CN103215357B - 番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种番茄细菌性病害的高通量检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病进行反向斑点杂交的高通量检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。本发明是基于锁式探针的滚环扩增技术，用一对通用引物扩增多种病原物，之后，与反向斑点杂交技术结合起来，通过显色反应来判断结果，可以缩短传统番茄细菌性病害的检测时间、确保检测的特异性和灵敏度，实现高通量检测。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。

Description

番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法

技术领域

本发明涉及一种番茄细菌性病害的高通量检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病进行反向斑点杂交的高通量检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。

背景技术

番茄细菌性溃疡病、番茄细菌性斑点病和番茄青枯病是番茄生产上的三种重要的病害。造成这些病害的病原菌分别为Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis（以下简称CMM）、Pseudomonas syringae.pv. Tomato（以下简称PST）、Ralstonia solanacearum Race1(以下简称RS1)。这些病害主要作用于番茄经济类作物，造成很严重的经济损失，是番茄最难控制的细菌性病害。

番茄细菌性溃疡病菌和番茄细菌性斑点病是欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）检疫性有害生物（EPPO/CABI，1997），在我国也属于植物检验检疫性的有害细菌。番茄溃疡病是一种系统维管束病害，在番茄苗期和收获期均可发生。它和番茄斑点病都主要危害番茄的叶片、茎和果实。番茄斑点病病原菌是丁香假单胞的致病变种之一，只侵染番茄但被感染的植株经常因为缺少明显的病症或者被其他病害的症状掩盖而检测不到。番茄青枯病病原菌有44个家族，能够在数百种植物上发病^[1]。据报道，在台湾，这个病原菌在番茄，马铃薯，甜椒，花生，草莓，茄子、蓖麻子、芝麻、洋桔梗植物^[2]和天堂鸟^[3]均能发病。鉴于细菌性溃疡病、番茄细菌性斑点病和番茄青枯病分布范围广，危害严重，和其在番茄经济上造成的重大损失，各种检测方法应运而生。传统的检测和鉴定病原的方法包括病原被分离、纯化、生物化学检测、血清学鉴定和致病性检测^[4]等，但是这些方法灵敏度低，缺乏特异性，检测时间长^[5]，且很难在短时间内对大量的样品进行检测。此外还有许多其他鉴定的方法，但是也存在一定的缺陷。比如鉴定P. syringae.pv. Tomato的方法，即细菌克隆体在半选择性培养基进行放射性的杂交，但是它受菌株产生的毒素的限制^{[ 6]}。常规PCR不能进行精确地定量分析^[7]，Real-time PCR虽然可以对许多病原微生物和病毒的进行定量检测^[8-9]，但是经常会有假阳性结果的出现。而且所有的这些方法都不能在同一个体系中达到对多种病害进行检测的目的。

自锁式探针被报道以来^[10]，它以灵敏、特异、稳定等特点被大家广泛接受，并越来越多的应用在分子检测等试验中。锁式探针是由3'和5'端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。它的工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针就在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，而连接成环状的锁式探针就在Bst DNA聚合酶和通用引物的作用条件下恒温扩增^[11]，它的扩增效率在一小时之内就可以达到10⁹或更多拷贝^[12]。扩增后的产物经过标记就和固定在膜上的探针进行杂交，通过显色反应实现在同一体系中进行多靶标的高通量的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，基于锁式探针的滚环扩增技术，用一对通用引物扩增多种病原物，之后，与反向斑点杂交技术结合起来，通过显色反应来判断结果，实现番茄青枯病原菌，番茄溃疡病原菌和番茄斑点病菌的高通量检测。

本发明根据Jens Dreier，V. Fanelli和Yeng-an Lee等人分别获得番茄溃疡病菌、番茄斑点病菌、番茄青枯病菌的一段特异性片段， 通过Blast与其近似种进行比对，在与其近似种碱基差异较大的地方找出一段序列作为T1、T2区，根据锁式探针的设计原则，设计锁式探针。并用Mfold（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/）预测探针的二级结构，确保了锁式探针的二级结构最小。线性探针经过环化连接，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在Taq DNA连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在，而后续反应中的核酸外切酶I、Ⅲ将多余的线性锁式探针消化水解。然后再用通用引物PCR扩增，PCR产物进行反向斑点杂交，可实现一条通用引物同时检测多种病原菌的高通量检测方法。

