CN104762413A - 流感病毒通用核酸检测方法 - Google Patents

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陈继明
王素春
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Abstract

本发明属于生物技术领域，它确立了甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和新发现的一些流感病毒的通用核酸检测方法，含有三个技术要点： 确立了核酸检测所需要的引物序列；确立了检测反应种类；

Description

流感病毒通用核酸检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了一群重要病毒（即流感病毒）的通用检测方法，用于甲、乙、丙等三个型的流感病毒以及新发现的一些流感病毒的检测，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。
背景技术
流感病毒是人、禽、马、猪等动物重要的病原，可以分为甲、乙、丙三个型。甲型流感病毒还可以分为H1N1、H3N2、H5N8、H9N2等亚型。最近，从牛体内分离到的流感病毒与甲、乙、丙三个型的流感病毒都有显著不同，因此可以当作一个新型的流感病毒。
病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对流感病毒的各种核酸检测方法都是仅针对一个型或一个亚型的流感病毒，没有针对所有型的流感病毒的通用核酸检测方法。
发明内容
本发明针对上述现有流感病毒检测技术的不足，开展了深入研究和测试，建立了甲、乙、丙等三个型的流感病毒以及新发现的一些流感病毒通用核酸检测方法。该方法包括以下三个方面内容：
（一）确立了核酸检测所需要的引物序列，针对流感病毒PB1等基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有20个碱基，序列为ccagttggwggtaatgaaaa（即序列表中SEQ ID NO.1，其中w是简并碱基，表示碱基a和碱基t的混合物），下游上游引物序列含有26个碱基，序列为gttgacagcatgttraacatkcccat（即序列表中SEQ ID NO.2，其中r是简并碱基，表示碱基g和碱基a的混合物，k也是简并碱基，表示碱基g和碱基t的混合物）；
（二）确立了检测反应种类，可以采用多种检测反应，包括普通的逆转录-聚合酶链式反应（通常，这类反应产物用核酸电泳进行检测）、荧光逆转录-聚合酶链式反应（通常，这类反应产物用荧光物质进行检测）或依赖核酸序列扩增反应（通常，这类反应产物用电化学发光物质进行检测）；目前，普通逆转录-聚合酶链式反应和荧光逆转录-聚合酶链式反应最有推广价值。
（三）确立了检测反应体系和反应条件，以普通逆转录-聚合酶链式反应为例，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水7.5微升、2倍一步法逆转录-聚合酶链式反应缓冲液12.5微升（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸）、一步法逆转录-聚合酶链式反应所需要的逆转录酶和核酸聚合酶的混合物1微升、第一步所合成的上游引物1微升（浓度为10微摩尔每升）、第一步所合成的下游引物1微升（浓度为10微摩尔每升）、需要检测的流感病毒核酸2微升（从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）；然后将逆转录-聚合酶链式反应体系密闭，置于聚合酶链式反应仪器（国内常称为PCR仪）上进行逆转录-聚合酶链式反应，反应条件为42摄氏度30分钟，然后94摄氏度2分钟，再进行40个循环，每个循环为94摄氏度30秒，55摄氏度30秒，72摄氏度30秒，循环结束后72摄氏度延伸5至10分钟；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为430至480个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
具体实施方式
下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
本实施例用逆转录-聚合酶链式反应，对流感病毒进行通用核酸检测，包括如下步骤：
第一步（合成引物）：按照本发明指定的核酸序列（即序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2），人工合成逆转录-聚合酶链式反应所需要的上游引物和下游引物；
第二步（配置逆转录-聚合酶链式反应体系）：在聚合酶链式反应管中依次加入纯水7.5微升、2倍一步法逆转录-聚合酶链式反应缓冲液12.5微升（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸）、一步法逆转录-聚合酶链式反应所需要的逆转录酶和核酸聚合酶的混合物1微升、第一步所合成的上游引物1微升（浓度为10微摩尔每升）、第一步所合成的下游引物1微升（浓度为10微摩尔每升）、需要检测的流感病毒核酸2微升（从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）；
第三步（进行逆转录-聚合酶链式反应）：将第二步配置好的逆转录-聚合酶链式反应体系密闭后，置于聚合酶链式反应仪器（国内常称为PCR仪）上进行逆转录-聚合酶链式反应，反应条件为42摄氏度30分钟，然后94摄氏度2分钟，再进行40个循环，每个循环为94摄氏度30秒，55摄氏度30秒，72摄氏度30秒，循环结束后72摄氏度延伸5至10分钟；
第四步（逆转录-聚合酶链式反应结果检测）：在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为430至480个碱基对的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
实际应用结果：对98份人甲型流感病毒标准阳性临床样品、对46份人乙型流感病毒标准阳性临床样品、128份禽甲型流感病毒标准阳性临床样品、3份牛流感病毒标准阳性临床样品进行检测，以及300份来自禽和人的标准阴性样品，用上述流感病毒通用核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为99.27%，特异性为99.33%。
SEQUENCE LISTING
 
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 流感病毒通用核酸检测方法
<160> 2
 
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据各型流感病毒的基因组中保守的核酸序列而设计，作为流感病毒核酸检测所需要的上游引物，其中w是简并碱基，表示a和t的混合物
<400> 1
     ccagttggwg gtaatgaaaa 20
 
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
 
<223> 根据各型流感病毒的基因组中保守的核酸序列而设计，作为流感病毒核酸检测所需要的下游引物，其中r和k是简并碱基，分别表示g和a的混合物以及g和t的混合物；
<400> 2
     gttgacagca tgttraacat kcccat 26
 

Claims (6)

1.流感病毒通用的核酸检测技术，可采用普通逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征是可以检出甲、乙、丙等三个型的流感病毒和新发现的流感病毒，至少可以检出甲型和乙型流感病毒。
2.流感病毒通用的核酸检测技术，其特征有两个：一是可以检出甲、乙、丙等三个型的流感病毒和新发现的流感病毒，至少可以检出甲型和乙型流感病毒；二是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应。
3.流感病毒通用的核酸检测技术，其特征有三个：一是可以检出甲、乙、丙等三个型的流感病毒和新发现的流感病毒，至少可以检出甲型和乙型流感病毒；二是采用针对流感病毒PB1基因保守的区域而设计的一对引物；三是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应。
4. 流感病毒通用的核酸检测技术，可采用逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征有两个：一是可以检出甲、乙、丙等三个型的流感病毒和新发现的流感病毒，至少可以检出甲型和乙型流感病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为ccagttggwggtaatgaaaa，或与ccagttggwggtaatgaaaa序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，w代表简并碱基，表示碱基a和碱基t的混合物）。
5.流感病毒通用的核酸检测技术，可采用逆转录-聚合酶链式反应、荧光逆转录-聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增反应等检测反应，其特征有两个：一是可以检出甲、乙、丙等三个型的流感病毒和新发现的流感病毒，至少可以检出甲型和乙型流感病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为gttgacagcatgttraacatkcccat，或与gttgacagcatgttraacatkcccat序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，r和k代表简并碱基，r表示碱基g和碱基a的混合物，k表示碱基g和碱基t的混合物）。
6.流感病毒通用的核酸检测技术，其特征有三个：一是采用普通逆转录-聚合酶链式反应或荧光逆转录-聚合酶链式反应；二是检测反应采用的两条引物，其序列分别为ccagttggwggtaatgaaaa和gttgacagcatgttraacatkcccat，或与这两个序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基， w、r和k代表简并碱基，w表示碱基a和碱基t的混合物，r表示碱基g和碱基a的混合物，k表示碱基g和碱基t的混合物）。
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