CN101560570A - 检测番茄溃疡病菌的巢式nest-pcr的扩增引物及其检测试剂盒和试剂盒使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp，michiganensis，Cmm)Nest－PCR检测扩增引物及其试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest－PCR的扩增引物，其主要特点是：第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列为CMM－A：gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；CMM－a：gtacggctaccttgttacgacttagt；第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列为CMM－B：ccccgactctgggataactgcta；CMM－b：cggttaggccactggcttcgggtgttaccga；经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。试剂盒主要以两次PCR放大病原菌基因信号，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒。

Description

检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的扩增引物及其检测试剂盒和试剂盒使用方法

技术领域

本发明是一种番茄细菌性溃疡病菌的基因检测扩增引物及其试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对番茄细菌性溃疡病菌Clavibactermichiganensis subsp，michiganensis(Cmm)的检测。适用于番茄细菌性溃疡病菌的田间预防及进出口植物检疫中Cmm快速检测。

背景技术

番茄细菌性溃疡病是番茄最重要、危害性最大的病害之一。该病害可引起植株萎蔫、溃疡和果实斑点，严重影响果实的产量和质量。该病菌能侵染多种茄科植物并引起蔬菜大量减产，给农业生产带来巨大的经济损失。因而，目前欧洲、美洲、亚洲的大多数国家都将其列为重要的检疫对象。我国自从1981年首次在北京发现以来，辽宁、山西、黑龙江、新疆等地已相继报道该病的发生。甘肃省河西地区外繁种子基地是全国最大的对外制种基地，其中番茄对外制种已经有20年历史，面积占总制种面积的10-20％，近年来，已经在田间屡次发现番茄细菌性溃疡病，因此所有的外国公司都将其列为禁止携带的病害，由于我国目前对该病的研究很少，快速检测技术尚未建立，每年都因为未能及时准确的对该病进行快速、准确地鉴定而造成种子退货，给农户和制种公司带来巨大的经济损失。

该病病原属密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp，michiganensis)。种子是其远距离传播的主要途径，一般种传率在1％-5％，病菌还可存活于土壤和植物病残体中，存活期可长达2-3年。由于种子带菌率很低，传统的生物学方法很难快速地分离到病原，且程序烦琐；即使比较灵敏的酶联免疫(ELISA)法检测，也会造成漏检，且检测成本过高，无法适应口岸检疫所要求的快速、准确、灵敏的要求。90年代初期，国外学者将分子生物学方法用于该病的检测，检测灵敏度得到了极大的提高，最低检测限达到了100个细菌/反应体系。即便如此，在检测周期上却没有大的提高，且传统的DNA抽提过程损失了太多的病原菌，因而不可避免地降低了PCR方法应有的灵敏度。

中国专利200410041287.9公开了一种番茄溃疡病的检测试剂盒，最低检测限达到了50个细菌/反应体系。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物。

本发明的另一目的是公开了一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒及其使用方法。本发明对番茄种子进行简单快速的病原菌抽提，去除种子杂质和影响PCR反应的成分，获得相对纯净的细菌做为PCR扩增摸板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在12小时内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确、可靠，是一种行之有效的植物病原细菌分子生物学检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其主要特点是：

第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下：

CMM-A：gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；

CMM-a：gtacggctaccttgttacgacttagt；

第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下：

CMM-B：ccccgactctgggataactgcta；

CMM-b：cggttaggccactggcttcgggtgttaccga；

经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。

所述的检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其扩增条件为：

第一次第一组引物，其扩增条件为：PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

第二次第二组引物，其扩增条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，其主要特点是，包括有PCR缓冲液9×-10×，氯化镁25-20mmol/L；dNTP 9-10mmol/L，Taq酶2IU/μL；引物CMM-A和CMM-a各10-15pmol/μL，引物CMM-B和CMM-b各10-15pmol/μL，双蒸水99％～100％，检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。

一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为：

(1)植物病原细菌的收集和培养；

(2)第一对引物PCR扩增；

(3)以第一次扩增结果为模板对第二对引物PCR扩增；

(4)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(5)对条带进行分析得出结论。

所述的番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，所述的植物病原细菌的收集和培养的具体步骤是：

(a)制备抽提缓冲液：Na₂SO₃0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0.5ml/L，调制pH为7.4；抽提缓冲液使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1∶2-10。

(b)制备待检测材料：按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清液，5000rpm(转/每分钟)离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。

一种番茄溃疡病病菌的巢式Nest-PCR基因组DNA提取方法如下：

A.取1.5ml菌体培养物于灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1分钟，除去上清液，收集菌体；

B.在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM的醋酸钠，在1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH7.8的条件下混匀，置于37℃水浴1小时制得；

C.加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟)离心15分钟；

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

E.在上清液里，加两倍体积无水乙醇，上清液1/10体积的醋酸钾(3M，pH8.0)，-20℃保存1小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

本发明的有益效果是：本发明番茄细菌性溃疡病菌的检测试剂盒，涉及一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在12小时内就可以完成检测。