本发明的一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，具体操作的步骤如下：

（1）锁式探针PCR扩增：首先设计锁式探针，然后经过环化连接、消化反应，再用通用引物PCR扩增，PCR反应中加入含DIG-labeled dUTP 的dNTPs，使PCR产物带上地高辛标记；（2）反向斑点杂交：通过显色反应读出杂交信号，以此来判断体系中是否含有番茄青枯病菌RS1、番茄溃疡病菌CMM和番茄斑点病菌PST；所述锁式探针的核苷酸序列如下：

Padlock--CMM:5'-AAGGAACCGATCAGGCCAGGAGTCATGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTTGAGGTCTTCGGCGC-3'，

Padlock--PST:5'-GCGAGTGGGCTAACTATGATTGGGAAATAAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCT GCGTCACTGCGTTAC-3'，

Padlock--RS1:5'-TCGCATCGTCTGTTACGCATCCGCTCGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTCGTTCGCGTCAGGCT-3'，

通用引物如下：

PadR：5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT- 3'，

PadF：5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC- 3'。

所述环化连接的反应体系为10μL：10×Taq DNA 连接酶缓冲液1μL，CMM、PST及RS1的400pmol/L锁式探针各0.2μL，40U/μL Taq DNA连接酶0.15μL，Sterilized ddH₂O 5.25μL，样品模板3μL ，采用热循环连接法连接：94℃ 4 min； 94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃ 15min灭活Taq DNA连接酶，反应结束后立即将反应管冰浴5min。

所述消化反应的条件如下：向冰浴后的反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL，5U/μL 核酸外切酶I 0.35μL，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL，5U/μL 核酸外切酶Ⅲ 0.15μL，Sterilized ddH₂O 5.5μL，37℃反应2 h，再于95℃反应3h。

通用引物PCR扩增的反应体系为25μL：2×PCR buffer 12.5μL，10 μM 通用引物Pad F 0.5 μL，10 μM 通用引物PadR 0.5μL，含 DIG-labeled dUTP 的10×dNTPs 1.5μL，环化连接、消化反应的产物2 μL，Sterilized ddH₂O 8μL；反应条件：94℃ 4min ； 94℃ 30s， 57℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 8min。

所述反向斑点杂交：将番茄溃疡病菌CMM、番茄斑点病菌PST和番茄青枯病菌RS1的杂交探针CMM-T1/T2、PST-T1/T2和RS1-T1/T2点在杂交膜上，之后与用地高辛标记的的PCR产物进行杂交，通过显色反应来判定是否存在目标病原细菌。

所述杂交探针如下：

番茄溃疡病菌杂交探针： CMM-T1/T2： 5’-ATGACTCCTGGCCTGATCGGTTCCTT GCGCCGAAGACCTCA-3’， 番茄斑点病菌杂交探针： PST-T1/T2： 5’-TTATTTCCCAATCATAGTTAGCCCACTCGC GTAACGCAGTGACGC-3’， 番茄青枯病菌杂交探针： RS1-T1/T2： 5’-GAGCGGATGCGTAACAGACGATGCGA AGCCTGACGCGAACG-3’。

本发明主要是利用基于锁式探针与反式斑点杂交相结合的方法，达到高通量检测的目的。运用锁式探针的超分支滚环扩增技术，建立一对通用引物PadR /PadF同时检测多种病原菌的锁式探针PADLOCK探针，可以缩短传统番茄细菌性病害的检测时间、确保检测的特异性和灵敏度，实现高通量检测。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。

