CN109735638A

CN109735638A - 鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌st121的多重pcr检测引物、试剂盒、方法及应用

Info

Publication number: CN109735638A
Application number: CN201910142342.XA
Authority: CN
Inventors: 陈谋通; 吴清平; 张菊梅; 程健恒; 庞锐; 陈月桃; 曾海燕; 王涓; 丁郁; 吴诗
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109735638B

Abstract

本发明公开了一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用。本发明的多重PCR检测方法，包括检测靶标多重PCR引物设计、多重PCR体系扩增和电泳检测，若结果同时出现目标基因0609，0171、prfA条带，则证明菌株是持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，若结果出现目标基因0609，0171、prfA三条条带中的任意两条，则为其他ST型单增李斯特菌，若结果只出现prfA基因条带，则为单增李斯特菌。本发明能有效鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，具有快速、高效、灵敏度高、经济、准确和操作简单等优点，便于应用于食品、检验检疫等领域。

Description

鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用。

背景技术

多重PCR是基于普通PCR于同一个反应体系中利用多对特异性引物同时扩增多段特异性检测靶标DNA的PCR技术。在多重PCR报道以来，由于其高效性、灵敏性和经济简便性，已广泛应用于核酸检测的多个领域，如转基因鉴定、病原体检测、遗传疾病诊断、单核苷酸多态性分析等；多重PCR体系，一般包括以下试剂：PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl₂、引物、模板和去离子水。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的食源性致病菌，可引起严重的李斯特菌病，如脑膜炎、脑膜脑炎、流产、胸肌炎和败血症等，敏感人群主要有老人、新生儿、孕妇和免疫力低下的人群，致死率为20％-30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民的身心健康造成一定的威胁。作为重要的食源性致病菌，如何鉴定和防控单增李斯特菌污染食品是降低单增李斯特菌感染的关键之一。

单核细胞增生李斯特菌遗传多样性丰富，具有13种血清型，分别为1/2a，1/2b，1/2c，3a，3b，3c，4a，4b，4c，4ab，4d，4e或7型。脉冲场凝胶电泳(pulse field gelelectrophoresis，PFGE)是单增李斯特菌分子分型的“金标准”，但随着测序技术的发展，目前多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是单增李斯特菌遗传多样性分析的流行方法，其分辨力、稳定性均可与PFGE媲美，比血清分型具有更高的分辨力和可靠性。据法国巴斯德研究所BIGSdb-Lm数据库统计，目前单增李斯特菌已发现1459序列型(sequence types，STs)(截至2019年1月5日)。单增李斯特菌具有耐受低温、宽范围pH和高盐等能力，因此广泛分布于食品加工环境中。持留型菌株是指能够在同一食品生产工厂持续污染几年甚至更长时间且其遗传特征不发生改变的菌株。大量研究表明持留型菌株是单增李斯特菌在食品生产环境中持续污染终端食品的主要因素。单增李斯特菌ST121型菌株能够耐受一定剂量的消毒剂、酸碱环境和干燥等逆境环境，是长期持续性污染食品生产加工的主要元凶，对食品安全带来严重的潜在威胁。许多研究表明在鱼肉、猪肉处理车间、奶酪生产车间等食品环境中分离获得持续污染产品的单增李斯特菌分离株ST121(血清型1/2a)，表明ST121持留型菌株在不同种类食品生产环境中均长期存在，对食品生产造成了巨大的潜在微生物安全威胁。

