CN103740863B - 检测禽流感病毒h7n9亚型的rt-lamp试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测禽流感病毒H7N9亚型的RT-LAMP试剂盒，该试剂盒包含6对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-12所示。本发明的试剂盒可快速、特异、灵敏地检测禽流感H7N9亚型病毒，利用浊度仪实时判断反应的进行，或在反应结束后弹入SYBR Green I，通过颜色反应来判断检测结果。检测HA基因的引物最低检测限为48fg/μl的H7N9 RNA；检测NA基因的引物最低检测限为4.8pg/μl的H7N9 RNA。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，适合大范围推广应用。

Description

检测禽流感病毒H7N9亚型的RT-LAMP试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体的说涉及一种检测禽流感病毒H7N9亚型的逆转录-环介导等温扩增技术（RT-LAMP）特异性引物组合及检测试剂盒。
背景技术
过去国际上曾经发生过H7亚型禽流感病毒如H7N2、H7N3和H7N7，首例为1959年于美国发生（H7N7）；在2003年2月至6月期间荷兰出现首例H7感染致死病例，过去H7禽流感大多数是在禽类之间传播，没有在人类之间传染，症状一般也比较弱。最早H7N9病毒记录在1988年，来自美国国家生物技术信息中心，感染动物火鸡。2013年3月下旬，人类感染甲型流感H7N9病毒与病例在上海开始并陆续在中国长江三角洲一带的城市被发现，这是该病毒全球首次感染人类。据统计，该次H7N9病毒出现前，全球共检出25株H7N9亚型流感病毒，均来自野鸟，且从未在家禽中发现。中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室研究人员表示，经病毒片段的重配研究，是次H7N9的8个基因片段中，H7片段源于浙江鸭群中分离的禽流感病毒；N9片段与韩国野鸟中分离的禽流感病毒同源，其余6个基因片段（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）源于H9N2。
人感染H7N9禽流感病例发生以来，全国各级兽医部门按照农业部动物H7N9禽流感紧急监测和流行病学调查方案要求，积极开展监测工作，目前监测采样和实验室检测工作已基本完成。截至5月22日，全国各级兽医实验室共检测完成899758份样品，其中，血清学样品702369份，病原学样品197389份。样品覆盖全国31个省份和新疆生产建设兵团的42250个监测采样场点。
2013年5月22日前国家食品药品监督管理局发文公告批准了上海之江生物可用于临床H7N9禽流感病毒检测的试剂盒--H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)。但市场定价较高，如果用于活禽市场或养禽场H7N9的筛查，荧光探针试剂盒成本显得过高，不利于活禽市场筛查工作的开展，无法满足基层和现场检测的需求。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的检测试剂盒能快速有效的甄别人和动物中的H7N9亚型流感病毒显得非常迫切。
环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isothermamplification,LAMP）是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下(60～65℃)保温30～60分钟,即可完成核酸扩增反应。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人（2004）根据LAMP的原理设计了实时定量LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（2007）建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的LAMP检测体系。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性RT-LAMP引物组。
本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作简单的检测禽流感病毒H7N9亚型的RT-LAMP检测试剂盒。
本发明提供了用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物组合，包括以下6对引物：检测HA基因的1对外引物、1对内引物和1对环引物，检测NA基因的1对外引物、1对内引物和1对环引物，其核苷酸序列分别为：
本发明提供了上述引物组在制备禽流感病毒H7N9亚型的检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了一种含有上述6对特异性引物组合的检测试剂。
