CN102649985B - H1n2亚型禽流感病毒rt-lamp可视化检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种H1N2亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。该试剂盒包括检测或辅助检测H1亚型和N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，该成套引物由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。本发明特异性强、灵敏度高、仪器设备及操作简单、结果便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行H1亚型和H1N2亚型禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
Description
技术领域
本发明涉及H1N2亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。
背景技术
禽流感（Avian Influenza,AI）是禽流行性感冒的简称，是由正粘病毒科流感病毒属A型禽流感流行性感冒病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）传染病。根据A型流感病毒表面糖蛋白（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的抗原性不同，禽流感病毒（AIV）可进一步分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚型和9种NA亚型。AIV是一种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒，病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。AIV基因组的分节段特性使得两种或两种以上不同亚型流感病毒共同感染一个细胞时，子代病毒在装配时其核酸片段可能以同源交换的形式发生基因重排而导致抗原转变，从而产生能引起大流行的新流行株。人类历史上几次大流感的流行毒株（H2N2、H3N2）均是禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排而产生，而H1N1亚型AIV传播给人直接导致了1918年世界范围内的毁灭性人类大流感流行。当前流行的甲型H1N1流感病毒的部分基因也来源于AIV。因此H1亚型AIV虽为低致病性AIV,但具有重要的公共卫生学意义,目前已有从我国家禽中检测到H1N2亚型AIV的报告。加强H1N2亚型AIV的检测和监测，对保障人类健康意义重大，而快速简便特异的检测技术有助于H1N2亚型AIV的早期大规模诊断。
目前禽流感病毒常采用的检测方法包括病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术（IFA）、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Gene chips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定结果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，就可以完成RNA的检测（RT-LAMP）。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。
本发明所提供的检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。
所述成套引物中，各简并引物的摩尔比可为1.6μmol所述简并引物FIP-H1、1.6μmol所述简并引物BIP-H1、0.2μmol简并引物F3-H1、0.2μmol简并引物B3-H1、0.8μmol简并引物LF-H1、0.8μmol简并引物LB-H1、1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol简并引物F3-N2、0.2μmol简并引物B3-N2、0.8μmol简并引物LF-N2和0.8μmol简并引物LB-N2。
所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是简并引物中各种单链DNA摩尔数之和。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、反转录酶、Mg2+和上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。
所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，包括二套独立包装的试剂，分别为反应试剂A和反应试剂C；所述反应试剂A含有1.6μmol所述简并引物FIP-H1、1.6μmol所述简并引物BIP-H1、0.2μmol所述简并引物F3-H1、0.2μmol所述简并引物B3-H1、0.8μmol所述简并引物LF-H1、0.8μmol所述简并引物LB-H1、1mmol所述dATP、1mmol所述dCTP、1mmol所述dGTP、1mmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和1mmol所述甜菜碱；所述反应试剂C含有1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol所述简并引物F3-N2、0.2μmol所述简并引物B3-N2、0.8μmol所述简并引物LF-N2、0.8μmol所述简并引物LB-N2、1mmol所述dATP、1mmol所述dCTP、1mmol所述dGTP、1mmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和1mmol所述甜菜碱。
所述简并引物的摩尔数均是指简并引物中各种单链DNA的摩尔数之和。
所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段；所述反转录酶可为M-MLV反转录酶。
所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂，还可包括荧光显色剂。进一步，所述荧光显色剂可为：每4μl试剂由1μl浓度为625μmol/L钙黄绿素的溶液、1μl浓度为12.5mmol/L的MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物或上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂。进一步，所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂盒还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可为H1N2亚型禽流感病毒RNA；阴性对照可为灭菌超纯水。
