CN107447049B - 一种快速检测土壤中病原微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用环介导恒温扩增检测土壤中病原微生物存在的方法。本发明方法包括环介导恒温扩增引物的获得、DNA的提取和扩增、所检测微生物的种类的判定。本发明实现了对土传病原微生物的高效、快速、定性检测，无需PCR扩增即可通过肉眼判断靶标微生物的存在。本发明适用于环境检测、食品检测、病原菌检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及环境检测领域，更具体地涉及土壤微生物检测领域，特别地涉及一种快速检测土壤中病原微生物的方法。
背景技术
土壤中存在数量巨大、种类繁多的微生物，它们中的绝大部分是有益的，在土壤发育、物质转化、结构形成、提高作物养分有效性、抑制病原菌活性等方面发挥着不可替代的作用。但是土壤中也存在着另一类引起作物病害的有害微生物，通称为土传病原微生物(soil-borne pathogens)。由生活在土壤中或残留在土壤的病株残体中的病菌引起的作物病害统称为土传病(soil-borne diseases)。
日前，在节能温室中栽培的瓜类、茄果类、豆类等蔬菜上已经发现的病害有100多种，经常发生、危害比较严重的有50余种，在这些病害当中，除黄瓜霜霉病等极少数病害是借助气流和人们的农事活动从温室外面传入外，而绝大多数真菌性、细菌性病害和部分病毒性病害，其病菌都是在土壤中或借助病残体在土壤中越冬。这些病害的初次侵染，几乎都是来自温室内的土壤。
防治土传病害，必须严格执行“以防为主、综合防治”的植保方针，以减少温室土壤菌源为首要目的，所以土传病原菌的快速检测及鉴定对于防治土传病害有至关重要的作用。
本发明提供一种快速检测土壤环境中土传病原菌的方法，具有特异性强、灵敏度高、恒温、操作简单和检测结果快速读取等优点。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种环境检测方法，包括利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在。
进一步地，所述微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物包括但不限于病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌包括但不限于立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌。
更进一步地，所述环境检测方法检测环境中土壤微生物的具体步骤为：
步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；
步骤2、按如下反应体系扩增土壤微生物总DNA样品：
双蒸水补足至20μL；
步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至常温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；
步骤4、所述引物用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌。
优选的，所述产物量可以通过肉眼观测浑浊度判定，如存在靶标微生物则反应液呈现浑浊状态，如不存在靶标微生物则反应液澄清。
进一步地，所述反应体系为：
双蒸水补足至50μL。
优选地，所述总DNA样品包括但不限于大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌的脱氧核糖核苷酸序列。
本发明属于“环介导的等温扩增”、“环介导的恒温扩增”“Loop-mediatedIsothermal Amplification”或LAMP技术是一种可替代PCR的廉价、快速、简便、准确的核酸检测技术，其特点是对靶基因设定4条引物，利用链置换反应在恒温条件下使靶标基因高效扩增，其难点在于引物设计及反应体系的建立。
LAMP技术与PCR技术有着相同的灵敏度，但其技术平台却比PCR更优越。由于其反应是多种引物共同启动，提高了反应结果的特异性；由于实行的是等温扩增，使得反应在恒温水浴箱中便可完成，不仅节约了仪器成本，而且使核酸检测操作方法更简便，适用于工业应用、临床诊断和高通量检测。
相对于PCR反应的“变性—退火—延伸”温度循环，本发明的LAMP检测在整个扩增检测过程中保持二阶段恒温，减少了温度多次变化引起的非特异性扩增几率；同时由于扩增过程为二阶段恒温，不需要热循环仪，降低了检测成本。更为重要的是，LAMP扩增反应体系要求F3、B3、FIP和BIP 4条引物完全匹配才能进行扩增，因此反应体系中的其它外源污染核酸或引物对反应的干扰很小。通过设计与2条引物哑铃状结构5’末端的单链茎环区域互补的环引物，可提高LAMP方法中DNA合成的开始位点的数量，使得LAMP反应可在60分钟内完成，从而提高了反应的速度。
本发明的有益效果是：
1、简易的反应体系：在恒温条件下实现了等温扩增环节与定量检测环节的交互进行，在核酸等温扩增的同时，实现了荧光信号的积累，整个反应在一个体系中完成；
2、等温高效的扩增体系：本发明是基于具有链置换活性的BstDNA聚合酶进行的等温扩增技术，在提供相应的反应成分的条件下，实现了待检靶基因的指数增加。在提高扩增效率的同时降低了检测仪器的成本，而且减少了反应中不必要的非特异性扩增产物污染；