本发明提供了一种含有上述6对特异性引物组合的禽流感病毒H7N9亚型RT-LAMP检测试剂盒。
本发明的试剂盒还包含逆转录酶；DNA聚合酶；RT-LAMP反应液；阳性对照和阴性对照；所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。
所述阳性对照为含有AIV-H7N9 HA基因片段的T载体克隆和NA基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC处理水。进一步地，本发明的试剂盒还包含染色剂SYBR Green I。常见的染料有SYBR green、Picogreen、碘化丙啶、钙黄绿素和羟基萘酚蓝等，其中SYBR green和羟基溴酚蓝的检测灵敏度相当，是钙黄绿素等检测灵敏度的10倍；羟基萘酚蓝是反应开始前加入体系。SYBR green是反应结束后再加入反应体系，为避免反应后开盖，可先将其加到管盖上，反应结束后再弹入体系。与羟基萘酚蓝相比，成本上两者相当，但SYBR green在反应后的颜色辨识上要远远好于羟基萘酚蓝。而且SYBR green高浓度时可作为染色法的染色剂，低浓度时可作为荧光反应的显色液，可在荧光仪器上指示实时反应。因此本发明还选择了使用SYBR Green I先将其加到管盖上，反应结束后再弹入体系，通过颜色变化来判断扩增结果。
本发明还提供了上述试剂盒在检测禽流感病毒H7N9亚型中的应用。
本发明的试剂盒在应用时，其检测HA基因的25μL RT-LAMP检测体系的具体配置为：HA-F3 0.2μM，HA-B3 0.2μM，HA-FIP 1.6μM，HA-BIP 1.6μM，HA-LF 0.8μM，HA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；
检测NA基因的25μL RT-LAMP检测体系的具体配置为：NA-F30.2μM，NA-B3 0.2μM，NA-FIP 1.6μM，NA-BIP 1.6μM，NA-LF 0.8μM，NA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl。
进一步地，应用本发明试剂盒检测HA基因和NA基因的工作条件均为：63～65℃反应60～90min，80℃2min，然后终止反应，通过浊度仪实时判读反应管中的浊度变化。
优选地，检测HA基因和NA基因的工作条件均为：63℃反应60min，80℃2min，然后终止反应。
本发明的试剂盒在应用时，还包括在配置RT-LAMP检测体系时，在PCR管盖内壁加1μl 1000×SYBR Green I，通过颜色变化判断结果。
本发明试剂盒在每次检测标本时必须设立NEG对照（阴性对照）和POS对照（阳性对照），两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NEG（-）和POS（+）
无效扩增：NEG（+）和POS（+）提示体系污染
无效扩增：NEG（-）和POS（-）提示体系错误或者试剂失效。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
结果判定方法为：反应管内试剂变为橙红色为阴性结果，变为绿色为阳性结果。
在本发明的一个实施例中，提供了利用上述的试剂盒检测禽流感H7N9（AIV-H7N9）的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；
（2）恒温基因扩增反应：HA基因的检测，25μl反应体系含有：HA-F3 0.2μM，HA-B3 0.2μM，HA-FIP 1.6μM，HA-BIP 1.6μM，HA-LF0.8μM，HA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理处理水水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，在管盖内壁加1μl 1000×SYBR Green I，置于65℃反应60min，并在80℃持续2min；
NA基因的检测，25μl反应体系含有：NA-F3 0.2μM，NA-B30.2μM，NA-FIP 1.6μM，NA-BIP 1.6μM，NA-LF 0.8μM，NA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，在管盖内壁加1μl 1000×SYBR Green I，置于65℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：在试剂盒中含有染色剂1000×SYBR Green I的情况下，在反应管盖上滴加1000×SYBR Green I 1μl，然后将反应管中置于浊度仪、金属浴或者水浴锅中。采用浊度仪进行反应，可通过浊度仪软件实时观察反应管内浊度变化来判断扩增结果，若反应过程中浊度仪软件上呈现“S”型扩增曲线，为阳性；不出现“S”型扩增曲线，为阴性。或60min以后弹入染色剂，通过颜色变化来判断扩增结果，反应管中试剂由无色变为绿色的，为阳性；由无色变为橙红色的，为阴性。
本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果，表现在：