目前，采用MLST技术可以准确鉴定单增李斯特菌的ST型别，但目前DNA序列测定成本较高、耗时相对较长、且测序的准确性也直接影响MLST分型结果的准确性。随着微生物全基因组测序技术的发展，基于全基因组序列比对分析，获得ST型特异性DNA检测靶标，可以开发简单快速、廉价高效、高灵敏可靠的PCR鉴定技术。本发明基于全基因组比对分析技术开发的多重PCR技术可对单增李斯特菌ST121型菌株的多个特异性检测靶标同时进行检测，是直接鉴定单增李斯特菌ST121型菌株的最适宜方法之一。作为一种基于普通PCR的衍生技术，多重PCR具有以下优势：(1)高通量，在一次操作中可对多达384个样品进行鉴定；(2)高效性，同一PCR反应中可同时检测多个特异性靶标，省时省力；(3)经济性，无需进行DNA序列测定，根据靶标序列扩增DNA条带即可判断结果；(4)易于操作、耗时短，在同一PCR反应中加入多重PCR引物即可实现多个靶标的一步法同时扩增，150min内即可获得准确结果；(5)准确性，实现多个靶标的同步特异性扩增，大大降低了假阳性的可能性。随着引物对数量的增加，引物间的抑制作用降低了多重PCR的检测通量，在多重PCR技术的实际应用过程中，由于在同一反应管内添加多对引物，引物的非特异性扩增、引物间二聚体形成、PCR反应体系优化以达到每个靶标DNA序列都能有效扩增等问题限制了多重PCR技术的应用。因此，开发高通量、高灵敏度和准确可靠的单增李斯特菌ST121型菌株多重PCR鉴定技术及其相应的试剂盒，对食品生产企业检测和防控单增李斯特菌污染具有重要的价值。

发明内容

本发明通过设计ST121型菌株检测靶标-0609基因(LM6179_0609)、0171基因(LM6179_0171)和prfA基因的DNA特异性扩增引物，采用一步法进行扩增0609基因、0171基因和prfA基因这三个特异性靶标，实现对持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的快速鉴定。通过对多重PCR检测体系的优化，开发出针对持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株鉴定的多重PCR检测试剂盒，建立了检测准确，高效的检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物，所述的多重PCR检测引物如下所示：

针对ST121菌株0609基因的

0609-F:5'-TAGGTGACCCTGAAGCAACAACTG-3'，(其序列如SEQ ID NO.1所示)；

0609-R:5'-TGTGCCTCCACCGCCAGAAC-3'，(其序列如SEQ ID NO.2所示)；

针对ST121菌株0171基因的

0171-F:5'-CAACCTACGACTACAAAGCGGGC-3'，(其序列如SEQ ID NO.3所示)；

0171-R:5'-TCTTGGTATTCCAGCTTGCGTTAG-3'，(其序列如SEQ ID NO.4所示)；

针对单核细胞增生李斯特菌菌株prfA基因的

prfA-F:5'-ATGAACGCTCAAGCAGAAGAAT-3'，(其序列如SEQ ID NO.5所示)；

prfA-R:5'-ATAATAGCCAACCGATGTTTCTG-3'，(其序列如SEQ ID NO.6所示)；。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测试剂盒，所述的多重PCR检测试剂盒包含上述的多重PCR检测引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R。

所述的多重PCR检测试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液和无菌去离子水。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测方法，该方法包括以下步骤：以待测菌株的基因组DNA(如待测单核细胞增生李斯特菌菌株的基因组DNA)作为模板，利用上述的多重PCR检测引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R对ST121型菌株的特异性检测靶标0609基因(700bp)、0171基因(511bp)和prfA基因(225bp)进行多重PCR扩增，若同时扩增出目标基因0609(700bp)、0171(511bp)、prfA(225bp)条带，则证明菌株是持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，若扩增出目标基因0609(700bp)、0171(511bp)、prfA(225bp)三条条带中的任意两条，则证明菌株是其他ST型单核细胞增生李斯特菌，若只扩增出目标基因prfA(225bp)条带，则证明菌株是单核细胞增生李斯特菌。

上述的多重PCR检测方法中，进行PCR反应时，采用一步法进行扩增0609基因、0171基因和prfA基因这三个特异性靶标。

所述的多重PCR扩增采用25μL反应体系，包括浓度为10μmol/L上述的多重PCR引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNAploymerase0.5μL，25mmol/L的MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，5×Taq buffer 5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水10.5μL；多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的第四个目的是提供上述的多重PCR检测引物或上述的多重PCR检测试剂盒在鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的特征性核苷酸序列，包括SEQ ID NO.7(0609基因，LM6179_0609)和SEQ ID NO.8(0171基因，LM6179_0171)所示的核苷酸序列。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于：

(1)本发明根据单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株及其他ST型单增李斯特菌的全基因组序列信息，获得多个特异性靶标DNA序列，采用多重PCR技术扩增，结果准确可靠。