3、检测速度快；设计与引物哑铃结构区域互补的滚环引物，可大大提高反应的速度；
4、检测灵敏度高：可在0.5-1小时的时间内实现对样本的100-110倍的扩增，最小可对10ng的核酸分子进行定量检测，提高了检测的灵敏度；
5、检测成本低：相对于核酸定量检测技术，本发明不需要特定的反应和检测仪器，只要普通的恒温水浴箱即可进行，便于工业应用和推广。
附图说明
图1是为土传病毒及病原菌LAMP检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：LAMP引物设计
本发明靶标病毒及病原菌为：大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus，以下简称BYMV)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani以下简称Rhi)、镰刀菌(Fusarium spp以下简称Fus)、腐霉菌(Pythium spp以下简称Pyt)、黄萎轮枝孢(Verticillium alboatum以下简称Ver)。用BLAST软件选取上述病毒或病原菌的模式菌株的全长序列，选取BYMV、Rhi、Fus、Pyt、Ver病原菌的保守区域为靶标区域设计引物。
使用DNA star软件排列靶标区域的序列信息。将保守序列进一步用PrimerExploer V4软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)分析，针对每种病原菌设计5套引物，经过扩增检测后，筛选得到一套高效LAMP引物。引物信息如下：
大麦黄花叶病毒BYMV：
BYMV-BIP：5-GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC-GTCT CAAGGGGCGAATC-3
BYMV-FIP：5-TCCGATACGAGGTGCGGC-GTTT CCCAGAAGGGCTACC-3
BYMV-B3：5-GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC-3
BYMV-F3：5-GCATCGTAGCTCGAAGCTAGCTAG-3
立枯丝核菌Rhi:
Rhi-BIP：5-AATTCGTCCGTAGGAATCGAT-GTGG GTGTCCGTAGCGT-3
Rhi-FIP：5-CAGCGTAGGTTAACGTAC-TTGT AGCTGTCGTCCACAAC-3
Rhi-B3：5-GCGGTGTCAGTATCTAGGATC-3
Rhi-F3：5-TCTAGCGTAGCCGGTAGATCGTACTT-3
镰刀菌Fus：
Fus-BIP：5-GGTGCATCGAGTCAGTTCGAGGC-GTTT GAACTCATTCCTTAG-3
Fus-FIP：5-CGCCTACATCGACGAGCAATC-GGGT CCTAGCAGTCGCAGCTA-3
Fus-B3：5-TAAGCCCCTAGTCAGCTAAGGTTTCCA-3
Fus-F3：5-TAGGCGACTAAGCTCGCACGATCGATCGAA-3
腐霉菌Pyt：
Pyt-BIP：5-GCGAATCGACATCGTTAACGTAG-TGGT TCGGAGCCCTAAGAG-3
Pyt-FIP：5-TACTAGGAACTCTCAAATCT-TTGG CGAATCGGGCGTAAGTCG-3
Pyt-B3：5-CCTTGAGAGAATCGTGTACGTGCCTA-3
Pyt-F3：5-TCGGTAACGTAGCAGTAGTCGGTAGC-3
黄萎轮枝孢Ver：
Ver-BIP：5-TGCCAAATCGGTATCAATCCAGACT-TTGG GCTACTCGGTCGAT-3
Ver-FIP：5-GCTACGTCCTAGCTGTTCGTC-GTGG CCCAGTGATTTTGAGTT-3
Ver-B3：5-GTGGTGAAGCCTAGCTAGGTCAGTAG-3
Ver-F3：5-CCTATCATGGGACAGCAGCGGGAC-3
以上所有引物为商业合成(金瑞斯，中国南京)。
实施例2：LAMP反应体系的建立
设计三组反应体系，检测扩增效率。
体系1(25μL体系)：
双蒸水补足至25μL，50℃反应3分钟，95℃下5分钟，冷却至室温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。
体系2(20μL体系)：
双蒸水补足至20μL，55℃反应3分钟，95℃下5分钟，冷却至室温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。
体系3(50μL体系)：
双蒸水补足至50μL，45℃反应4分钟，95℃下3分钟，冷却至室温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。
用上述三个体系分别检测BYMV、Rhi、Fus、Pyt、Ver病原菌靶标DNA序列，加入PicoGreen检测，体系2及体系3扩增得到的产物量最大，且对BYMV、Rhi、Fus、Pyt、Ver均有较好的检出效果。
实施例3：土传病原菌检测试剂盒的制备
1.5ml反应管50支，50μL 10Xbuffer,20μL MgSO4，20μL甜菜碱，20μL dATPs，20μLdCTPs，20μL dGTPs，20μL dUTPs，靶标基因引物序列(各50μL)，10μL尿嘧啶N糖基化酶，10μLBstDNA聚合酶，5ml PicoGreen，10ml双蒸水5管。