（1）快速高效：整个扩增只用60～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；相对于常规PCR反应要2～4h才能完成检测，大大缩短了检测时间；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行反转录以及双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；非常适用于现场标本的检测，易于大范围推广应用；
（3）高特异性：本发明根据禽流感H7N9（AIV-H7N9）的血凝素基因（HA基因，）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；同时根据禽流感H7N9（AIV-H7N9）的神经氨酸酶基因（NA基因，）设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，进一步确保H7N9检出的特异性；
（4）高灵敏度：HA引物能检测到48fg/μl的病毒RNA；NA引物能检测到4.8pg/μl的病毒RNA；
（5）鉴定简便：采用浊度仪进行反应及检测，检测反应过程中的副产物焦磷酸镁沉淀来判断反应是否进行。或者是反应结束后加入SYBR Green I，通过观察颜色变化来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
（6）成本
目前，上海之江生物科技股份有限公司申报的“人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒（荧光PCR法）”获得国家食品药品监督管理总局批准，其在市面上的销售价格是人民币2500元/25人份，合100元/每人份。而本申请的RT-LAMP检测试剂盒的成本在20元左右，市场定价会远低于上海之江的人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒定价，这有利于活禽市场筛查工作的开展。
附图说明
图1为HA引物的筛选图，显示HA-1出峰时间约为34min。
图2为HA引物的筛选图，显示HA-2HA-3引物的出峰时间约是42min、40min。
图3为HA-1、HA-3引物分别引入环引物后的引物筛选结果。
图4为NA引物筛选图，显示NA-1出峰时间约为49min，早于NA-2引物。
图5为NA引物筛选图，显示NA-3引物的出峰时间是42min左右。
图6为NA-1NA-3引物分别引入环引物后的引物筛选结果图。
图7为是实施例3中HA引物特异性实验的检测结果图，其中，1:H7N9;2:H3N2;3:H9N2;4:H1N1;5:H6N2;6:H5N1;7:ND;8:NTC。
图8是实施例3中NA引物特异性实验的检测结果图，其中1:H7N9;2:H3N2;3:H9N2;4:H1N1;5:H6N2;6:H5N1;7:ND;8:NTC。
图9是实施例4中HA引物灵敏度实验的检测结果图，其中1:101倍稀释;2:102倍稀释;3:103倍稀释;4:104倍稀释;5:105倍稀释;6:106倍稀释;7:107倍稀释;8:108倍稀释。
图10是实施例4中NA引物灵敏度实验的检测结果图，其中1:101倍稀释;2:102倍稀释;3:103倍稀释;4:104倍稀释;5:105倍稀释;6:106倍稀释;7:107倍稀释;8:108倍稀释。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 检测禽流感H7N9亚型的RT-LAMP引物的设计
本发明RT-LAMP引物设计：以禽流感H7N9（AIV-H7N9）的血凝素基因（HA基因，GenBank登录号为KC853766.1）为靶基因，以及以禽流感H7N9（AIV-H7N9）的神经氨酸酶基因（NA基因，GenBank登录号为KC853765.1）为靶基因，利用在线设计软件Primer Explorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)进行LAMP引物的设计。
本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下：
表1 HA引物筛选过程中使用的引物序列
HA引物的筛选结果见图1-3，显示HA-1引物与HA-3引物出峰时间非常接近，但HA-1引物的阴性对照出现非特异性上扬，故选择HA-3引物作为优选扩增HA基因的引物组合。本实施例中，阴性对照是以超纯水为模板。体系与阳性一样，没加质粒。
表2 NA引物筛选过程中使用的引物序列
NA引物的筛选结果见图4-6，结果显示NA-1引物与NA-3引物出峰时间非常接近，但NA-1引物的阴性对照出现波动，故选择NA-3引物作为最佳扩增NA基因的引物组合。本发明在摒弃诸多效果较差的引物对后，选择下述特异性引物作为检测禽流感H7N9的RT-LAMP引物组合。
表3 用于检测AIV H7N9亚型的RT-LAMP方法的引物序列
实施例2 检测禽流感H7N9亚型的标准阳性质粒的构建
