CN103773853A - 一种基于lamp技术的番茄细菌性溃疡病的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法。所述检测方法包括LAMP引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP扩增体系建立，LAMP扩增方法，所述的LAMP扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min内完成扩增，引物包括外引物、内引物；所述方法操作简便，成本低廉、高灵敏度、检测特异性大于99%、高特异性、不易污染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法。
背景技术
番茄溃疡病是番茄生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一。其病原菌为密执安棒杆菌密执安亚种，即Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，简称Cmm。
该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，现己广泛分布于美国各番茄产区，并逐渐成为世界性病害。20世纪年代、60年代和80年代，番茄溃疡病在美国中西部地区、北卡罗来那州及加拿大安大略地区大流行，造成的产量损失最高达以上。一年期间，该病在英国大流行，使番茄罐头工业受到严重影响。目前， 在美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲的多个国家都有番茄溃疡病发生危害的报道。我国有关番茄溃疡病的记载始于1981年，目前番茄溃疡病在我国北京、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、河北、山西、山东、上海、海南等省、市、自治区都有发生， 使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响。因此， 我国1995年将该病原菌列入《全国植物检疫对象名单》， 2007年列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
目前国内通用的GB、SN等标准采用培养、生化反应等表型检测方法和PCR、基因芯片和测序比对等分子检测方法辅助相结合的方法，检验周期需要2-7天，且操作复杂，成本较高，难以适应当代贸易中快速检验的客观需求。尤其是在田间地头和码头海港等野外工作条件下，不具备PCR往往无法开展快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，以满足对出入境检验检疫中番茄细菌性溃疡病的鉴定。
实现本发明的技术方案为：
一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；
所述的外引物是Cmm-F3 和Cmm-B3 ；
所述的内引物是Cmm-FIP 和Cmm-BIP；
所述引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
其中，所述模板DNA提取指番茄组织DNA的提取，离心提取其上清液，具体步骤为：
称取80mg样品，加入到2ml的离心管中；加入600μL裂解液充分混匀。65℃温浴至少30分钟。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm离心4min。将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；若上清很混浊可以再加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）颠倒混匀，13000rpm离心4min,将上清液转移至另一干净的离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm离心4min，弃上清，加入600μL 70%乙醇，13000rpm离心4min，弃上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。
所述LAMP 扩增体系建立是采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：
模板DNA 2μL
2×U-LAMP MIX 17μL
Cmm-F3 5uM， 1μL
Cmm-B3 5uM， 1μL
Cmm-FIP 40uM， 1μL
Cmm-BIP 40uM， 1μL
Bst DNA 酶 8 U/μL， 1μL
荧光染料 1μL。
所述LAMP扩增方法采用实时荧光PCR仪，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入反应器中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。
所述LAMP扩增方法采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。
本发明与现有技术相比其显著优点是：（1）操作简便，成本低廉。环介导等温扩增（LAMP）方法是具有与PCR技术同等甚至超越的优势，加之对仪器设备要求宽松，不用PCR仪，简单易行，周期短至1小时，可缩短检验周期50%以上，可实现大量样品的快速检测，适合进行现场及大量样品的高通量检测。（2）高灵敏度。检测灵敏度高于普通PCR2-3个数量级，检测敏感性为100-10000cfu/mL，检测特异性大于99%。（3）高特异性。所检测的阴性对照株均无阳性结果出来。（4）不易污染。本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料，上机检测过程不需要开盖，可以有效避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。提高了检测的重复性，降低了检测的假阳性。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1 是本发明LAMP 方法特异性扩增曲线图；（1为番茄细菌性溃疡病菌；2-6为苜蓿细菌性萎蔫病菌；玉米内州萎蔫病菌；马铃薯环腐病菌；菜豆细菌性萎蔫病菌；郁金香黄色疱斑病菌；番茄细菌性叶斑病菌）。
图2 是本发明LAMP 方法检测番茄样品电泳结果图；（M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：阴性对照；2-7 ：待检番茄样品）。
具体实施方式
下面结合基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的方法的实例说明本发明的具体实施方式。
实施例1
基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；
所述的外引物是Cmm-F3 和Cmm-B3 ；
所述的内引物是Cmm-FIP 和Cmm-BIP；
所述引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
具体步骤为：
步骤一，模板DNA的提取：称取80mg菌体组织。加入到2ml的离心管中；加入600μL裂解液充分混匀。65℃温浴至少30分钟。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm离心4min。将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；若上清很混浊可以再加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）颠倒混匀，13000rpm离心4min,将上清液转移至另一干净的离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm离心4min，弃上清，加入600μL 70%乙醇，13000rpm离心4min，弃上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。
步骤二，引物设计和合成：引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
步骤三，LAMP 扩增体系建立：采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：
