CN108611438A - 同时鉴别h9和h10亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

同时鉴别h9和h10亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于禽类病毒检测技术领域，本发明公开了一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT‑PCR检测引物组、试剂盒及其应用。发明人通过设计针对H9与H10亚型AIV HA基因的特异性引物，经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果最佳的一个引物组合，然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性和敏感性试验表明该方法只能扩增出H9与H10亚型AIV HA基因，不能检测出其它亚型AIV及常见家禽病原的核酸，最低能检测到量为5×104拷贝/μL质粒模板，另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符。

Description

同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试 剂盒及其应用
技术领域
本发明属于禽类病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)的差异可以将AIV划分为16种不同的HA亚型(H1-H16)和9种不同的NA亚型(N1-N9)。H9亚型AIV自1966年在美国首次被发现，目前已经给全球养禽业造成了十分严重的经济损失。自1998年广东首次发现人感染H9N2亚型AIV病例以来，H9N2型AIV感染人事件也在不断的发生。H10亚型AIV主要在北美地区的鸡、火鸡、野鸟及南非地区的鸭中分离到病毒，近年来在我国华南地区的环境及家禽拭子样品中也有分离到H10亚型禽流感毒株的报道。在之前的2004年和2010年，埃及和澳大利亚分别出现H10亚型AIV感染人事件。自2013年12月以来，中国先后发生3例人感染H10N8亚型禽流感病毒的病例并造成其中2例死亡，这是世界上首次报道H10亚型流感病毒感染人并致死的病例。近年来的低致病性禽流感的流行病学的监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在，研究还表明感染人的H10N8亚型流感病毒的部分内部基因来源于H9N2亚型AIV。因此，H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义。
由于经典的病毒分离鉴定方法存在检测鉴定周期较长的缺点，而常用的血清学方法则需要较多标准阳性血清且不同亚型血清之间存在不同程度的交叉反应，具有一定的局限性，所以目前检测禽流感病毒主要是采用分子生物学方法。分子生物学特别是PCR检测方法具有操作简便、特异性好、敏感性高等优点，在禽流感病毒的监测和诊断过程中得到了广泛的应用。由于AIV混合感染普遍存在且具有相似的临床症状，难以及时准确的对其进行鉴别区分。
近年来多重PCR技术在禽流感诊断中的应用越来越多，但关于H9与H10亚型AIV混合感染的多重PCR检测方法还见报道。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用，建立一种可同时检测H9与H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法，不仅可以快速准确的鉴别两种不同亚型AIV，也为感染人的AIV病原学监测提供技术支撑，具有十分重要的公共卫生意义。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对H9-F和H9-R、引物对H10-F和H10-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.4所示的序列。
一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：2×PCR Mix 12.5μL，H9与H10亚型AIV共2μL作为模板，特异性引物H9-F和H9-R的加入量为0.75μL，特异性引物H10-F及H10-R的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。
作为优选，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
作为优选，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R在PCR反应体系中对应的的摩尔终浓度分别为0.75pmol/μL、0.75pmol/μL、1pmol/μL、1pmol/μL。
本发明还提供了所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组或所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H9和H10亚型禽流感病毒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过设计针对H9与H10亚型AIV HA基因的特异性引物，经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果的一个引物组合，然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性和敏感性试验表明该方法只能扩增出H9与H10亚型AIV HA基因，不能检测出其它亚型AIV及常见家禽病原的核酸，最低能检测到量为5×104拷贝/μL质粒模板，另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符。
(2)本发明成功建立了能同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法，该方法具有特异性强及灵敏度高、方便和快速等优点，一次PCR反应便可确定H9与H10亚型AIV的混合感染及单一感染情况，方便基层单位应用，为H9与H10亚型AIV的快速鉴别诊断提供有效的技术支撑。
附图说明
图1为本发明的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法的特异性试验结果图；
其中，M.DNA Marker DL1000；1.H9+H10；2.H9+H10；3.H9N2；4.H9N6；5.H10N2；6.H6N6；7.H1N7；8.H2N3；9.H3N2；10.H5N2；11.H7N9；12.H8N4；13.H10N3；14.H12N5；15.H13N5；16.H14N1；17.H15N5；18.NDV；19.IBV；20.ARV；21.ILTV；22.MG；23.Negativecontrol；
图2为本发明的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法的敏感性试验结果图；
其中，M为DNAMarker DL1000；1为5×109copies/μL；2为5×108copies/μL；3为5×107copies/μL；4为5×106copies/μL；5为5×105copies/μL；6为5×104copies/μL；7为5×103copies/μL；8为5×102copies/μL；9为5×101copies/μL；10为10copies/μL；11为Negative control；
图3为本发明的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法对临床样品试验结果图；
其中，M.DNA Marker DL1000；7、10、14and 16.Positive products of H9subtypeAIVs；2.Positive products of H9and H10subtype AIVs；The others were negativeproducts。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的禽流感毒株及其他禽类病毒参考株均由广西壮族自治区兽医研究所保存。