另外，上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物在制备检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，或上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，或上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒均可采用下述1）或2）的方法进行制备：
1）所述成套引物或所述试剂或试剂盒的制备方法，均包括将所述成套引物中的所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2分别单独包装的步骤；
2）所述成套引物或所述试剂或试剂盒的制备方法，均包括制备如下2个单独包装的步骤：
a）将所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1按照所述比例混合在一起得到一个单独包装；
b）将所述成套引物中的所述简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2、简并引物LB-N2按照所述比例混合在一起得到另一个单独包装。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。
本发明所提供的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物由简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。
所述成套引物中，各简并引物的摩尔比可为1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol简并引物F3-N2、0.2μmol简并引物B3-N2、0.8μmol简并引物LF-N2和0.8μmol简并引物LB-N2。
所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是简并引物中各种单链DNA摩尔数之和。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反转录酶和上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。
所述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2、所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比可为1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol所述简并引物F3-N2、0.2μmol所述简并引物B3-N2、0.8μmol所述简并引物LF-N2、0.8μmol所述简并引物LB-N2、1mmol所述dATP、1mmol所述dCTP、1mmol所述dGTP、1mmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和1mmol所述甜菜碱。
所述简并引物的摩尔数均是指简并引物中各种单链DNA的摩尔数之和。
所述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段；所述反转录酶可为M-MLV反转录酶。
所述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂还可包括荧光显色剂。进一步，所述荧光显色剂可为：每4μl试剂由1μl浓度为625μmol/L钙黄绿素溶液、1μl浓度为12.5mmol/L MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物或上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。进一步，所述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可为H1N2亚型禽流感病毒RNA；阴性对照可为灭菌超纯水。
另外，上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物在制备检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒或N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒或N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒具体可为上述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒环介导等温扩增试剂或试剂盒，或为上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒环介导等温扩增试剂或试剂盒。
上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物和上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂和检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂盒中，所述简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2可分别单独包装或按照所述比例混合在一起。
上述N2亚型禽流感病毒具体可为H1N2亚型禽流感病毒。
本发明通过比较分析大量的H1亚型AIV-HA基因序列、N2亚型AIV-NA基因序列，设计了6对特异性引物，TRIZOL法或用RNA提取试剂盒提取感染家禽喉气管、泄殖腔棉拭子及组织样品的总RNA，在反转录酶和Bst DNA聚合酶作用下，于水浴锅63℃反应45分钟，一步法进行反转录和环介导等温扩增，80℃作用5min终止反应。本发明在反应前向反应试剂中添加入荧光试剂（Calcein和MnCl2的混合液），反应结束后可直接通过肉眼在可见光或365nm波长紫外线照射下观察反应液的颜色变化来判定结果，实现了RT-LAMP反应结果的可视化观察同时也避免了打开反应管盖后引起环境污染而造成下次实验的假阳性结果。反应开始之前钙黄绿素（Calcein）与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光，反应液为浅桔色。随着反应的扩增，产生大量的焦磷酸根离子，而焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素就可自发荧光，镁离子还可以加强这种荧光效果，阳性反应液肉眼可见颜色变绿，在紫外线照射下可激发绿色荧光。实验证明，本发明的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒、或H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物、试剂和试剂盒可特异性地检测N2亚型或H1N2亚型禽流感病毒，而对其它亚型禽流感病毒和呼吸道病原体无交叉反应，针对N2亚型禽流感病毒NA基因的RT-LAMP方法最少可以检测到100fg的禽流感病毒总RNA，灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍。针对H1N2亚型禽流感病毒NA基因的RT-LAMP方法最少可以检测到100fg的禽流感病毒总RNA，灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍。RT-LAMP方法对临床样品的检出率与经典的鸡胚分离方法一致，但略高于常规RT-PCR方法。本发明特异性强、灵敏度高、仪器设备及操作简单、结果便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行H1亚型和H1N2禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