模板DNA 2μL
2×U-LAMP MIX 17μL
Cmm-F3 5uM， 1μL
Cmm-B3 5uM， 1μL
Cmm-FIP 40uM， 1μL
Cmm-BIP 40uM， 1μL
Bst DNA 酶 8 U/μL， 1μL
荧光染料 1μL。
步骤四，LAMP扩增：将按照LAMP扩增体系配制好的试剂放入八联管，置于实时荧光PCR仪中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。根据管中荧光的的情况即可判断该番茄样品是否携带细菌性溃疡病病菌。
分别选取番茄细菌性溃疡病菌；苜蓿细菌性萎蔫病菌；玉米内州萎蔫病菌；马铃薯环腐病菌；菜豆细菌性萎蔫病菌；郁金香黄色疱斑病菌；番茄细菌性叶斑病菌菌体组织经过DNA提取后，配制LAMP扩增体系，使用实时荧光PCR仪作为反应器，进行LAMP检测，经过实时荧光扩增之后，观察荧光曲线图，从图1可以看出：2-6病原菌均未出现扩增信号，而仅有目标病原菌番茄细菌性溃疡病菌出现明显的扩增信号，判定为检出。
实施例2
基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；
所述的外引物是Cmm-F3 和Cmm-B3 ；
所述的内引物是Cmm-FIP 和Cmm-BIP；
所述引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
具体步骤为：
步骤一，模板DNA的提取：称取待检番茄样品各80mg，加入到2ml的离心管中；加入600μL裂解液充分混匀。65℃温浴至少30分钟。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm离心4min。将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；若上清很混浊可以再加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）颠倒混匀，13000rpm离心4min,将上清液转移至另一干净的离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm离心4min，弃上清，加入600μL 70%乙醇，13000rpm离心4min，弃上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。
步骤二，引物设计和合成：引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
步骤三，LAMP 扩增体系建立：采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：
模板DNA 2μL
2×U-LAMP MIX 17μL
Cmm-F3 5uM， 1μL
Cmm-B3 5uM， 1μL
Cmm-FIP 40uM， 1μL
Cmm-BIP 40uM， 1μL
Bst DNA 酶 8 U/μL， 1μL
荧光染料 1μL。
步骤四，LAMP扩增：采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。根据电泳的情况，出现梯状条带与否，即可判断番茄样品是否携带细菌性溃疡病病菌。
分别选取田间采集的6份待检番茄组织经过DNA提取后，配制LAMP扩增体系，加入到PE反应管，使用水浴锅作为反应器，进行LAMP检测，经过LAMP扩增之后，将反应管从水浴锅取出，进行普通电泳。采用3ul产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳45min，在凝胶成像系统系统下观察。从图2可以看出：阴性对照未出现梯状条带，2-6样品均出现梯状条带，判定为检出；7号样品未出现梯状条带，判定为未检出。
Claims (5)
1.一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；
所述的外引物是Cmm-F3 和Cmm-B3 ；
所述的内引物是Cmm-FIP 和Cmm-BIP；
所述引物序列自5' 端到3' 端如下：
Cmm-F3 CGCTCATGGGTGGAACAT
Cmm-B3 CGGAAAGGGTCCGACAAG
Cmm-FIP ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA
Cmm-BIP CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述模板DNA提取指番茄组织DNA的提取。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP 扩增体系建立是采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：
模板DNA 2μL
2×U-LAMP MIX 17μL
Cmm-F3 5uM， 1μL
Cmm-B3 5uM， 1μL
Cmm-FIP 40uM， 1μL
Cmm-BIP 40uM， 1μL
Bst DNA 酶 8 U/μL， 1μL
荧光染料 1μL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增方法采用实时荧光PCR仪，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入反应器中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增方法采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。
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| CN (1) | CN103773853A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105200145A (zh) * | 2015-10-27 | 2015-12-30 | 吉林省蔬菜花卉科学研究院 | 一种快速检测番茄溃疡病菌的lamp引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105219871A (zh) * | 2015-11-04 | 2016-01-06 | 吉林省蔬菜花卉科学研究院 | 基于cytC基因检测番茄溃疡病菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276091A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-04 | 杭州市儿童医院 | 一种检测hiv前病毒dna的试剂盒 |
-
2013
- 2013-12-30 CN CN201310737212.3A patent/CN103773853A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103276091A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-04 | 杭州市儿童医院 | 一种检测hiv前病毒dna的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 封立平等: "番茄溃疡病菌的环介导等温核酸扩增技术检测方法", 《食品安全质量检测学报》, vol. 4, no. 4, 31 August 2013 (2013-08-31), pages 1207 - 1212 * |
| 闵现华等: "Nested-PCR检测种传番茄细菌性溃疡病菌", 《西北农业学报》, vol. 20, no. 7, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 28 - 31 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN105219871A (zh) * | 2015-11-04 | 2016-01-06 | 吉林省蔬菜花卉科学研究院 | 基于cytC基因检测番茄溃疡病菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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