CN103276091A

CN103276091A - 一种检测hiv前病毒dna的试剂盒

Info

Publication number: CN103276091A
Application number: CN2013102188082A
Authority: CN
Inventors: 厉小玉; 吴亦栋; 韦翊
Original assignee: HANGZHOU CHILDREN'S HOSPITAL
Current assignee: HANGZHOU CHILDREN'S HOSPITAL
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明公开了一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒，试剂盒内为恒温扩增试剂，该恒温扩增试剂包含引物LTR-F3、引物LTR-B3、引物LTR-FIP和引物LTR-BIP的水溶液、MgCl₂的水溶液、dNTP的水溶液、10×betaine缓冲液、20×SYBR染料、BstDNA聚合酶和3.9ul无菌注射用水；本发明在成功合成环介导恒温扩增反应体系后再将该体系与荧光染料结合，随着扩增的进行，SYBRGreenI荧光染料与扩增片段结合，被荧光定量PCR仪记录荧光强度，最终根据荧光强度给出病毒含量。

Description

一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种环介导恒温扩增检测试剂盒，具体涉及一种将环介导恒温扩增技术结合荧光染料技术来定量检测HIV病毒与宿主细胞染色体DNA整合后的HIV前病毒基因即HIV前病毒DNA的试剂盒。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）、原位杂交等技术的应用，使得HIV检测的敏感度和特异性有了很大的提高。但是这些技术专业的仪器设备和操作人员，在适用性上具有一定局限性。日本学者Notomi等发明了一种新的核酸扩增技术-环介导恒温扩增技术，反应依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条特异引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，可在恒温条件下（62℃左右）高效（30min～1h）扩增目标DNA。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成颈环结构和多环花椰菜样结构DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。该技术特异性强、灵敏度高、设备要求低、操作简便，与其他技术相比具有明显优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒，试剂盒内为恒温扩增试剂，该恒温扩增试剂包含：1ul浓度为5umol/L的引物LTR-F3的水溶液、1ul浓度为5umol/L的引物LTR-B3的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-FIP的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-BIP的水溶液、1.8ul浓度为25mmol/L的MgCl₂的水溶液、 0.6ul 浓度为10 mmol/L的dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的水溶液、1.5ul的10×betaine缓冲液、0.4ul的20×SYBR染料、0.8ul的BstDNA聚合酶和3.9ul无菌注射用水等；其中，所述引物LTR-F3、引物LTR-B3、引物LTR-FIP和引物LTR-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果是，本发明根据HIV gag和pol基因序列设计了一套环介导恒温扩增引物，高效特异扩增目标基因，并比较了常规定量PCR和该环介导恒温扩增的敏感度、特异性，成功地建立了环介导恒温扩增技术快速检测HIV前病毒DNA试剂盒。本发明选择相对保守的6个序列区域设计4条引物进行环介导恒温扩增，在成功合成环介导恒温扩增反应体系后再将该体系与荧光染料结合（SYBR Green I）,随着扩增的进行，SYBR Green I荧光染料与扩增片段结合，被荧光定量PCR仪记录荧光强度，最终根据荧光强度给出病毒含量。

附图说明

图1为环介导等温扩增检测HIV-1DNA电泳图；图中，泳道M 为Marker, 泳道1为阴性对照，泳道2、3、4为HIV阳性标本，泳道5为 HIV-1DNA质粒样本。

具体实施方式

本发明检测HIV前病毒DNA的试剂盒，试剂盒内为恒温扩增试剂，该恒温扩增试剂包含：1ul浓度为5umol/L的引物LTR-F3的水溶液、1ul浓度为5umol/L的引物LTR-B3的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-FIP的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-BIP的水溶液、1.8ul浓度为25mmol/L的MgCl₂的水溶液、 0.6ul 浓度为10 mmol/L的dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的水溶液、1.5ul的10×betaine缓冲液、0.4ul的20×SYBR染料、0.8ul的BstDNA聚合酶和3.9ul无菌注射用水。

其中，引物LTR-F3、引物LTR-B3、引物LTR-FIP和引物LTR-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.4所示。

10×betaine缓冲液可以采用美国Sigma公司的产品，20×SYBR染料可以采用美国Gene公司的产品。BstDNA聚合酶可以采用美国New England Biolabs公司的产品，但均不限于此。

本发明试剂盒使用方法如下：

1、外周血DNA提取：采用商品化试剂盒（Qiagen Blood DNA Mini Kit）①取全血1ml加入2ml的Buffer RBL轻轻震荡混匀，10000rpm离心2分钟，小心取上清（如沉淀中红细胞较多重复加2ml的Buffer RBL洗涤）。②向沉淀中加200ul Buffer GR混匀再加20ul Protrase混匀再加200ulBuffer GL,剧烈颠倒15次以上，放入56℃孵育10分钟，期间颠倒混匀数次。③向混合物中加入200ul的无水酒精混匀。④将所有混合物完全加入已装入收集管（Collectior Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中，10000rpm离心2分钟。⑤向柱中加入500ul的Buffer GW1，10000rpm离心2分钟，再向柱中加500ul的Buffer GW2，10000rpm离心2分钟。⑥将吸附柱取出置入新的无菌离心管中，再加入50ul的Buffer GE或去离子水，室温放置5分钟，10000rp离心2分钟，收集到的DNA模板即可备用。