附图说明
图1为RT-LAMP和RT-PCR方法检测H1亚型AIV-HA基因的灵敏度比较。
图中，M：100bp DNA分子量标准；其它从左至右分别为加入AIV总RNA含量为1ng/2μl、100pg/2μl、10pg/2μl、1pg/2μl、100fg/2μl、10fg/2μl和1fg/2μl的管、阴性对照（NC）。其中A图为可见光下RT-LAMP反应结果，B图为365nm波长紫外线照射下RT-LAMP反应结果，C图为RT-PCR的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图2为RT-LAMP和RT-PCR方法检测H1N2亚型AIV-NA基因的灵敏度比较。
图中，M：100bp DNA分子量标准；其它从左至右分别为加入AIV总RNA含量为1ng/2μl、100pg/2μl、10pg/2μl、1pg/2μl、100fg/2μl、10fg/2μl和1fg/2μl的AIV总RNA的管、阴性对照（NC）。其中A图为可见光下RT-LAMP反应结果，B图为365nm波长紫外线照射下RT-LAMP反应结果，C图为RT-PCR的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图3为检测H1亚型AIV-HA基因的RT-LAMP引物在模板基因（A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)HA基因）的具体位置。其中F1c-H1、LF-H1、B2-H1、B3-H1引物序列与模板基因序列反向互补。FIP-H1引物由F1c-H1和F2-H1引物组成，BIP-H1引物由B1c-H1和B2-H1引物组成。
图4为检测H1N2亚型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因（A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)NA基因）的具体位置。其中F1c-N2、LF-N2、B2-N2、B3-N2引物序列与模板基因序列反向互补。FIP-N2引物由F1c-N2和F2-N2引物组成，BIP-N2引物由B1c-N2和B2-N2引物组成。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的毒株或毒株核酸样品公众均可从广西壮族自治区兽医研究所获得，除A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)记载在GenBank外（登录号：JQ904458，在该登录号中的名称为A/duck/Guangxi/D/2011(H1N2），其它均记载在如下文献中：Yi Peng.et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification assay.Virology Journal,2011,8:337。
实施例1、成套引物
本实施例的检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物和检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物组成。其中，检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1和简并引物LB-H1组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6（表1）。其中，F3-H1和B3-H1为外引物，FIP-H1和BIP-H1为内引物，LF-H1和LB-H1为环引物。各引物在H1N1亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)HA基因中的位置见图3。
检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12（表1）。其中，F3-N2和B3-N2为外引物，FIP-N2和BIP-N2为内引物，LF-N2和LB-N2为环引物。各引物在H1N2亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/D/2011(H 1N2)NA基因中的具体位置见图4。
表1RT-LAMP引物序列
注：引物序列中，R为A或G，Y为T或C，H为A或C或T，D为A或G或T，M为A或C，W为A或T。
其中，FIP-H1是图3中F1c-H1+F2-H1，F1c-H1的核苷酸序列是箭头所示序列的反向互补序列；BIP-H1图3中B1c-H1+B2-H1，B2-H1的核苷酸序列是箭头所示序列的反向互补序列；FIP-N2是图4中的F1c-N2+F2-N2，F1c-N2的核苷酸序列是箭头所示序列的反向互补序列；BIP-N2是图4中B1c-N2+B2-N2，B2-N2的核苷酸序列是箭头所示序列的反向互补序列。
实施例2、检测或辅助检测H1亚型、N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂的优化
本实施例以毒株A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)、A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)为待检测样品测试以下检测或辅助检测H1亚型、N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂的效果：
方法如下：
1、H1N2亚型禽流感病毒RNA提取
经血凝试验、血凝抑制试验及序列测定鉴定的临床分离毒株A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)用TRIZOL法或RNA提取试剂盒提取总RNA。
2、RT-LAMP反应条件的优化