含有禽流感H7N9（AIV-H7N9）血凝素（HA）基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以合成的HA基因片段为模板，利用表3中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）对合成的HA基因片段进行扩增，所得基因片段长度为265bp，序列如SEQ ID NO:13所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为含HA基因的标准阳性质粒。
含有禽流感H7N9（AIV-H7N9）神经氨酸酶基因片段的T载体克隆，其制备方法为：以合成的NA基因片段为模板，利用表3中的外引物（SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8）对合成的NA基因片段进行扩增，所得基因片段长度为373bp，序列如SEQ ID NO:14所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为含NA基因的标准阳性质粒。
实施例3 检测禽流感H7N9亚型的RT-LAMP试剂盒的构建
本发明的禽流感H7N9亚型RT-LAMP检测试剂盒，包括实施例1的RT-LAMP引物组合、RT-LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、阳性对照（实施例2获得的2个阳性质粒）和阴性对照。RT-LAMP反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。阴性对照为DEPC处理水。
利用本发明的试剂盒检测禽流感H7N9（AIV-H7N9）病毒的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA；所用的禽流感H7N9亚型病毒为G1株，分离地点是杭州，宿主是人，通过咽试子分离得到。
（2）恒温基因扩增反应：HA引物检测，25μl反应体系含有：HA-F3 0.2μM，HA-B3 0.2μM，HA-FIP 1.6μM，HA-BIP 1.6μM，HA-LF0.8μM，HA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并置于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
NA引物检测，25μl反应体系含有：NA-F3 0.2μM，NA-B3 0.2μM，NA-FIP 1.6μM，NA-BIP 1.6μM，NA-LF 0.8μM，NA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并置于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：通过浊度仪对反应管中的浊度变化进行实时分析，当反应管中浊度发生变化时，浊度仪软件将会呈现“S”型扩增曲线。如果出现“S”型扩增曲线为阳性，无“S”型扩增曲线则为阴性。
实施例4 检测禽流感H7N9亚型的RT-LAMP检测试剂盒特性评价
1、特异性评价
本实施例中，试剂盒中除增加实施例3中没有的染色剂（SYBRGreen I）外，其余同实施例3。
用实施例3构建的试剂盒按以下方法对待检样品进行检测：
（1）待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取纯化待测样品RNA；所述待测样品分别为禽流感病毒的以下亚型：H7N9、H3N2、H9N2、H1N1、H6N2、H5N1以及NDV，前述病毒均由农业部养禽与禽病防治重点开放实验室分离并保存。
（2）恒温基因扩增反应：HA引物检测，25μl反应体系含有：HA-F3 0.2μM，HA-B3 0.2μM，HA-FIP 1.6μM，HA-BIP 1.6μM，HA-LF0.8μM，HA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，AMV逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，小心打开管盖，将1μl SYBR Green I加在管盖上，避免染色液掉入反应液中，并于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
NA引物检测，25μl反应体系含有：NA-F3 0.2μM，NA-B3 0.2μM，NA-FIP 1.6μM，NA-BIP 1.6μM，NA-LF 0.8μM，NA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，小心打开管盖，将1μl SYBR Green I加在管盖上，避免染色液掉入反应液中，并于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中进行反应，观察浊度仪软件判断扩增结果，如果出现扩增曲线则为阳性，无扩增曲线则为阴性。反应结束后将管盖上的显色液弹入反应液中，观察颜色变化，出现绿色为阳性，橙红色为阴性（图7、图8）。图7、8结果显示建立的H7N9亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法能特异地检测H7N9亚型AIV，而不与禽流感其他亚型H3N2、H9N2、H1N1、H6N2、H5N1以及NDV发生交叉反应。