本发明有益效果：

（1）此发明适用于番茄上多种病原细菌的检测，最大的突出特点在于能够在同一反应体系中检测多种病原菌。

（2）采用锁式探针扩增与反向斑点杂交相结合的技术，在同一反应体系中快速有效地检测多种病原物，实现病原菌高通量检测。

（3）采用锁式探针常规PCR的方法，避免了锁式探针滚环扩增时未环化的线性锁式探针的非特异性影响。结果可靠，特异性强，在供试的10种菌株中，该3种病原菌能被特异检出，见图1。检测灵敏度高，病原物DNA检测最低浓度可达500 fg/μL，见图2。

附图说明

图1为三种病原细菌的锁式探针扩增反向斑点杂交图；图1中1,4,7，10包埋杂交探针CMM-T1/T2；2,5,8,11包埋杂交探针PST-T1/T2；3,6,9,12包埋杂交探针RS1-T1/T2；其中1,2,3杂交Padlock-CMM、Padlock-PST、Padlock-RS1三种锁式探针和CMM、PST、RS1混合DNA模板的PCR反应产物；4杂交Padlock-PST、Padlock-RS1两种锁式探针和CMM、PST、RS1混合DNA模板的PCR反应产物；5杂交Padlock-CMM、Padlock-RS1两种锁式探针和CMM、PST、RS1混合DNA模板的PCR反应产物；6杂交Padlock-CMM、Padlock-PST两种锁式探针和CMM、PST、RS1混合DNA模板的PCR反应产物；7,8,9杂交Padlock-CMM、Padlock-PST、Padlock-RS1三种锁式探针和其他7种对照菌混合DNA模板的PCR反应产物；10,11,12杂交Padlock-CMM、Padlock-PST、Padlock-RS1三种锁式探针和无菌水的PCR反应产物。

图2 为CMM锁式探针反向斑点杂交灵敏度实验图。图2中1-8包埋CMM的杂交探针CMM-T1/T2。其中1-7杂交Padlock-CMM 锁式探针与不同浓度的CMM的DNA的PCR反应产物，浓度依次为50 ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500 fg/μL、50 fg/μL ；8杂交Padlock-CMM 锁式探针与无菌水的PCR反应产物。

具体实施方式

供试生物材料和试剂：

番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，由福建省农科院提供；番茄斑点病菌Pseudomonas syringae pv.tomato、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum、对照菌西瓜细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli、水稻细菌性条斑病菌 Xanthomonas oryzae pv.oryzicola、杨桃细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. averrhoii、柑桔溃疡病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis、香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cubense、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae均由福建农林大学细菌实验室提供。

Taq DNA ligase、Exonuclease I、Exonuclease Ⅲ、Bst DNA polymerase、Sterilized ddH₂O均购自New England Biolabs（NEB）公司。dNTPs、100bp DNA ladder、地高辛标记检测试剂盒，分别购自Promega、Tangen和Roche公司。

主要反应液配方：

马来酸缓冲液——称取11.61g马来酸，8.77g NaCl，定容至1000mL，高压灭菌，常温调节pH至7.5。

漂洗缓冲液——0.1 mol/L Maleic Acids，0.15 mol/L NaCl，pH7.5，灭菌后加入0.3% (v/v) Tween-20。

洗脱缓冲液——取灭菌后的马来酸缓冲液，加入0.3%（v/v）的Tween-20，常温。

检测缓冲液——0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 9.5，常温（取1 M Tris-HCl 50ml，2.925 g NaCl，定容至500ml，高压灭菌）。

TE缓冲液——10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0，常温（取1 M Tris-HCl 10ml，0.5 M EDTA 2ml，定容至1000ml，高压灭菌）。

20×SSC——3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠（175.5g NaCl，88.2g柠檬酸钠，10 M NaOH调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌）

10%SDS——取 10 g SDS 加入 80 mL 蒸馏去离子水中，再用水补至 100 mL，然后 121℃高压灭菌 20 min。

预杂交液，杂交液，NBT（显色液）， Blocking solution（封闭液）--地高辛标记检测试剂盒（Roche公司）中配好，按倍数稀释即可。

1.连接反应

反应的体系是10μL: 10×Taq DNA 连接酶缓冲液1μL， CMM、PST及RS的400pmol/L锁式探针各0.2μL， 40U/μL Taq DNA连接酶0.15μL， Sterilized ddH₂O 6.25μL， DNA模板2μL 。采用热循环连接法连接: 94℃ 4 min ； 94℃30s， 65℃5min ， 15个循环； 95℃15min灭活Taq DNA连接酶。反应结束后立即将反应管冰浴5min。

