CN104450962A - 草鱼呼肠孤病毒i型ii型iii型rt-lamp荧光检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

草鱼呼肠孤病毒i型ii型iii型rt-lamp荧光检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法，属于靶DNA片断的检测技术领域。该试剂盒包括病毒RNA提取试剂和RT-LAMP荧光反应试剂，所述的RT-LAMP荧光反应试剂中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型、II型和III型的RT-LAMP扩增用核酸引物组和荧光染料，该荧光染料为SYTO9。该试剂盒检测特异性强，敏感性高，检测时间短（最快15分钟可出结果），具有巨大的优势和创新性。

Description

草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于靶DNA片断的检测技术领域，具体涉及一种利用反转录环介导等温扩增(reverse-transcription,Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)技术与荧光显色技术快速同时检测草鱼呼肠孤病毒三种基因型的试剂盒及检测方法。
背景技术
草鱼出血病病毒是中国分离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70-80nm，20面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA，被定名为草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，简称GCRV）。不同地区存在不同的毒株。目前已报道了10个分离株，该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成巨大损失。目前己经报道了近20个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRV GD10、GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，有报道的只有GCRV 873株、GCRV HZ08、GCRV GD10和GCRV104已完成全基因组序列分析，而其它毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，根据目前的研究，草鱼呼肠孤病毒根据基因分型，至少被分为三类：基因I型（代表株为873株），基因II型（代表株为HZ08株），基因III型（代表株为104株）。这三个基因型的草鱼呼肠孤病毒常常单独感染草鱼，也常出现混合感染的现象。
检测草鱼呼肠孤病毒的方法很多，有电镜观察法、细胞培养病毒分离法、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、免疫检测法、RT-PCR方法和RT-LAMP方法等。电镜观察法和细胞培养病毒分离法虽然经典，但是操作繁琐、花费时间长，并且不能区分草鱼呼肠孤病毒与其它病毒的感染；免疫学方法在敏感性和特异性上较差，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题；RT-PCR方法，具有很大优势，但需要对扩增产物进行凝胶电泳，其中用到的核酸EB染料具有致癌性，对人造成潜在安全。RT-LAMP结合荧光染料建立的方法，与其它方法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染，并且根据荧光信号强弱，可在检测过程中实时观察结果，通常20分钟以内就可判断结果，在操作性和时效性上具有巨大的优势。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒。本试剂盒包含了检测基因I型、基因II型、基因III型的草鱼呼肠孤病毒所必须的恒温扩增引物、荧光染料和其它优化的试剂组合。该试剂盒检测特异性强，敏感性高，检测时间短（最快15分钟可出结果），具有巨大的优势和创新性。
本发明的另一个目的在于提供一种利用草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。本方法可以在60分钟内准确检测出样品中的三种基因型的草鱼呼肠孤病毒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，包括荧光反应液，反应酶,密封液，DEPC水，阳性对照和阴性对照。其特征在于所述的荧光反应液中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型II型III型的恒温扩增用核酸引物组和荧光染料，该引物组包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-BIP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、引物GCRV2-FIP、引物GCRV2-BIP、引物GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、引物GCRV2-LF、引物GCRV2-LB、引物GCRV3-FIP、引物GCRV3-BIP、引物GCRV3-F3、引物GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物GCRV3-LB；
所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；
所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；
所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；
所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；
所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；
所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；
所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO：13所示；
所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；
所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；
所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；
所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；
所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示；
所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP荧光反应试剂包括以下组分：
1）荧光反应液：38～42mM pH为8.5～9.0的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.4～1.6 M甜菜碱、0.05～0.1μM SYTO 9、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB； 
2）反应酶：每1.5μL含8个活性单位的Bst 聚合酶和5个活性单位的AMV反转录酶；
3）密封液：无核酸酶的液体石蜡油。
所述的病毒RNA提取试剂包含以下组分：含有5～15 mM Tris、120～150 mM NaCl、0.6～1% NP-40、0.1～0.2% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、1%β-巯基乙醇，pH 8.0的裂解液；异丙醇，浓度100%；异丙醇，浓度55%；乙醇，浓度70%。
所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒进行RT-LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）RNA抽提：取草鱼内脏组织0.03～0.05g或草鱼培养细胞，采用病毒RNA提取试剂样品中的总RNA；
2）草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP荧光扩增：
①根据待检测RNA的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；
②吸取所述的荧光反应液体积为N×12.5 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N×1.5μL反应酶和N×6μL去离子水，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；
③向设定的N个RT-LAMP反应管中分别加入20uL步骤②得到的混合液，得到N个RT-LAMP反应管，向上述N个RT-LAMP反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各5uL；
④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入20uL密封液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心10秒；
⑤在带荧光检测的反应仪（荧光定量PCR仪或恒温荧光检测仪）中63℃下反应60分钟，实时查看荧光值。
所述的LAMP检测试剂盒还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的阴性对照试样为无核酸酶的去离子水。
与现有技术相比，本发明具有如下优点:
（1）本发明根据靶基因序列设计了草鱼呼肠孤病毒检测用引物组，能特异性识别草鱼呼肠孤病毒I型II型III型靶序列上的八个独立区域，在AMV反转录酶和BstDNA聚合酶的作用下启动反转录反应和链置换反应，在靶标区启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物，由于LAMP技术只有在四条引物完全识别靶序列六个结合区的情况下才能顺利进行，所以本发明的引物组在很大程度上减少了扩增反应的背景影响，大大增强了草鱼呼肠孤病毒检测的特异性；
（2）采用本发明的引物组能同时对基因I型II型III型的草鱼呼肠孤病毒进行检测，结合核酸荧光染料的使用，可以在出现微量扩增的情况下，就能通过荧光检测器检出荧光信号，因为特异性和灵敏度高，所以可以根据荧光值的变化就能判断病毒核酸的存在与否；
（3）本发明的快速诊断试剂盒是利用逆转录环介导等温扩增技术快速检测草鱼呼肠孤病毒，检测灵敏度高；
（4）本发明的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且能通过荧光检测仪实时观察结果，最快17分钟就可以判断检测结果；
（5）本发明的快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定。
附图说明
图1 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA荧光扩增测试图；
A1：基因I型草鱼呼肠孤病毒RNA； A2：基因II型草鱼呼肠孤病毒RNA； A3：基因III型草鱼呼肠孤病毒RNA；A4：阴性对照。
图2 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒cDNA荧光扩增测试图；
A1：基因I型草鱼呼肠孤病毒cDNA； A2：基因II型草鱼呼肠孤病毒cDNA； A3：基因III型草鱼呼肠孤病毒cDNA； A4：基因I型和II型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； A5：基因I型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； A6：基因II型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； A7：基因I型、II型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； A8：阴性对照。
图3 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒cDNA荧光扩增测试电泳图；
M：DL1000 Marker； 1：基因I型草鱼呼肠孤病毒cDNA； 2：基因II型草鱼呼肠孤病毒cDNA； 3：基因III型草鱼呼肠孤病毒cDNA； 4：基因I型和II型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； 5：基因I型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； 6：基因II型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； 7：基因I型、II型和III型草鱼呼肠孤病毒cDNA混合物； N：阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1
1）用RNA提取试剂抽提RNA：
取草鱼脾脏或肝脏或肾脏组织0.03～0.05g，于冰上离心管中用研磨棒研磨，加600 μL 裂解液（裂解液含有5～15 mM Tris、120～150 mM NaCl、0.6～1% NP-40、0.1～0.2% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、1%β-巯基乙醇，pH 8. 0）后，继续研磨充分后，室温静置10分钟，然后加入900 μL的异丙醇混匀，室温5分钟，之后11000g离心10分钟，去除上清液，沉淀中加入800 μL 百分比浓度为50%的冷异丙醇，11000g离心3分钟，去除上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温干燥5～10min后以30μL去离子水重悬。
2）草鱼呼肠孤病毒的RT-LAMP荧光扩增：
根据待检测RNA的数目，设置所需RT-LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；吸取所述的荧光反应液（荧光反应液含有38～42mM pH为8.5～9.0的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.4～1.6 M甜菜碱、0.05～0.1μM SYTO 9、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB）体积为N×12.5 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入N×1.5μL反应酶和N×6μL去离子水，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，得到N×20 μL的预混液，再分别向设定的N个RT-LAMP反应管中加入20 uL预混液，得到N个RT-LAMP反应管，向上述N个RT-LAMP反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检RNA模板和阳性对照各5uL；然后在每个反应管中再分别加入20 uL由液体石蜡油组成的密封液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；在63℃下恒温反应60分钟，实时查看荧光值，当荧光值短时段出现较大上升时，判断为阳性。反应结束后也可用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外分析仪下观察，可发现阶梯状的扩增特征条带，说明样品中有草鱼呼肠孤病毒。
实施例1中RNA提取试剂的裂解液也可以采用含8～12 mM Tris、120～150 mM NaCl、0.8～1% NP-40、0.1～0.15% SDS、4～5mol/L异硫氰酸胍、1%β-巯基乙醇，pH 8.0的裂解液；或采用含5～15 mM Tris、130～150 mM NaCl、0.6～1% NP-40、0.15～0.2% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、1%β-巯基乙醇，pH 8.0的裂解液。
实施例1中RT-LAMP荧光反应试剂的荧光反应液也可以采用含有38～42mM pH为8.5～9.0的Tris-HC1、10～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.5～1.6 M甜菜碱、0.03～0.1μM SYTO 9、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB的荧光反应液。
上述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；上述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；上述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；上述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；上述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；上述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；上述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；上述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；上述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；上述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；上述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；
上述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；上述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO：13所示；上述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；上述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；上述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；上述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；上述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示。
采用上述快速诊断试剂盒和方法进行RT-LAMP荧光法检测三种基因型的草鱼呼肠孤病毒RNA和cDNA，试验结果如附图1、2和3所示。
图1 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒RNA荧光扩增测试图，如图所示，三种基因型的草鱼呼肠孤病毒RNA，在25分钟以内就可以检测到阳性荧光峰图，阴性对照在60分钟之内未出荧光峰。
图2 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒cDNA荧光扩增测试图，如图所示，三种基因型的草鱼呼肠孤病毒单独或不同组合的cDNA，在6.5～13分钟就可以检测出所有样品的荧光峰图，阴性对照在50分钟之内未出荧光峰。
图3 试剂盒对草鱼呼肠孤病毒cDNA荧光扩增测试电泳图，如图所示，三种基因型的草鱼呼肠孤病毒单独或不同组合的cDNA，反应50分钟后都出现典型的阶梯状扩增条带，阴性对照在50分钟之内都未见扩增条带。 
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  浙江省淡水水产研究所
 