(2)本发明公开的检测单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR试剂盒，可同时检测ST121型菌株的多个特异性靶标，不仅可以节约试剂使用量和降低检测成本，同时具有高通量特点，提高了检测效率，具有灵敏度高、经济快速、操作简单和准确等优点。

(3)本发明公开的试剂盒进行检测时，只需要进行多重PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳即可准确鉴定单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株，步骤简单快捷，无需进行DNA序列测定，降低了因DNA序列测定结果准确性影响结果可信度的影响因素。

(4)本发明的多重PCR检测体系特异性强，灵敏度达2.5cfu/(10mL·12h)，单管进行，操作简便快捷，具有灵敏度高、经济快速、高通量等优点，能用于开发相关的检测试剂盒，可应用于食品、检验检疫等部门。

附图说明

图1是实施例1单核细胞增生李斯特菌ST121菌株鉴定单重PCR体系的特异性检测电泳图。

图2是实施例2单核细胞增生李斯特菌ST121菌株鉴定多重PCR体系的特异性检测电泳图。

图3是实施例2单核细胞增生李斯特菌ST121菌株鉴定多重PCR体系的灵敏度检测电泳图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1单重PCR体系特异性检测

检测单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR试剂盒，包括常规多重PCR组件，还包括针对单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的特异性引物，特异性引物序列见表1，常规多重PCR组件包括Taq DNA聚合酶、MgCl₂、PCR扩增缓冲液、dNTP和去离子水。

表1针对单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的特异性引物

单重PCR体系的特异性检测：采用单引物对+单模板的PCR扩增方法，扩增单核细胞增生李斯特菌ST121菌株的各个靶标DNA序列，0609、0171、prfA的模板均采用单核细胞增生李斯特菌ST121菌株的基因组DNA，模板DNA浓度为20ng/μL。单重PCR采用25μL反应体系，包括：浓度为10μmol/L的上下游引物(0609-F/0609-R、0171-F/0171-R或prfA-F/prfA-R)各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，5×PCR扩增缓冲液5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水12.5μL。单重PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。结果如图1所示，图1为单重PCR体系的特异性检测，其中M为DL2000DNA标准marker(条带大小一次为2000、1000/750/750/500/250和100bp)；C为阴性对照；1-4泳道是PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，依次为prfA、0171、0609和prfA、0171、0609多重PCR产物，结果显示，运用本发明的单重PCR体系检测靶标DNA，可以从相应基因组DNA模板中扩增出与其大小的单一产物，且条带清晰，结果表明本发明的单重PCR引物特异性强。

实施例2多重PCR体系的特异性检测

1、多重PCR体系的特异性检测：采用多引物对+单模板的PCR扩增方法，扩增ST121菌株(单核细胞增生李斯特菌ST121菌株)的各个靶标DNA序列，0609、0171、prfA的模板均采用ST121型菌株的基因组DNA，模板DNA浓度为20ng/μL。多重PCR采用25μL反应体系，包括：浓度为10μmol/L的多重PCR引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，5×PCR扩增缓冲液5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水10.5μL。多重PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。结果如图2所示，图2为多重PCR体系的特异性检测，其中1-78泳道是PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，依次为M为DL2000DNA标准marker(条带大小一次为2000、1000、750、750、500、250和100bp)，C为阴性对照，1-5为持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，6-78为其他单增李斯特菌菌株(其中16、17为其他ST型单核细胞增生李斯特菌)；结果显示，运用本发明的多重PCR体系检测待测菌株，能够特异性的检测出持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，其他ST型单核细胞增生李斯特菌和单核细胞增生李斯特菌，可以从相应基因组DNA模板中扩增出与其大小的单一产物，且条带清晰，结果表明本发明的多重PCR引物特异性强。