本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。

通过对番茄细菌性溃疡病菌的特异性检测，引物CMM-A，CMM-a，CMM-B，CMM-b优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了一段1297bp的PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种非目标菌，均无扩增产物。

通过灵敏度的检测，对番茄细菌性溃疡病菌纯菌液的直接PCR和Nest-PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为2600个细菌/ml，而Nested-PCR的最低检出量是13个细菌/ml。

通过对番茄检测，均可从带菌种子中准确稳定的检测到1297bp的PCR产物，和ELISA检测符合率为99％，且有1％的ELISA未检测到的带菌种子，该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。

对于番茄溃疡病，该试剂盒可以不经过DNA提取而以病原菌为模板直接进行一步法PCR检测，对纯菌液Direct-PCR最低检出限为2600个细菌/ml，而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml；对种子提取液，Direct-PCR不能检出，而Nested-PCR最低检出限可达到3×10⁵个细菌/ml。

附图说明

图1是试剂盒使用流程图；

图2是本试剂盒引物特异性的验证和PCR条件优化；

其中：M：200bp DNA ladder；W：水。

图3是纯菌液的Nested-PCR检测灵敏度结果；

其中：1、2.6×105cells/ml；2、2.6×104cells/ml；3：2.6×103cells/ml；4、2.6×102cells/ml；5、26cells/ml；6、3cells/ml；M、200bpDNA ladder；W、水。

图4是种子提取液的Nested-PCR检测灵敏度结果；

其中：1、7×108cells/ml；2、6×107cells/ml；3、3×106cells/ml；4、3×105cells/ml；5、3×104cells/ml；6、3×103cells/ml；7、3×102cells/ml；M、200bp DNA ladder；W、水；T、番茄阳性质控物DNA。

图5对8种类非Cmm供试菌株的验证检测；

其中：M：marker 1；CMM 2-8：分别为丁香假单胞杆菌丁香致病型，番茄细菌性溃疡病，番茄细菌性叶斑病菌，番茄细菌性疮痂病，十字花科蔬菜黑腐致病变种，大豆细菌斑疹病，丁香假单胞杆菌丁香致病型，甜瓜细菌性叶斑病菌。

图6本发明实施例5出口番茄Cmm检测；

其中：M：marker，1-11出口番茄种子CMM的Nest-PCR检测。

图7本发明实施例6田间样品的Cmm检测。

其中：M：marker，1-4进口番茄种子CMM的Nest-PCR检测。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

试验例1：见图2，用CMM-A和CMM-a一对引物对四个番茄溃疡病菌基因组DNA进行检测，以测试试剂盒的有效性，结果发现，四个菌株均扩增到1487bp的目标条带，但作为对照的水无条带。

番茄溃疡病病菌基因组DNA提取方法如下：

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1分钟，丢去上清夜，收集菌体。

B.在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM的醋酸钠，在1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH7.8的条件下混匀，置于37℃水浴1小时制得；

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟)离心15分钟。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

试验例2：见图3，纯菌液的Nest-PCR检测灵敏度结果，结果表明，该试剂盒对于纯菌液的检测灵敏度为26cell/ml。

试验例3：见图4，对模拟种子带菌的Nest-PCR检测灵敏度，结果表明，该试剂盒对种子提取液的Nest-PCR检测灵敏度为3×10⁵cells/ml，比酶联免疫高一个数量级。

试验例4：见图5，对8种类非Cmm供试菌株的验证检测：

供试菌株：丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pvSyringae)，西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)，番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas.syringae pv tomato)，番茄细菌性疮痂病(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)，十字花科蔬菜黑腐致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)，大豆细菌斑疹病(Xanthomonas campestris phaseoli)，丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae)，甜瓜细菌性叶斑病菌(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)。

PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。

检测结果表明，见图5，以上八种供试菌，均未检出目标条带，说明试剂盒有比较好的专一性。

实施例1：一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，

第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下：

CMM-A：gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；

CMM-a：gtacggctaccttgttacgacttagt；

第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下：

CMM-B：ccccgactctgggataactgcta；

CMM-b：cggttaggccactggcttcgggtgttaccga；

所述的检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其扩增条件为：

第一次第一组引物，其扩增条件为：PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

第二次第二组引物，其扩增条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。

实施例2：一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，包括有PCR缓冲液10×，氯化镁25mmol/L；dNTP 10mmol/L，Taq酶2IU/μL；引物CMM-A和CMM-a各10pmol/μL，引物CMM-B和CMM-b各10pmol/μL，双蒸水99％～100％，检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。

实施例3：一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，包括有PCR缓冲液9×，氯化镁20mmol/L；dNTP 9mmol/L，Taq酶2IU/μL；引物CMM-A和CMM-a各15pmol/μL，引物CMM-B和CMM-b各15pmol/μL，双蒸水99％～100％，检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。

实施例4：所述试剂盒的使用方法，见图1，包括以下步骤：

(1)待检测材料的制备；按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分钟)离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。抽提缓冲液配方为：Na₂SO₃0.13g/ml，PVP2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与tween-20，PH 7.4。抽提缓冲液使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1∶2-10。