对影响扩增反应效率的试剂在如下范围内进行优化：MgSO4(0.6-9mmol/L)、甜菜碱(0.2-1.9mmol/L)、Bst DNA聚合酶大片段（4-14U）、dNTP（0.6-1.6mmol/L）。将温度按59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。反应结束后，记录不同体系反应液在紫外线照射下的荧光强度，选择荧光最强的反应体系为最佳反应体系。按照如下方法进行结果判定：反应结束后,通过肉眼在可见光或365nm波长紫外线照射下观察反应液的颜色变化来判定结果。可见光下，阴性样品反应结束后仍为浅桔色，阳性样品反应结束后由反应前的浅桔色变为黄绿色。365nm波长紫外线照射下，阴性样品反应液无绿色荧光，阳性样品反应液可见很强的绿色荧光。
优化的体系总体积为25ul,包括2.5ul 10倍反应缓冲液（20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100)、6mmol/L MgSO4、1mmol/L甜菜碱、外引物F3和B3各0.2μmol/L、内引物FIP和BIP各1.6μmol/L、环引物LF和LB各0.8μmol/L、1mmol/L dATP、1mmol/L dCTP、1mmol/L dGTP、1mmol/LdTTP、200U M-MLV反转录酶、8UBst DNA聚合酶大片段、25μmol/L钙黄绿素、0.5mmol/L MnCl2、2ul病毒RNA、2ul灭菌超纯水。63℃反应45分钟，80℃作用5min终止反应。
通过以上优化实验确定：
1、由简并引物FIP-H1、BIP-H1、F3-H1、B3-H1、LF-H1和LB-H1，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+、Bst DNA聚合酶大片段、M-MLV反转录酶、10倍反应缓冲液和甜菜碱组成的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂A中，各组分的配比为1.6μmol简并引物FIP-H1、1.6μmol简并引物BIP-H1、0.2μmol简并引物F3-H1、0.2μmol简并引物B3-H1、0.8μmol简并引物LF-H1、0.8μmol简并引物LB-H1、1mmol dATP、1mmol dCTP、1mmol dGTP、1mmol dTTP、6mmol Mg2+、8UBst DNA聚合酶大片段、1mmol甜菜碱、200U M-MLV反转录酶、2.5ul 10倍反应缓冲液（20mMTris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100)。
将上述检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂A、阳性对照、阴性对照和荧光试剂组装在一起，得到检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。其中，阳性对照有两种，分别是H1N1亚型禽流感病毒RNA和H1N2亚型禽流感病毒RNA；阴性对照为灭菌超纯水；荧光试剂：每4μl荧光试剂由1ul浓度为625μmol/L的钙黄绿素溶液、1μl浓度为12.5mmol/L的MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
2、由简并引物FIP-N2、BIP-N2、F3-N2、B3-N2、LF-N2和LB-N2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Mg2+、Bst DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、10倍反应缓冲液和甜菜碱组成的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂C中，各组分的配比为1.6μmol简并引物FIP-N2、1.6μmol简并引物BIP-N2、0.2μmol简并引物F3-N2、0.2μmol简并引物B3-N2、0.8μmol简并引物LF-N2、0.8μmol简并引物LB-N2、1mmoldATP、1mmol dCTP、1mmol dGTP、1mmol dTTP、6mmol Mg2+、8U Bst DNA聚合酶大片段、1mmol甜菜碱、200U M-MLV反转录酶、2.5ul 10倍反应缓冲液（20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100)。
将上述检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂C、阳性对照、阴性对照和荧光试剂组装在一起，得到检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。其中，阳性对照为H1N2亚型禽流感病毒RNA；阴性对照为灭菌超纯水；荧光试剂：每4μl荧光试剂由1ul浓度为625μmol/L的钙黄绿素溶液、1μl浓度为12.5mmol/L的MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
实施例3、利用检测或辅助检测H1亚型、N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒检测鸡源样品
A、本实施例采用如下检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒进行检测。该试剂盒是将检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂A、阳性对照A、阴性对照和荧光试剂组装在一起得到的产品。
其中，19μl的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂（以下简称RT-LAMP反应试剂A）组成如下：2.5μl 10倍反应缓冲液（20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100）、6mmol/L MgSO4、1mmol/L甜菜碱、外引物F3-H1和B3-H1各0.2μmol/L、内引物FIP-H1和BIP-H1各1.6μmol/L、环引物LF-H 1和LB-H 1各0.8μmol/L、1mmol/L dNTP、200U M-MLV反转录酶、8U Bst DNA聚合酶大片段。
荧光试剂：每4μl荧光试剂由1ul浓度为625μmol/L的钙黄绿素溶液、1μl浓度为12.5mmol/L的MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
阳性对照A是A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA。
阴性对照为灭菌超纯水。
C、本实施例采用如下检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒进行检测。该试剂盒是将检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂C、阳性对照C、阴性对照和荧光试剂组装在一起得到的产品。