2、灵敏度评价
将已纯化的禽流感H7N9（AIV-H7N9）RNA作10倍梯度稀释，取101～108倍稀释H7N9病毒用实施例2的操作方法分别对稀释后的禽流感H7N9（AIV-H7N9）RNA进行检测。
鉴定结果显示：以HA检测引物为引物，101～107倍稀释H7N9病毒RNA发生扩增，108倍稀释模板没有扩增（见图9）。
以NA检测引物为引物，101～105倍稀释H7N9病毒RNA发生扩增，106～108倍稀释模板没有扩增（见图10）。
经模板浓度测定，本发明的HA引物组合能检测到48fg/μl的AIH7N9病毒RNA；NA引物组合能检测到4.8pg/μl的AI H7N9病毒RNA。
实施例4 本发明RT-LAMP检测试剂盒临床标本实际应用评价
使用本发明RT-LAMP检测试剂盒与经典的鸡胚分离方法分别检测36份临床咽拭子标本。检测结果见表。结果显示，本发明试剂盒标本检测阳性率为94%（34/36），鸡胚分离方法的阳性率为89%（32/36），经统计学计算两种方法阳性率不存在显著性差异，说明本发明试剂盒对于临床标本检测能力与经典的鸡胚分离方法相当。结果见表4。
表4 本试剂盒与经典的鸡胚分离方法对临床标本检测的比较
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物组，其特
征在于，由以下6对引物组成：检测HA基因的1对外引物、1对内
引物和1对环引物，检测NA基因的1对外引物、1对内引物和1对
环引物，其核苷酸序列依次分别为：
HA-F3：AGGCGAGAAGGAAGTGAT
HA-B3：TTATATGACTTAGTCATCTGCG
HA-FIP：ACATGCACTGGTTGCTCCATTCAGAGAATCAGGCGGAA
HA-BIP：AGGAGATCAGGATCTTCATTCTGAATGCAGCATTATCTGTGTT
HA-LF TCCCATTGCTTCCTTGTCAA
HA-LB CAGAAATGAAATGGCTCCTGTC
NA-F3：CCACAGTGTACAACAGCA
NA-B3：CATCGGTGAACACTACTGG
NA-FIP：TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTGTCAAGTACTAGTTGCCATGA
NA-BIP：ACAGAAGGCCTGTTGCAGAAAGGCATACACATTCAGATTCCT
NA-LF TTGACATCCTGGATTTGCCA
NA-LB GCCCGAAACATACTAAGAACAC。
2.权利要求1所述的特异性引物组在制备禽流感病毒H7N9亚型的检测试剂盒或检测试剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述特异性引物组的检测试剂。
4.一种含有权利要求1所述特异性引物组的禽流感病毒H7N9亚型RT-LAMP检测试剂盒，其还包含逆转录酶；DNA聚合酶；RT-LAMP反应液；阳性对照和阴性对照；所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有AIV-H7N9HA基因片段的T载体克隆和NA基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC处理水。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含染色剂SYBRGreen I。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测HA基因的25μLRT-LAMP检测体系的具体配置为：HA-F30.2μM，HA-B30.2μM，HA-FIP 1.6μM，HA-BIP 1.6μM，HA-LF 0.8μM，HA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl；
检测NA基因的25μL RT-LAMP检测体系的具体配置为：NA-F30.2μM，NA-B30.2μM，NA-FIP 1.6μM，NA-BIP 1.6μM，NA-LF 0.8μM，NA-LB 0.8μM，RT-LAMP反应液12.5μl，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA 1～100ng，用DEPC处理水补齐到25μl。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测HA基因和NA基因的工作条件均为：63-65℃反应60-90min，80℃2min，然后终止反应，通过浊度仪实时判读反应管中的浊度变化。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括在配置RT-LAMP检测体系时，在PCR管盖内壁加1μl 1000×SYBR Green I，通过颜色变化判断结果。
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