらに含み、該スペーサー部分が、規定の配列部分とハイブリダイズ部分との間に位置する、請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第二の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドから選択される、請求項1記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第一の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドから選択される、請求項6記載の方法。
- 二本鎖cDNAの少なくとも一方の鎖を増幅する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
- PCR増幅されたDNAをシーケンシングする段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
- 第一の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分が、第二の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分における少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域と同一である少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域を含む、請求項8記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第一または第二の集団の少なくとも一方の規定の配列部分が、RNA部分およびDNA部分を含み、該RNA部分が、該DNA部分に対して5'側にある、請求項8記載の方法。
- 以下の段階を含む、トランスクリプトーム・プロファイリングの方法:
(a) 逆転写酵素、およびハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する第一のPCRプライマー結合部位とを含むオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団を用いて哺乳類被験体から単離されたサンプル中のRNA鋳型分子の集団内の核酸分子の標的集団から一本鎖プライマー伸長産物の集団を合成する段階;
(b) DNAポリメラーゼ、およびハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する第二のPCRプライマー結合部位とを含むオリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団を用いて段階(a)により作出された一本鎖プライマー伸長産物の集団から二本鎖cDNAを合成する段階であって、該ハイブリダイズ部分が、規定の条件の下で一本鎖プライマー伸長産物の集団中の核酸分子の標的集団とハイブリダイズし、かつ規定の条件の下で核酸分子の非標的集団とハイブリダイズしない、6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択され、核酸分子の非標的集団が、哺乳類被験体と同じ種のリボソームRNAおよびミトコンドリアリボソームRNAから本質的になる、段階; ならびに
(c) 第一のPCRプライマー結合部位に結合する第一のPCRプライマーおよび第二のPCRプライマー結合部位に結合する第二のPCRプライマーを用いて段階(b)により合成された二本鎖cDNAをPCR増幅する段階。 - サンプルを単離した時点での哺乳類被験体のトランスクリプトームを提示するライブラリーを作出するためにベクターにPCR産物をクローニングする段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- PCR産物の少なくとも一部分をシーケンシングする段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- PCR増幅が、40〜50℃のアニーリング温度での少なくとも2サイクルの増幅、続いて50℃を上回るアニーリング温度でのさらなる増幅サイクルを用いて行われる、請求項17記載の方法。
- 増幅されたPCR産物の少なくとも一部分を標識化する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 第一の集団中の各オリゴヌクレオチドの第一のPCRプライマー結合部位が、オリゴヌクレオチドの第二の集団中の各オリゴヌクレオチドの第二のPCRプライマー結合部位における少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域と同一である少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域を含む、請求項17記載の方法。
- オリゴヌクレオチドの第一または第二の集団の少なくとも一方のPCRプライマー結合部位が、RNA部分およびDNA部分を含み、該RNA部分が、該DNA部分に対して5'側にある、請求項17記載の方法。
- 請求項17記載の方法を用いて作出された、増幅された核酸分子の集団。
- 以下の段階を含む、核酸分子のより大きな非標的集団内の核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法:
(a) 逆転写酵素およびオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団を用いて哺乳類被験体から単離された全RNAを含むサンプルから一本鎖cDNAを合成する段階であって、オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団内の各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、段階; ならびに
(b) DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団を用いて段階(a)により合成された一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する段階であって、オリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団内の各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、かつ該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、段階。 - オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、請求項25記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、請求項25記載の方法。
- PCR産物の少なくとも一部分をシーケンシングする段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- PCR産物の少なくとも一部分を標識化する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 第一鎖cDNA合成で用いるSEQ ID NO:1〜749を含む、オリゴヌクレオチドの集団。
- 第二鎖cDNA合成で用いるSEQ ID NO:750〜1498を含む、オリゴヌクレオチドの集団。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であって、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、試薬。
- 核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であって、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、試薬。