2、多重PCR体系的灵敏度检测：采用10倍稀释法对含靶标基因的基因组DNA模板进行模板梯度PCR检测，0609、0171、prfA的靶基因依次是LM6179_0609(SEQ ID NO.7)、LM6179_0171(SEQ ID NO.8)、prfA。将基因组DNA模板用ddH₂O进行10倍梯度稀释，依次得到25.3ng/μL,2.53ng/μL,0.253ng/μL,25.3pg/μL,2.53pg/μL,0.253pg/μL,25.3fg/μL,2.53fg/μL,0.253fg/μL的基因组DNA模板。每个稀释度取2μL作为模板，分别对3个靶标基因进行模板梯度PCR反应。多重PCR采用25μL反应体系，包括：浓度为10μmol/L的多重PCR引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNA polymerase0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，5×PCR扩增缓冲液5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水10.5μL。多重PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。结果如图3所示，图3为多重PCR灵敏度检测，M为DL2000DNA标准marker(条带大小一次为2000、1000/750/750/500/250和100bp)，1-9泳道对应的模板浓度分别为25.3ng/μL,2.53ng/μL,0.253ng/μL,25.3pg/μL,2.53pg/μL,0.253pg/μL,25.3fg/μL,2.53fg/μL,0.253fg/μL。结果显示，运用本发明的多重PCR体系检测靶标DNA，灵敏度最高可达0.5pg/25μL，具有较高的灵敏度，可用于单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的检测。

实施例3多重PCR体系在人工污染样品中的检测

采用10倍稀释法对培养过夜的单核细胞增生李斯特菌ST121菌株进行10倍梯度稀释，依次获得2.5×10⁸cfu/mL、2.5×10⁷cfu/mL、2.5×10⁶cfu/mL、2.5×10⁵cfu/mL、2.5×10⁴cfu/mL、2.5×10³cfu/mL、2.5×10²cfu/mL、2.5×10¹cfu/mL、2.5×100cfu/mL，分别取1mL浓度为2.5×10⁴cfu/mL、2.5×10³cfu/mL、2.5×10²cfu/mL、2.5×10¹cfu/mL、2.5×100cfu/mL的单核细胞增生李斯特菌ST121菌株加入9mL牛奶中，然后加至90mL的BHI培养基中分别培养4h，6h，8h，10h和12h，然后利用细菌基因组提取试剂盒进行基因组DNA提取。取2μL基因组DNA作为模板，进行多重PCR反应。多重PCR采用25μL反应体系，包括：浓度为10μmol/L的多重PCR引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP2μL，5×PCR扩增缓冲液5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水10.5μL。多重PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸60s，扩增35个循环；最后72℃延伸10min。结果如表2所示，表2为单核细胞增生李斯特菌ST121菌株人工污染检测结果。结果显示，运用本发明的多重PCR体系检测靶标DNA，灵敏度最高可达2.5cfu/(10mL·12h)，可用于单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的检测。

表2单核细胞增生李斯特菌ST121人工污染检测结果

a:+，表示多重PCR阳性结果；-，表示多重PCR阴性结果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121的多重PCR检测引物、试剂盒、方法及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taggtgaccc tgaagcaaca actg 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgcctcca ccgccagaac 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacctacga ctacaaagcg ggc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcttggtatt ccagcttgcg ttag 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacgctc aagcagaaga at 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ataatagcca accgatgttt ctg 23

<210> 7

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgattttcc gaacagcaga actattcgct ggaccaggtg gtggtgctta tgctgctaaa 60