<120>  草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法
 
<130>  1
 
<160>  18   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  1
aatcgctcgt atcgcatt                                                   18
 
 
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  2
tggtggagag gttcatgt                                                   18
 
 
<210>  3
<211>  41
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  3
tgctcgacgt tgcacttgat tttctcctaa tcgctgccat c                         41
 
 
<210>  4
<211>  44
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  4
cgctccatca tgcctctcaa tttttgatgt agttggcgac taag                      44
 
 
<210>  5
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<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  5
ccatcgtgac ttcagcgt                                                   18
 
 
<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工合成
 
<400>  6
ttcagcaagc catctccg                                                   18
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工合成
 
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aaatgatcca ttctcaccc                                                  19
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工合成
 
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ccaccataat ggtccaatat ac                                              22
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工合成
 
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gtgattgagc gttctgtggt attttgagca taccgctaac aatag                     45
 
 
<210>  10
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<212>  DNA
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taagcacatc gtgcgtggtt tttatgccat catctccttg a                         41
 
 
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cgtagtgagt taggaagtag tc                                              22
 
 
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tatgtcgatt cagcggaac                                                  19
 
 
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gactgtatcc gcaatcca                                                   18
 
 
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ccataaacgg tcttggatc                                                  19
 
 
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tatgaccttc tcttgcacag cttttactat agtcgccgat taca                      44
 
 
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actgttgtca acgtcgatgt tattttatga ccgataggaa gtaact                    46
 
 
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ccgctagtag ttgacaagtt                                                 20
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工合成
 