其中，19μl的检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP反应试剂（以下简称RT-LAMP反应试剂C）组成如下：2.5μl 10倍反应缓冲液（20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1%Triton X-100）、6mmol/L MgSO4、1mmol/L甜菜碱、外引物F3-N2和B3-N2各0.2μmol/L、内引物FIP-N2和BIP-N2各1.6μmol/L、环引物LF-N2和LB-N2各0.8μmol/L、1mmol/L dNTP、200U M-MLV反转录酶、8U Bst DNA聚合酶大片段。
荧光试剂：每4μl荧光试剂由1ul浓度为625μmol/L的钙黄绿素溶液、1μl浓度为12.5mmol/L的MnCl2溶液和2μl灭菌超纯水组成。
阳性对照C为A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA。
阴性对照为灭菌超纯水。
(一)棉拭子样品的检测
1、样品准备及RNA提取
样品来源于活禽市场经病毒分离鉴定的1只H1N2亚型AIV阳性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子，1只未感染H1N2亚型AIV阴性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子，共4份样品。其中，H1N2亚型AIV通过鸡胚接种的方法进行分离、用特异性血清进行血凝抑制试验（HI）和针对NA基因的特异性RT-PCR进行HA、NA亚型的鉴定。
用力搅动喉气管和泄殖腔棉拭子，在管壁上反复挤压数次，尽可能多的释放棉拭子内容物，挤干棉拭子并弃之。液体在高速台式离心机上以3000rpm速度离心10min。吸取上清液，按TRIZOL法或RNA提取试剂盒提取总RNA。
2、RT-LAMP
具体的检测方法如下：
1）检测H1亚型的方法如下：
取6只管，每只管中加入19μl RT-LAMP反应试剂A，4μl荧光试剂，得到6管反应液A。将4个待检样品RNA、A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)病毒RNA、A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA和阴性对照各2ul分别加入6管反应液A中。于水浴锅中63℃作用45分钟，80℃作用5min终止反应。实验设三次重复。
2）检测N2亚型的方法如下：
取6只管，每只管中加入19μl RT-LAMP反应试剂C，4μl荧光试剂，得到6管反应液C。将4个待检样品RNA（A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)病毒RNA）、A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA和阴性对照各2ul分别加入6管反应液C中。于水浴锅中63℃作用45分钟，80℃作用5min终止反应。实验设三次重复。
结果观察和判定：反应前，所有反应液在可见光下为均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光。反应结束后，所有阳性对照样品反应液颜色在可见光下为浅绿色，在紫外线下可见很强的绿色荧光；所有阴性对照样品反应液在可见光下为均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光。在阴性和阳性对照样品结果正确的前提下，可根据反应液颜色变化判定待捡样品结果。
H1亚型检测的三次重复实验的结果表明，反应前，所有反应液在可见光下为均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光；试剂盒自带阴性对照样品（灭菌超纯水）和H1N2亚型AIV阴性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品反应管反应结束后可见光下均为浅桔色，在紫外线下没有绿色荧光；试剂盒自带的阳性对照样品A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA）、H1N2亚型AIV阳性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品反应管反应结束后均可见光下均为浅绿色，在紫外线下均可见很强的绿色荧光。
N2亚型检测的三次重复实验的结果表明，反应前，所有反应液在可见光下为均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光；试剂盒自带阴性对照样品（灭菌超纯水）、H1N2亚型AIV阴性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品反应管反应结束后可见光下均为浅桔色，在紫外线下没有绿色荧光；试剂盒自带的阳性对照样品（A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)病毒RNA）、H1N2亚型AIV阳性鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品反应管反应结束后可见光下均为浅绿色，在紫外线下均可见很强的绿色荧光。
实施例4、实施例3的RT-LAMP试剂盒的特异性
利用实施例3的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒、检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒和检测，以不同亚型AIV、引起呼吸道症状的NDV（新城疫病毒）、IBV（传染性支气管炎病毒）、ILTV（传染性喉气管炎病毒）、MG（鸡毒支原体）的RNA/DNA为待检样品，按照实施例3的方法进行RT-LAMP或LAMP检测（ILTV、MG样品不需反转录，反转录酶用1ul灭菌超纯水代替），结果表明反应前，所有反应液在可见光下为均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光；反应结束后只有H1、N2亚型AIV为阳性反应（反应结束后反应液在可见光下为浅绿色，在紫外线下可见很强的绿色荧光），与其它HA、NA亚型AIV和病原体呈阴性反应（反应结束后反应液在可见光下均为浅桔色，在紫外线下没有绿色荧光），结果见表2。
说明本发明能特异性地检测H1亚型禽流感病毒和N2亚型禽流感病毒，而对H1亚型、N2亚型以外的AIV、NDV、IBV、ILTV、MG无交叉反应。
表2RT-LAMP特异性检测
注：+：阳性结果 -：阴性结果；A/Duck/Guangxi/047D16/2010(H3)毒株的NA亚型经RT-PCR鉴定为N2亚型；A/Duck/Guangxi/027D/2009(H4)经RT-PCR鉴定为N2亚型阴性；A/Chicken/Guangxi/43C/09(H11)毒株的NA亚型经RT PCR鉴定为N1亚型。
实施例5、实施例3的RT-LAMP试剂盒的灵敏度
利用实施例3的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒和检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒进行灵敏度实验。