acagctaaat atgtagatag agaaggaaat aattggggct ttgaacatgc ttgggcaaat 120

gaatatgata aagatactgt ggaaacatat aaattaaaca ttttaggtga ccctgaagca 180

acaactgttt attgtcaaga tgttcgaaag tttgatttaa ctaatcataa gttactatct 240

gatatagatg cactaatttt tggctttcca tgtaatgatt attctttagt tggcaaacaa 300

aaaggtttag atggagagtt tggaccttta tattcatatg gatctaaagc attatctgaa 360

tttcaaccca aagtttttat tgctgaaaat gttgggggac tatcttctgc aaatgaaggc 420

gaagcattta ttcacatttt aaaagaattt cagaaagcag gttataaatt aacccctcat 480

ttctataagt ttgaacaata tggcgtccct caagcacgtc atagaataat aattgtagga 540

atcagaaatg atatatatga agaaggcata acctttagag tacctgcacc tatcttcaaa 600

gatcatacag aatataaaaa agcatatgat gctttaacta atccgcctat atccttaaac 660

gcattaaatc atgaatttac caagcataat gctaaaactg aaaaaatgct ttcttatatt 720

ccagaaggag gaaatgcttg ggtggaatct attccagaag ctttccgttt aaacgtaaaa 780

ggagctaggt taagcaatat atataaacgc ttgcatagaa acaaaccttc gtatacggtt 840

acaggttctg gcggtggagg cacacatatg tatcattgga gcgaaaatcg tgctttgaca 900

aatagagaac gtgctagact ccagactttc cctgatgact tttactttca aggaggaaaa 960

gaaagtgtac ggaaacaaat aggtatggct attcctcctg acgggttaag acctatactt 1020

ttagctgtgt taaaatcttt tgcacaagaa gattatgagt ggattgaacc tacaaaaaaa 1080

ttacaaacag atatactttt taatgaatct ggtaaaacaa ttgctactat agtaaagtca 1140

taa 1143

<210> 8

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgctcagcg tatgcagaag caagtacaca aaaagtgact tatgtaaaaa ccaagaattc 60

ttagaaagtc aaaagaaagg ctatagcgat ccaacctacg actacaaagc gggctatcca 120

agaccgcatg aagcatgggc cttcgatgct aacggaaata ttgataagga aaaaagcgca 180

gaagtttctg agaaaatagg tgaatggagc acttatgtac ttatgcttgt cataccgggt 240

ccagaagaac tattaattgc tggattttta gtcaaagttg gaggaaaagt tagttcaaaa 300

acaatttctt ggggagcgac taagtttgga gcaaagggat caggaaatgc aggaaagatt 360

ttagaaaatg ctaattatgc acaaaaaaca tttggtaata aatttagtgc agagggtagt 420

aaaatatatt ctaaattagc aggtgaacat attaacacaa ttgatgattt ggtaaaggta 480

atagagtctg gtaaagtaaa agtatcggat ttaccagttg agtacattgt aagagatgga 540

aatacgttga ttctcaatac gagaacatct caagcgctaa cgcaagctgg aataccaaga 600

gcgcagtgga atgctgtaaa tagaacgggg aatcaattgt ttgaggagtt actaacaggg 660

cagttaaat 669

Claims

1.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测引物，其特征在于，所述的多重PCR检测引物如下所示：

针对ST121菌株0609基因的0609-F:5'-TAGGTGACCCTGAAGCAACAACTG-3'，

0609-R:5'-TGTGCCTCCACCGCCAGAAC-3'；

针对ST121菌株0171基因的0171-F:5'-CAACCTACGACTACAAAGCGGGC-3'，

0171-R:5'-TCTTGGTATTCCAGCTTGCGTTAG-3'；

针对单核细胞增生李斯特菌菌株prfA基因的

prfA-F:5'-ATGAACGCTCAAGCAGAAGAAT-3'，

prfA-R:5'-ATAATAGCCAACCGATGTTTCTG-3'。

2.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒包含权利要求1所述的多重PCR检测引物。

3.根据权利要求2所述的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重PCR检测试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液和无菌去离子水。

4.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测菌株样本的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的多重PCR检测引物进行多重PCR扩增，若同时扩增出目标基因0609、0171、prfA条带，则证明菌株是持留型单核细胞增生李斯特菌ST121菌株，若扩增出目标基因0609、0171、prfA三条条带中的任意两条，则证明菌株是其他ST型单核细胞增生李斯特菌，若只扩增出目标基因prfA条带，则证明菌株是单核细胞增生李斯特菌。

5.根据权利要去4所述的多重PCR检测方法，其特征在于，多重PCR扩增采用25μL反应体系，包括10μmol/L权利要求1所述的多重PCR引物0609-F、0609-R、0171-F、0171-R、prfA-F和prfA-R各0.5μL，2.5U/μL的Taq DNA ploymerase 0.5μL，25mmol/L的MgCl₂ 2μL，10mmol/L的dNTP 2μL，5×Taq buffer 5μL，DNA模板2μL，无菌去离子水10.5μL；多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

6.权利要去1所述的多重PCR检测引物或权利要去2所述的多重PCR检测试剂盒在鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株中的应用。

7.一种鉴定持留型单核细胞增生李斯特菌ST121型菌株的特征性核苷酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。