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cctgtgatgc ttgtgtca                                                   18
 
 

Claims (4)

1.草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂和RT-LAMP荧光反应试剂，其特征在于所述的RT-LAMP荧光反应试剂中含有用于检测草鱼呼肠孤病毒I型、II型和III型的RT-LAMP扩增用核酸引物组和荧光染料，该荧光染料为SYTO 9，该引物组包含引物GCRV1-FIP、引物GCRV1-BIP、引物GCRV1-F3、引物GCRV1-B3、引物GCRV1-LF、引物GCRV1-LB、引物GCRV2-FIP、引物GCRV2-BIP、引物GCRV2-F3、引物GCRV2-B3、引物GCRV2-LF、引物GCRV2-LB、引物GCRV3-FIP、引物GCRV3-BIP、引物GCRV3-F3、引物GCRV3-B3、引物GCRV3-LF、引物GCRV3-LB；
所述的引物GCRV1-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的引物GCRV1-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；
所述的引物GCRV1-F3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的引物GCRV1-B3序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的引物GCRV1-LF序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的引物GCRV1-LB序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的引物GCRV2-FIP序列如SEQ ID NO：7所示；
所述的引物GCRV2-BIP序列如SEQ ID NO：8所示；
所述的引物GCRV2-F3序列如SEQ ID NO：9所示；
所述的引物GCRV2-B3序列如SEQ ID NO：10所示；
所述的引物GCRV2-LF序列如SEQ ID NO：11所示；
所述的引物GCRV2-LB序列如SEQ ID NO：12所示；
所述的引物GCRV3-FIP序列如SEQ ID NO：13所示；
所述的引物GCRV3-BIP序列如SEQ ID NO：14所示；
所述的引物GCRV3-F3序列如SEQ ID NO：15所示；
所述的引物GCRV3-B3序列如SEQ ID NO：16所示；
所述的引物GCRV3-LF序列如SEQ ID NO：17所示；
所述的引物GCRV3-LB序列如SEQ ID NO：18所示。
2.如权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于所述的RT-LAMP荧光反应试剂包括以下组分：
1）荧光反应液：38～42mM pH为8.5～9.0的Tris-HC1、9～11mM硫酸镁、19～21mM氯化钾、19～21mM硫酸按、0.2% Triton X-100、2.6～2.8 mM dNTP、1.4～1.6 M甜菜碱、0.05～0.1μM SYTO 9、3.0～3.2μM引物GCRV1-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV1-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV2-BIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-FIP、3.0～3.2μM引物GCRV3-BIP、0.3～0.5μM引物GCRV1-F3、0.3～0.5μM引物GCRV1-B3、0.3～0.5μM引物GCRV2-F3、0.3～0.5μM引物GCRV2-B3、0.3～0.5μM引物GCRV3-F3、0.3～0.5μM引物GCRV3-B3、1.4～1.6μM引物GCRV1-LF、1.4～1.6μM引物GCRV1-LB、1.4～1.6μM引物GCRV2-LF、1.4～1.6μM引物GCRV2-LB、1.4～1.6μM引物GCRV3-LF和1.4～1.6μM引物GCRV3-LB； 
2）反应酶：每1.5μL含8个活性单位的Bst DNA聚合酶和5个活性单位的AMV反转录酶；
3）密封液：由矿物油或液体石蜡油组成。
3.如权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征在于所述的病毒RNA提取试剂包含以下组分：含有5～15 mM Tris、120～150 mM NaCl、0.6～1% NP-40、0.1～0.2% SDS、3～5mol/L异硫氰酸胍、1%β-巯基乙醇，pH 8.0的裂解液；异丙醇，浓度100%；异丙醇，浓度55%；乙醇，浓度70%。
4.如权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RT-LAMP荧光检测试剂盒，其特征是还具有阳性对照试样和阴性对照试样，所述阳性对照试样为草鱼呼肠孤病毒I型II型III型RNA混合物，所述的阴性对照试样为无核酸酶的去离子水。
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CN107881155A (zh) * 2017-11-21 2018-04-06 上海海洋大学 表达草鱼呼肠孤病毒刺突蛋白vp55的重组杆状病毒及应用
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