反应体系如下：
双蒸水补足至25μL，45℃反应4分钟，95℃下3分钟，冷却至室温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。对于扩增量较大的样品，可肉眼观测扩增结果。
样本量大时也可参考如下反应体系：
体系3(50μL体系)：
双蒸水补足至50μL，45℃反应4分钟，95℃下3分钟，冷却至室温，在产物中加入PicoGreen(Invitrogen,Carlsbad,USA)，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变。颜色变化的强烈程度与产物量相关，高产物量的样品颜色变化较早。
本试剂盒为定性试剂盒。
运输及保存:低温运输、-20℃保存、有效期一年。
实施例4：土传病原菌检测试剂盒检测效果测试
取大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌、黄萎轮枝孢菌(购自武汉病毒中心)体各1g，均匀混入100g土样中，用土壤DNA提取试剂盒(Trans EE101-01)提取土样中的DNA，按土传病原菌检测试剂盒说明书操作检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、镰刀菌、腐霉菌、黄萎轮枝孢菌，结果如图1所示。结果显示本试剂盒可以对土传病毒及病原菌高效检出。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (2)
1.一种环境检测方法，其特征在于，包括利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在，所述微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物为病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌为立枯丝核菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌，所述方法包括：
步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；
步骤2、按如下反应体系扩增土壤微生物总DNA样品：
步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至常温，在产物中加入PicoGreen，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；
步骤4、所述引物用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌，所述引物包括：
大麦黄花叶病毒BYMV：
BYMV-BIP：5-GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC-GTCT CAAGGGGCGAATC-3
BYMV-FIP：5-TCCGATACGAGGTGCGGC-GTTT CCCAGAAGGGCTACC-3
BYMV-B3：5-GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC-3
BYMV-F3：5-GCATCGTAGCTCGAAGCTAGCTAG-3
立枯丝核菌Rhi:
Rhi-BIP：5-AATTCGTCCGTAGGAATCGAT-GTGG GTGTCCGTAGCGT-3
Rhi-FIP：5-CAGCGTAGGTTAACGTAC-TTGT AGCTGTCGTCCACAAC-3
Rhi-B3：5-GCGGTGTCAGTATCTAGGATC-3
Rhi-F3：5-TCTAGCGTAGCCGGTAGATCGTACTT-3
腐霉菌Pyt：
Pyt-BIP：5-GCGAATCGACATCGTTAACGTAG-TGGT TCGGAGCCCTAAGAG-3
Pyt-FIP：5-TACTAGGAACTCTCAAATCT-TTGG CGAATCGGGCGTAAGTCG-3
Pyt-B3：5-CCTTGAGAGAATCGTGTACGTGCCTA-3
Pyt-F3：5-TCGGTAACGTAGCAGTAGTCGGTAGC-3
黄萎轮枝孢Ver：
Ver-BIP：5-TGCCAAATCGGTATCAATCCAGACT-TTGG GCTACTCGGTCGAT-3
Ver-FIP：5-GCTACGTCCTAGCTGTTCGTC-GTGG CCCAGTGATTTTGAGTT-3
Ver-B3：5-GTGGTGAAGCCTAGCTAGGTCAGTAG-3
Ver-F3：5-CCTATCATGGGACAGCAGCGGGAC-3
所述方法为一种以土壤为样本通过LAMP快速检测技术同时检测出大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌四种土传病原菌的方法。
2.根据权利要求1所述的环境检测方法，其特征在于，所述产物量通过肉眼观测浑浊度判定，如存在阳性产物则反应液呈现浑浊状态，如不存在阳性产物则反应液澄清。
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