CN105985949A

CN105985949A - 一种rna高通量测序文库构建方法

Info

Publication number: CN105985949A
Application number: CN201510730153.6A
Authority: CN
Inventors: 王楷宬; 陈继明; 陈贵钱
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2016-10-05

Abstract

本发明属于生物技术领域，它确立了一种RNA高通量测序文库构建方法，构建的文库可在高通量测序仪进行测序并得到高质量序列信息，其含有两个技术要点：1.确立了构建文库所需要的引物；2.确立了操作流程和反应条件。该可用于转录组测序、RNA病毒检测、小RNA测序、宏基因组分析等，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。

Description

一种 RNA 高通量测序文库构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了一种RNA高通量测序文库构建方法，构建的文库可进行高通量测序并得到高质量序列信息，可用于转录组测序、RNA病毒检测、小RNA测序、宏基因组分析等，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。

背景技术

高通量测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序或下一代测序技术。高通量测序技术有三大优点是传统Sanger 测序法所不具备的。第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极致，因此也称之为大规模平行测序。第二，高通量测序技术有完美的定量功能，这是因为样品中某种DNA 被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。第三，成本低廉。利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27 亿美元，虽然比预计的30 亿美元节省了不少，但仍是一个耗资巨大的工程。而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，耗资不到传统测序法的1%。

RNA测序研究是基因功能及结构研究的基础，能够从整体水平研究基因功能及其结构。随着高通量测序和定量检测技术的不断发展，能够通过RNA 测序对转录组进行更深度更完整的研究。该研究进展包括改善转录起始位点的预测、链特异性测序、融合基因的检测、microRNA 定量的分析以及RNA 可变剪切的识别。目前利用单分子测序技术可以实现RNA 的直接测序，通过二代测序技术与单分子测序技术相结合的方式，能更深层次、更全面地获得转录组信息。

发明内容

本发明以微量的RNA为初始样品，可构建用于高通量测序的测序文库。该方法包括以下内容：

该方法以RNA为初始样品，采用随机引物adaptor1-nnnnnn进行反转录，并用随机引物adaptor2-nnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物P1和P2进行聚合酶链式反应扩增，加入测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于高通量测序（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物）。具体操作流程包括：

1. RNA反转录合成第一链。使用引物adaptor1-nnnnnn，采用反转录酶进行RNA反转录。PCR仪中设置如下反应程序，进行反转录反应：25 ℃ 15 分钟，42 ℃ 30 分钟，70 ℃ 15 分钟。

2. RAN/cDNA 消化。在上述反转录反应液中，加入RNase H消化掉RNA。

3. cDNA纯化。采用磁珠纯化第一链cDNA。

4. 第二链合成。使用引物adaptor2-nnnnnn，Klenow Fragment exo-3’→5’ 1μL，37 ℃温育30分钟，合成双链DNA。

5. DNA纯化。采用磁珠纯化DNA。

6. PCR扩增。在PCR管中依次加入：Phusion HF mix 25μL，引物P1和P2 (10pM) 各1μL，纯化的DNA 10μL，DMSO 1.5μL，H2O 11.5μL。进行PCR

7. Lib纯化。用2% 的E-gel 系统回收DNA片段，用于测序。

具体实施方式

下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。

本实施例用此发明的文库构建方法，对鸡胚培养的含有禽副粘病毒4型的尿囊液样品进行处理，提取基因组RNA进行文库构建。采用随机引物gtgtctccgactcagnnnnnn进行反转录，并用随机引物tgggcagtcggtgatnnnnnn合成DNA第二链；以引物ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag和ccgctttcctctctatgggcagtcggtgat进行聚合酶链式反应扩增，加入PGM测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于PGM测序仪进行高通量测序（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物）。包括如下步骤：

第一步（合成引物）：按照本发明指定的核酸序列（即序列表中SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），人工合成逆转录-聚合酶链式反应所需要的引物；

第二步（文库构建）：按照本发明指定的操作流程和反应条件，以禽副粘病毒4型的基因组RNA为原始材料，构建该病毒的基因组RNA的高通量测序文库（200bp）；

第三步（高通量测序）：将第二步构建的基因组RNA的高通量测序文库，按照PGM测序仪的操作步骤进行高通量测序；

第四步（测序结果分析）：测序得到的reads，经质量控制和生物信息学分析，拼接成完整的禽副粘病毒4型基因组序列，并计算测序深度。

实际应用结果：共测序得到52,167 reads（Genbank登录号：SRR2132250），并拼接成完整的禽副粘病毒4型基因组 (15,274 bp，Genbank登录号：KC439346)。

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 一种RNA高通量测序文库构建方法

<160> 4

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据PGM的测序原理而设计，作为文库构建中第一链合成的反转录引物，其中n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物

<400> 1

gtgtctccga ctcagnnnnn n 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据PGM的测序原理而设计，作为文库构建中第二链合成的引物，其中n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物；

<400> 2

tgggcagtcg gtgatnnnnn n 21

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据PGM的测序接头而设计，作为文库扩增和加入测序接头的上游引物；

<400> 3

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据PGM的测序接头而设计，作为文库扩增和加入测序接头的下游引物；

<400> 4

ccgctttcct ctctatgggc agtcggtgat 30

Claims

1.一种RNA高通量测序文库构建方法，其特征为采用随机引物逆转录反应对初始RNA进行反转录，能够对低浓度RNA进行建库测序。

2.一种RNA高通量测序文库构建方法，以RNA为初始样品，采用随机引物adaptor1-nnnnnn进行反转录，并用随机引物adaptor2-nnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物P1和P2进行聚合酶链式反应扩增，加入测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于高通量测序（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，adaptor表示相应的碱基，n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物）。

3. 一种RNA高通量测序文库构建方法，以RNA为初始样品，采用随机引物gtgtctccgactcagnnnnnn进行反转录，并用随机引物tgggcagtcggtgatnnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag和ccgctttcctctctatgggcagtcggtgat进行聚合酶链式反应扩增，加入PGM测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于用于Life Technologies 公司的 Ion torrent PGM高通量测序仪测序（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，n代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物）。