(2)第一对引物PCR扩增，PCR循环预变性增加到20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

(3)第二对引物PCR扩增，以第一次扩增产物为模板；PCR反应条件为：预变性94℃1分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

(4)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(5)对条带进行分析得出结论。

实施例5：对出口的11批番茄种子进行验证检测：

随机抽取经过ELISA检测的出口番茄种子23批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明，见图6，所检测的番茄种子均不携带Cmm，和ELISA检测结果完全符合。

实施例6：对进口的4批番茄种子进行验证检测：

随机抽取经过ELISA检测的进口番茄种子12批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明，见图7，所检测的番茄种子均不携带Cmm，和ELISA检测结果完全符合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心

<120>检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的扩增引物及其检测试剂盒和试剂盒使用方

     法

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1297

<212>DNA

<213>密执安棒形杆菌密执安亚种

<400>1

cggttaggcc actggcttcg ggtgttaccg actttcatga cttgacgggc ggtgtgtaca    60

aggcccggga acgtattcac cgcagcgttg ctgatctgcg attactagcg actccgactt    120

catgaggtcg agttgcagac ctcaatccga actgagaccg gctttttggg attcgctcca    180

ccttacggta tcgcagccct ttgtaccggc cattgtagca tgcgtgaagc ccaagacata    240

aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccga gttgaccccg gcagtctcct    300

atgagttccc accattacgt gctggcaaca tagaacgagg gttgcgctcg ttgcgggact    360

taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta taccgacctt    420

gcggggcaca catttctgca tgtttccggt atatgtcaag ccttggtaag gttcttcgcg    480

ttgcatcgaa ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag    540

ttttagcctt gcggccgtac tccccaggcg gggaacttaa tgcgttagct gcgacacgga    600

gaccgtggaa tggtccccac atctagttcc caacgtttac ggcatggact accagggtat    660

ctaatcctgt tcgctcccca tgctttcgct cctcagcgtc agttacggcc cagagatctg    720

ccttcgccat cggtgttcct cctgatatct gcgcattcca ccgctacacc aggaattcca    780

atctccccta ccgcactcta gtctgcccgt acccactgca gacccgaggt tgagcctcgg    840

gatttcacag cagacgcgac aaaccgccta cgagctcttt acgcccaata attccggaca    900

acgcttgcac cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccggt gctttttctg    960

caggtaccgt cactttcgct tcttccctac taaaagaggt ttacaacccg aaggccgtca    1020

tccctcacgc ggcgttgctg catcaggctt tcgcccattg tgcaatattc cccactgctg    1080

cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg gccggtcacc ctctcaggcc    1140

ggctacccgt cgtaggcttg gtgagccatt acctcaccaa caacctgata ggccgcgagt    1200

ccatccccaa ccgaaattct ttccacgacc agaccatgcg gccaatcgtc atatccggta    1260

ttagctacca tttctagcag ttatcccaga gtcgggg                             1297

Claims (6)

1.一种检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其特征是：

第一对引物上游长度为28bp，下游长度为26bp的核苷酸序列如下：

CMM-A：gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；

CMM-a：gtacggctaccttgttacgacttagt；

第二对引物上游长度为23bp，下游长度为31bp的核苷酸序列如下：

CMM-B：ccccgactctgggataactgcta；

CMM-b：cggttaggccactggcttcgggtgttaccga；

经过两次扩增，最终可得到分子量为1297bp的DNA产物。

2.如权利要求1所述的检测番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR的扩增引物，其特征是扩增条件为：

第一次第一组引物，其扩增条件为：PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌；释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环；

第二次第二组引物，其扩增条件为：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环。

3.一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒，其特征是，包括有PCR缓冲液9×-10×，氯化镁25-20mmol/L；dNTP 9-10mmol/L，Taq酶2IU/μL；引物CMM-A和CMM-a各10-15pmol/μL，引物CMM-B和CMM-b各10-15pmol/μL，双蒸水99％～100％，检测PCR管6个，阳性对照PCR管3个，阴性对照PCR管3个，阳性对照1管，阴性对照1管。

4.一种番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为：

(1)植物病原细菌的收集和培养；

(2)第一对引物PCR扩增；

(3)以第一次扩增结果为模板对第二对引物PCR扩增；

(4)1％-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(5)对条带进行分析得出结论。

5.如权利要求4所述的番茄溃疡病菌的巢式Nest-PCR快速检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的植物病原细菌的收集和培养的具体步骤是：

(a)制备抽提缓冲液：Na₂SO₃0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0.5ml/L，pH为7.4；

(b)制备待检测材料：按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清液，5000rpm(转/每分钟)(转/每分钟)离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。

6.一种番茄溃疡病病菌的巢式Nest-PCR基因组DNA提取方法如下：

A.取1.5ml菌体培养物于灭菌Ep管中，12000rpm离心1分钟，除去上清液，收集菌体；

B.在A步骤中收集的菌体中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM的醋酸钠，在1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8的条件下混匀，置于37℃水浴1小时制得；

C.加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

E.在上清液里，加两倍体积无水乙醇，上清液1/10体积的醋酸钾(3M，pH8.0)，-20℃保存1小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

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