2、HIV-1DNA检测：采用荧光定量环介导等温扩增技术检测HIV-1DNA,具体方法是：将2ul步骤1收集的DNA模板加入本发明的试剂盒中，在ABI7900荧光定量PCR 62℃扩增方式进行扩增，即可进行HIV-1DNA检测。

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1：环介导恒温扩增结合荧光染料技术检测HIV前病毒DNA特异性和敏感度实验

一、材料：

选取临床引起病毒性等感染的HBV、HCV、UU、CT、HSV等阳性样本各10例，同时构建HIV扩增阳性质粒，对该特定的质粒进行依次10倍稀释后进行敏感度实验，上述毒株均由杭州市第六人民医院细菌室提供。

二、环介导恒温扩增结合荧光染料技术检测HIV前病毒DNA特异性：

对该套引物的特异性做了考核，采用HBV-DNA、HCV-RNA、Uu-DNA、CT-DNA、HSV-DNA阳性的标本各10例进行HIV-1DNA检测,结果全阴性，即该方法的特异性100%；

三、环介导恒温扩增结合荧光染料技术检测HIV前病毒DNA敏感度：

对HIV特定的质粒进行10倍稀释后进行检测,发现最低检出限在50copies/ml。

实施例2：环介导恒温扩增结合荧光染料技术检测HIV前病毒DNA临床应用

一、标本检测：

所选200例HIV感染者均为杭州市第六人民医院自2011年4月-2012年12月期间的住院和门诊患者，所有患者均经杭州市（或浙江省）疾病预防控制中心确诊为HIV感染者。年龄分布19岁～62岁,平均年龄为34.5岁。其中男性145例，女性55例。50例健康对照组为本院职工体检血样。

二、对照检测试剂盒：

HIV-1RNA检测试剂盒采用中山大学达安基因股份有限公司生产的实时荧光RT-PCR检测HIV-RNA试剂盒进行，该试剂盒获得国家SFDA认证，按照RNA提取方法，将已逆转录好的模板取5ul加入套式PCR的第一轮扩增试剂混合物中按93℃30秒，55℃60秒，72℃30秒运行35个循环后，取产物2ul加入第二轮的实时荧光定量PCR反应体系中，在Stepone Plus实时荧光定量PCR仪中按93℃2分钟，93℃45秒，55℃60秒运行10个循环，93℃30秒，55℃45秒运行35个循环，存盘分析结果。

三、临床样品检测结果比较：

200例HIV感染者外周血淋巴细胞HIV-1DNA荧光定量结果，共检出195例，检出率为97.5%，最低含量为51Copies/ml,最高含量为8.21×10⁶Copies/ml,平均值含量为5.78×10⁵Copies/ml， 50例健康对照HIV-1DNA均阴性。

200例HIV感染者血浆HIV-1RNA对照检测结果，HIV-1RNA检测采用国家SFDA批准荧光定量PCR技术，共检出112例，阳性率为56%，HIV-1RNA定量检测结果在2.17×10²～3.18×10⁶Copies/ml，平均含量为7.18×10⁴Copies/ml。

本自行研制的方法检测阳性率97.5%（195/200），用国家SFDA批准的对照试剂盒阳性率 56% （112/200），前者明显高于后者，差异有统计学意义P<0.01。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州市儿童医院

<120> 一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacaaggcta cttccctg 18

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgcagctc tcgggc 16

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actagcttga agcaccatcc attggcavaa ctacacacca g 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgytacac cctatgagca aacttccaca ctaayacttc 40

Claims

1.一种检测HIV前病毒DNA的试剂盒，其特征在于，试剂盒内为恒温扩增试剂，该恒温扩增试剂包含：1ul浓度为5umol/L的引物LTR-F3的水溶液、1ul浓度为5umol/L的引物LTR-B3的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-FIP的水溶液、1ul浓度为40umol/L的引物LTR-BIP的水溶液、1.8ul浓度为25mmol/L的MgCl₂的水溶液、 0.6ul 浓度为10 mmol/L的dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的水溶液、1.5ul的10×betaine缓冲液、0.4ul的20×SYBR染料、0.8ul的BstDNA聚合酶和3.9ul无菌注射用水等；其中，所述引物LTR-F3、引物LTR-B3、引物LTR-FIP和引物LTR-BIP的DNA序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.4所示。