- 核酸分子の標的集団の増幅をプライムするためのオリゴヌクレオチドの集団を含む、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であって、各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、試薬。
- 核酸分子の標的集団の増幅をプライムするためのオリゴヌクレオチドの集団を含む、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するための試薬であって、各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、試薬。
- 第一鎖cDNA合成のためのオリゴヌクレオチドの第一の集団を含む試薬を含む、核酸分子の標的集団を選択的に増幅するためのキットであって、オリゴヌクレオチドの第一の集団中の各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、キット。
- オリゴヌクレオチドの第一の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、請求項36記載のキット。
- 第二鎖cDNA合成のためのオリゴヌクレオチドの第二の集団をさらに含むキットであって、オリゴヌクレオチドの第二の集団中の各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、請求項36記載のキット。
- オリゴヌクレオチドの第二の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドを少なくとも10%含む、請求項38記載のキット。
- オリゴヌクレオチドの第一の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:1〜749からなるオリゴヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチドの第二の集団中のハイブリダイズ部分の集団が、SEQ ID NO:750〜1498からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項38記載のキット。
- 以下の成分の少なくとも一つをさらに含む、請求項38記載のキット: 逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、RNase H酵素、Tris緩衝液、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、還元剤、デオキシヌクレオシド三リン酸、またはリボヌクレアーゼ阻害剤。
- 以下を含む、哺乳類被験体から得られたサンプル中のRNA鋳型分子の集団内の核酸分子の標的集団を選択的に増幅するためのキット:
(a) 規定の条件の下でRNA鋳型分子の集団中の核酸分子の非標的集団とハイブリダイズしない6ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのオリゴヌクレオチドから選択される6ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分と、該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含むオリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団であって、核酸分子の非標的集団が、RNA鋳型分子の集団中の最も豊富な核酸分子から本質的になる、オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団;
(b) オリゴヌクレオチドプライマーの第一の集団のハイブリダイズ部分のヌクレオチド配列の逆相補体から選択される6ヌクレオチドからなるハイブリダイズ部分と、該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する規定の配列部分とを含む、オリゴヌクレオチドプライマーの第二の集団;
(c) オリゴヌクレオチドの第一の集団の第一の規定の配列部分に結合する第一のPCRプライマー、およびオリゴヌクレオチドの第二の集団の第二の規定の配列部分に結合する第二のPCRプライマー。 - 核酸分子の非標的集団が、前記哺乳類被験体と同じ種のリボソームRNAおよびミトコンドリアリボソームRNAから本質的になる、請求項42記載のキット。
- オリゴヌクレオチドの第一および第二の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分が、長さが10ヌクレオチドから20ヌクレオチドに及ぶPCR増幅のためのプライマー結合部位からなる、請求項42記載のキット。
- 第一の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分が、第二の集団中の各オリゴヌクレオチドの規定の配列部分における少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域と同一である少なくとも8個の連続したヌクレオチドの領域を含む、請求項42記載のキット。
- オリゴヌクレオチドの第一または第二の集団の少なくとも一方の規定の配列部分が、RNA部分およびDNA部分を含み、該RNA部分が、該DNA部分に対して5'側にある、請求項42記載のキット。
- 以下の段階を含む、増幅されたDNA分子を作出するために核酸分子の標的集団を選択的に増幅する方法:
(a) オリゴヌクレオチドの第一の集団を提供する段階であって、各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する第一のPCRプライマー結合部位とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:1〜749を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、段階;
(b) 哺乳類被験体から単離されたRNAを含むサンプルにオリゴヌクレオチドの第一の集団をアニールする段階;
(c) 逆転写酵素を用いてRNAからcDNAを合成する段階;
(d) DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドの第二の集団を用いて二本鎖cDNAを合成する段階であって、各オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ部分と該ハイブリダイズ部分の5'側に位置する第二のPCR結合部位とを含み、該ハイブリダイズ部分が、SEQ ID NO:750〜1498を含むオリゴヌクレオチドの集団の成員である、段階;
(e) 熱安定性DNAポリメラーゼ、第一のPCRプライマー結合部位に結合する第一のPCRプライマー、および第二のPCRプライマー結合部位に結合する第二のPCRプライマーを用いて二本鎖cDNAをPCR増幅し、増幅された二本鎖DNAを作出する段階; ならびに
(f) 増幅された二本鎖PCR産物をシーケンシングする段階。 - 哺乳類被験体から単離された細胞サンプル中のRNA鋳型分子の集団内の核酸分子の標的集団の提示からなる選択的に増幅された核酸分子の集団であって、増幅された核酸分子がそれぞれ以下を含む、集団:
増幅された核酸配列の集団の成員に隣接した5'側の規定の配列部分および3'側の規定配列であって、選択的に増幅された配列の集団が、哺乳類細胞で発現される標的RNA分子に対応する増幅された核酸配列を含み、かつ特定の哺乳類種に関して(a) 75%を上回るポリアデニル化および非ポリアデニル化転写物を有し、かつ10%未満のリボソームRNAを有する、という特性を有することを特徴とする、5'側の規定の配列部分および3'側の規定配列。 - クローニングベクターに挿入された、請求項48記載の集団。
- 集団中の各核酸分子が標識化される、請求項48記載の集団。
- 基材に付着された、請求項48記載の集団。
- オリゴヌクレオチドの第一または第二の集団の少なくとも一方の規定の配列部分が、RNA部分およびDNA部分を含み、該RNA部分が、該DNA部分に対して5'側にある、請求項48記載の集団。
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