将制备的A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)禽流感病毒总RNA按10倍倍比稀释，并使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为1ng/2μl、100pg/2μl、10pg/2μl、1pg/2μl、100fg/2μl、10fg/2μl、1fg/2μl。对各浓度RNA用实施例3步骤（一）的RT-LAMP方法进行检测，直接可视化观察结果，并用一步RT-PCR方法同时进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。H1亚型的检测结果显示，反应前，所有反应液在可见光下均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光；反应后，加入A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)的RNA含量为1ng/2μl、100pg/2μl、10pg/2μl、1pg/2μl、100fg/2μl和10fg/2μl的管中可见光下均为浅绿色，在紫外线下均可见很强的绿色荧光（图1）。可见，本发明对H1亚型禽流感病毒RNA的最小检测限10fg，灵敏度是RT-PCR的1000倍。
N2亚型的检测结果显示，反应前，所有反应液在可见光下均为浅桔色，在紫外线下无绿色荧光；反应后，加入A/Duck/Guangxi/D/2011(H1N2)RNA含量为1ng/2μl、100pg/2μl、10pg/2μl、1pg/2μl和100fg/2μl的管中可见光下均为浅绿色，在紫外线下均可见很强的绿色荧光（图2）。可见，本发明对H1N2亚型禽流感病毒RNA的最小检测限100fg，灵敏度是RT-PCR的100倍。
其中，RT-PCR方法检测H1亚型的引物为上述F3-H1和B3-H1；RT-PCR方法检测N2亚型的引物为上述F3-N2和B3-N2。
实施例6、实施例3的RT-LAMP试剂盒的准确性
利用实施例3的检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒和检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的RT-LAMP试剂盒按照实施例3步骤（一）的RT-LAMP方法进行检测（表2中以RT-LAMP表示）。临床样品为活禽市场鸡泄殖腔喉气管、泄殖腔棉拭子及感染鸡、健康鸡的喉气管、肺、脑、脾混合组织悬液，样品同时用鸡胚接种病毒分离方法（甘孟侯.禽流感[M].北京:中国农业出版社，2002：110-114）、传统的RT-PCR方法、本发明建立的RT-LAMP方法对临床样品进行检测。检测结果见表3。表3病毒分离、RT-PCR、RT-LAMP方法检测H1N2亚型AIV临床样品
其中，RT-PCR方法检测H1亚型的引物为上述F3-H1和B3-H1；RT-PCR方法检测N2亚型的引物为上述F3-N2和B3-N2。
从实施例4-6的实验结果可以看出，本发明灵敏、特异、操作简便，适合在基层进行H1亚型和H1N2禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
Claims (10)
1.检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。
2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物中，各简并引物的摩尔数为1.6μmol所述简并引物FIP-H1、1.6μmol所述简并引物BIP-H1、0.2μmol简并引物F3-H1、0.2μmol简并引物B3-H1、0.8μmol简并引物LF-H1、0.8μmol简并引物LB-H1、1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol简并引物F3-N2、0.2μmol简并引物B3-N2、0.8μmol简并引物LF-N2和0.8μmol简并引物LB-N2。
3.检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒均包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和权利要求1或2所述的成套引物。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒中包括二套独立包装的试剂，分别为反应试剂A和反应试剂C；所述反应试剂A含有1.6μmol所述简并引物FIP-H1、1.6μmol所述简并引物BIP-H1、0.2μmol所述简并引物F3-H1、0.2μmol所述简并引物B3-H1、0.8μmol所述简并引物LF-H1、0.8μmol所述简并引物LB-H1、1mmol所述dATP、1mmol所述dCTP、1mmol所述dGTP、1mmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和1mmol所述甜菜碱；
所述反应试剂C含有1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol所述简并引物F3-N2、0.2μmol所述简并引物B3-N2、0.8μmol所述简并引物LF-N2、0.8μmol所述简并引物LB-N2、1mmol所述dATP、1mmol所述dCTP、1mmol所述dGTP、1mmol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和1mmol所述甜菜碱。
5.权利要求1或2所述成套引物在制备检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用，所述检测或辅助检测H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂或试剂盒为权利要求3或4所述的试剂或试剂盒。
6.检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12。
7.根据权利要求6所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物中，各简并引物的摩尔数为1.6μmol所述简并引物FIP-N2、1.6μmol所述简并引物BIP-N2、0.2μmol简并引物F3-N2、0.2μmol简并引物B3-N2、0.8μmol简并引物LF-N2和0.8μmol简并引物LB-N2。
8.检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒均包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、反转录酶、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和权利要求6或7所述的成套引物。
9.权利要求6或7所述成套引物在制备检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述N2亚型禽流感病毒为H1N2亚型禽流感病毒。
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