实施例1：引物设计
参考相关文献从GenBank数据库中下载禽流感病毒H9和H10亚型AIV的HA基因序列，利用DNAStar分别对各个基因核苷酸序列进行分析和比较，寻找出适合设计特异性引物的保守区域，然后采用Primer Premier 5.0结合Oligo7.0进行分析和筛选，设计并通过验证筛选出2对针对H9和H10亚型AIVHA基因进行扩增的特异性引物(见表1)。
表1引物信息
实施例2：二重RT-PCR检测体系的建立与优化
2.1病原RNA/DNA的提取与cDNA合成参照核酸抽提试剂盒使用说明书对本研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV和MG的DNA进行抽提，抽提后的核酸模板用33μLRNA-free水溶解。RNA模板参照宝生物反转录试剂盒的说明书进行cDNA的合成，所有核酸模板均置-30℃低温保存备用。
2.2二重RT-PCR反应体系的建立及优化该方法运用25μL反应体系：2×PCR Mix 10μL，H9与H10亚型AIV cDNA模板各1μL，引物H9-F、H9-R、H10-F和H10-R(25pmol/μL)分别加入0.1-1.0μL，共10个梯度，每个梯度递增0.1μL，进行两个引物组合浓度的优化，最后用RNA-free补足至25μL。同时根据浓度实验的效果再对退火温度及反应时间进行组合优化，最终确定该方法最佳的反应体系及条件。
2.3标准品的制备参考文献中HA全长基因的引物，分别以H9N2与H10N3毒株cDNA为模板进行HA基因RT-PCR的扩增，得到其全长目的片段，并将目的片段分别连接到载体上并送公司进行测序。将插入有H9与H10亚型AIV的HA基因全长片段并测序正确的重组质粒分别命名为H9-T和H10-T。用商品化的质粒抽提试剂盒分别提取含有H9-T和H10-T的质粒，并用微量核酸检测仪对其浓度进行测定，根据相关公式计算样品相对应的拷贝数，同时将H9-T与H10-T质粒等拷贝数混合，并将混合好的样品进行10倍的倍比稀释，以便获得H9-T与H10-T质粒DNA浓度均为5×109～5×101拷贝/μL的标准品。
2.4二重RT-PCR反应条件的优化
我们对H9与H10亚型AIV HA基因两对特异性引物浓度比例及扩增温度时间等的优化，确定二重RT-PCR反应的最佳体系为：2×PCR Mix 12.5μL，H9与H10亚型AIV共2μL作为模板，特异性引物H9-F和H9-R(25pmol/μL)的加入量为0.75μL，特异性引物H10-F及H10-R(25pmol/μL)的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。通过对退火温度进行梯度优化筛选，确定该反应体系的最佳退火温度为53℃。
实施例3：特异性检测
运用上述所建立的二重RT-PCR检测方法按照对H1N7、H1N6、H2N3、H3N2、H3N6、H3N8、H5N1、H5N2、H5N7、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H6N8、H7N2、H7N9、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H12N5、H13N5、H14N1、H15N5、NDV、ARV、IBV和ILTV的cDNA/DNA进行检测，验证所建方法的特异性。
如图1所示，用所建立的二重RT-PCR法从H9及H10亚型AIV混合样品分别检测出2条特异性的条带，分别为490bp(H9亚型)及272bp(H10亚型)；对H9N2和H9N6亚型AIV PCR检测的结果仅出现1条特异性条带，片段大小为490bp；对H10N2亚型AIV进行扩增也均只检测出1条特异性条带，片段大小为272bp；对其它亚型AIV和常见的禽病病原体均未扩增出任何条带，结果表明该方法具有良好的特异性。
实施例4：敏感性检测
运用上述优化好的二重RT-PCR检测方法对制备好的浓度为5×109至5×101拷贝/μL的H9-T与H10-T质粒样品进行扩增，验证该检测方法的敏感性。
如图2所示，运用该方法针对5×109-5×101拷贝/μL的H9与H10亚型的AIV质粒模板进行扩增，结果显示，对浓度为5×109-5×104拷贝/μL的H9与H10亚型的AIV均有2条明显的特异性扩增条带出现，片段大小分别为490bp和272bp；对浓度等于或小于5×103拷贝/μL的H9与H10亚型AIV均无扩增条带。由此可见，该法最低能检测到质粒模板量为5×104拷贝/μL的H9与H10亚型AIV。
实施例5：临床样品检测
运用本试验所建立的二重PCR检测方法对近期从活禽市场采集的150份鸡和鸭咽喉及泄殖腔棉拭子样品一部分进行PCR检测鉴定，同时将相同编号剩余样品经过处理后接种SPF鸡胚进行流感病毒的分离与鉴定，并将鉴定H9与H10亚型AIV为阳性的样品进行HA基因的测定。然后将上述两种方法的结果进行比较，进而验证二重RT-PCR检测结果的准确性。
如图3所示，运用建立的方法对分别从南宁地区不同活禽市场采集到的120份鸡和鸭咽喉及泄殖腔拭子样品进行PCR检测，样品检测的结果显示有6份样品为H9与H10亚型AIV混合感染阳性，阳性率为5％，21份样品能扩增出490bp的目的条带，为H9Nx AIV，2份样品能扩增出272bp的目的条带，为H10Nx AIV。上述检测结果与样品的病毒分离鉴定及其HA基因测序结果100％相符。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用
<130> ZYWS
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcagcagata gagactcaac c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagagatga ggcgacagt 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgaacactt acagaaacac gga 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcggtgcta tcagacccc 19

Claims (5)

1.一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于，包括2对特异性引物，分别是引物对H9-F和H9-R、引物对H10-F和H10-R，其分别具有如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.4所示的序列。
2.一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：2×PCR Mix 12.5μL，H9与H10亚型AIV共2μL作为模板，特异性引物H9-F和H9-R的加入量为0.75μL，特异性引物H10-F及H10-R的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。
3.根据权利要求2所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R，其分别具有如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.4所示的序列。
4.根据权利要求2所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R在PCR反应体系中对应的的摩尔终浓度分别为0.75pmol/μL、0.75pmol/μL、1pmol/μL、1pmol/μL。
5.根据权利要求1所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组或权利要求2-4任一所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H9和H10亚型禽流感病毒中的应用。
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