2.消化反应

向冰浴后的反应管中加入共10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL； 5U/μL 核酸外切酶I 0.35μL； 10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL 核酸外切酶Ⅲ 0.15μL；Sterilized ddH2O 5.5μL， 37℃反应2 h 再于95℃反应3h，以彻底消化未环化的线型锁式探针。

3. 环化探针PCR反应

25μL体系：2×PCR buffer 12.5μL，10 μM primer F 0.5 μL，10 μM primer R 0.5μL，10×含 DIG-labeled dUTP dNTPs）1.5μL，连接产物 2 μL，Sterilized ddH₂O 8μL.94℃ 4min ； 94℃ 30s， 57℃ 30s， 72℃ 30s，35个循环； 72℃ 8min。

4.反向斑点杂交

（1）杂交膜的制备：准备一张带正电的尼龙膜，用铅笔划出方格，将膜自然浸没制于蒸馏水中保持 10 min，室温晾干，然后将杂交探针按顺序点于膜上，晾干。将尼龙膜置于两层滤纸上，在80℃烘干1h以固定DNA。固定后的膜经5×SSC漂洗2min，自然晾干，可立即使用。

（2）预杂交：将10ml的预杂交液和处理后的膜同时加入杂交管中，39℃预杂交1h。取3 μL地高辛标记的PCR产物于99℃中水浴5 min，并快速置于冰上10 min，然后将其加入至3ml杂交液中，混匀后用于杂交。

（3） 杂交：弃去预杂交液，换上加有变性的地高辛标记的PCR产物的杂交液，39℃杂交过夜。

（4）洗膜：杂交结束后取出杂交膜，室温用2×SSC及0.1% SDS洗膜两次，每次5min；然后用预热到56℃的0.5×SSC及0.1% SDS洗膜两次，每次15 min。

（5）显色：依次用20 mL漂洗缓冲液洗膜5 min；用20 mL 1×blocking solution处理30 min；用20 mL抗体溶液（用1×blocking solution按1：5000稀释抗地高辛抗体）处理30 min；用20 mL漂洗缓冲液漂洗膜2次，每次15 min；用20 mL检测缓冲液平衡膜5 min；用10 mL新配制的显色液避光显色1h（切勿摇晃）；用50 mL TE缓冲液浸泡5-10 min以终止反应。

5.灵敏度检测

将提取的CMM的DNA，经核酸蛋白仪测定浓度，再经ddH₂O 10 倍梯度稀释后作为模板，各取2μL按上述步骤进行连接、消化、PCR扩增（地高辛标记dUTP）以及反向斑点杂交试验，以确定锁式探针扩增结合反向斑点杂交技术的最低检测浓度。

应用实例1：

取CMM、PST和RS1三种病原细菌培养物，混合，提取DNA，其他7种供试菌提取DNA，混合备用。将CMM、PST和RS1三种病原物的锁式探针在同一PCR管与混合的DNA进行锁式探针环化处理，再用通用引物PadR /PadF进行PCR扩增，得到的产物进行反向斑点杂交，结果显示，番茄上的三种病原菌被特异性检出，只有当锁式探针环化连接时含有该病原物的DNA，反向斑点杂交时其杂交探针才能检测到，结果成阳性，而三种病原菌的锁式探针和供试的其他对照菌的DNA混合液连接环化，均未出现阳性结果，见图1。灵敏度实验表明，CMM的DNA检测灵敏度高，达500 fg/μL（见图2），其他两种菌RS1和PST检测灵敏度相当。

参考文献：

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<110> 中华人民共和国福清出入境检验检疫局

<120> 番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaggaaccga tcaggccagg agtcatgtgg aaccgaggaa atagagaacc ccatccagca 60

cttccctatg tctctcccgt atggtttctt gaggtcttcg gcgc 104

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgagtgggc taactatgat tgggaaataa gtggaaccga ggaaatagag aaccccatcc 60

agcacttccc tatgtctctc ccgtatggtt tctgcgtcac tgcgttac 108

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgcatcgtc tgttacgcat ccgctcgtgg aaccgaggaa atagagaacc ccatccagca 60

cttccctatg tctctcccgt atggtttctc gttcgcgtca ggct 104

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccatccagca cttccctatg tct 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggttctctat ttcctcggtt ccac 24

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgactcctg gcctgatcgg ttccttgcgc cgaagacctc a 41

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttatttccca atcatagtta gcccactcgc gtaacgcagt gacgc 45

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagcggatgc gtaacagacg atgcgaagcc tgacgcgaac g 41

Claims (5)

1.一种番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于：步骤如下：（1）锁式探针PCR扩增：首先设计锁式探针，然后经过环化连接、消化反应，再用通用引物PCR扩增，PCR反应中加入含DIG-labeled dUTP 的dNTPs，使PCR产物带上地高辛标记；（2）反向斑点杂交：通过显色反应读出杂交信号，以此来判断体系中是否含有番茄青枯病菌RS1、番茄溃疡病菌CMM和番茄斑点病菌PST；所述锁式探针的核苷酸序列如下：

Padlock--CMM:5'-AAGGAACCGATCAGGCCAGGAGTCATGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTTGAGGTCTTCGGCGC-3'，

Padlock--PST:5'-GCGAGTGGGCTAACTATGATTGGGAAATAAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCT GCGTCACTGCGTTAC-3'，

Padlock--RS1:5'-TCGCATCGTCTGTTACGCATCCGCTCGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTCGTTCGCGTCAGGCT-3'，

通用引物如下：

PadR：5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT- 3'，

PadF：5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC- 3'。

2.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于：所述环化连接的反应体系为10μL：10×Taq DNA 连接酶缓冲液1μL，CMM、PST及RS1的400pmol/L锁式探针各0.2μL，40U/μL Taq DNA连接酶0.15μL，Sterilized ddH₂O 5.25μL，样品模板3μL ，采用热循环连接法连接：94℃ 4 min； 94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃ 15min灭活Taq DNA连接酶，反应结束后立即将反应管冰浴5min。

3.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于：所述消化反应的条件如下：向冰浴后的反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL，5U/μL 核酸外切酶I 0.35μL，10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL，5U/μL 核酸外切酶Ⅲ 0.15μL，Sterilized ddH₂O 5.5μL，37℃反应2 h，再于95℃反应3h。

4.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于：通用引物PCR扩增的反应体系为25μL：2×PCR buffer 12.5μL，10 μM 通用引物Pad F 0.5 μL，10 μM 通用引物PadR 0.5μL，含 DIG-labeled dUTP 的10×dNTPs 1.5μL，环化连接、消化反应的产物 2 μL，Sterilized ddH₂O 8μL；反应条件：94℃ 4min ； 94℃ 30s， 57℃ 30s， 72℃ 30s，35个循环； 72℃ 8min。

5.根据权利要求1所述的番茄细菌性病害锁式探针高通量检测方法，其特征在于：所述反向斑点杂交：将番茄溃疡病菌CMM、番茄斑点病菌PST和番茄青枯病菌RS1的杂交探针CMM-T1/T2、PST-T1/T2和RS1-T1/T2点在杂交膜上，之后与用地高辛标记的PCR产物进行杂交，通过显色反应来判定是否存在目标病原细菌；所述杂交探针如下：

番茄溃疡病菌杂交探针： CMM-T1/T2： 5’-ATGACTCCTGGCCTGATCGGTTCCTT GCGCCGAAGACCTCA-3’， 番茄斑点病菌杂交探针： PST-T1/T2： 5’-TTATTTCCCAATCATAGTTAGCCCACTCGC GTAACGCAGTGACGC-3’， 番茄青枯病菌杂交探针： RS1-T1/T2： 5’-GAGCGGATGCGTAACAGACGATGCGA AGCCTGACGCGAACG-3’。