CN102061338A - 一种同时检测水中13种致病微生物的基因芯片 - Google Patents

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张春秀
谢朝新
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王大勇
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Abstract

本发明提出一种同时检测水中13种致病微生物的基因芯片，芯片采用的片基为醛基化片基，在醛基化片基上整列分布探针与对照及空白的点样涂层，所述醛基化片基上的点样矩阵为10×7，所述探针包括针对13种菌株的13条定位探针和阳性对照探针，9条阴性对照探针。本基因芯片的检测结果同传统的分离培养方法有较好的符合度，与GB法鉴定结果一致，符合率达到100%；检测灵敏度比PCR方法检测灵敏度高出10倍；可一次检测13种致病微生物，稳定性好，特异性高，适用于实际检测工作。

Description

一种同时检测水中13种致病微生物的基因芯片
技术领域
本发明术语环境科学与工程技术领域，具体涉及检测和鉴定致病菌的技术。
背景技术
现阶段国内外常用于检测和鉴定致病菌的方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、PCR等一些简单的分子生物学和免疫学方法。
传统生化鉴定法(如分离培养、生化鉴定等)应用最广泛，是GB/T 4789-2003《食品卫生微生物学检验》等国标检测程序，该方法能够得到样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果，由于其操作简单、准确性好且经济而获得广泛采用，但该法一般都需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定等4个步骤，整个过程通常需要3-7天，检测周期长，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落，另外，培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测都需要占用大量的实验室工作量，该法的检测灵敏度低，不能实现致病菌有效的实时快速监测和防控。
免疫学检测技术主要是采用酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定，其基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。该法可检测沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌O157等致病微生物。免疫学检测技术简单、方便，较传统检测技术迅速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。
聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction，PCR)是一种体外核酸扩增技术，其基本原理是在体外适宜的条件（如镁离子浓度）和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），以目标基因组DNA上正、反相两引物间的特定的双链DNA片段(或称靶DNA)进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25～35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍，经琼脂糖或聚丙烯酰氨凝胶电泳和染色剂如溴化乙锭（EB）染色后在紫外下观测到相应的条带。PCR虽为一种特异灵敏、简便快速的检测技术，但该方法需要较长时间的样品纯化处理过程，且一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种同时检测水中13种致病微生物的基因芯片。
本发明提出的同时检测水中13种致病微生物的基因芯片，芯片采用的片基为醛基化片基，在醛基化片基上整列分布探针与对照及空白的点样涂层，其特征在于：所述醛基化片基上的点样矩阵为10×7，所述探针包括针对13种菌株的13条定位探针和阳性对照探针，9条阴性对照探针。
其中13条定位探针和阳性对照探针的基因序列分别如表1：
Figure 482164DEST_PATH_IMAGE001
本发明提出的基因芯片的检测对象及其种属如下表：
表2  检测对象及其属种
Figure 755013DEST_PATH_IMAGE002
本基因芯片的优点是：其检测结果同传统的分离培养方法有较好的符合度，与GB法鉴定结果一致，符合率达到100%；检测灵敏度比PCR方法检测灵敏度高出10倍；可一次检测13种致病微生物，稳定性好，特异性高，适用于实际检测工作。
附图说明
图1是本发明所述芯片的探针的排布示意图；
图2是标准菌株DNA芯片（即是本发明的芯片）杂交结果；
图3 是基因组DNA芯片（即是本发明的芯片）检测灵敏度评价(A-H所使用的DNA同图12-1)
图4是芯片的灵敏度评价杂交信号强度图。
图5是自然水体芯片杂交结果图。 
具体实施方式
以下具体说明本发明的内容：
实施例1：检测对象的引物和探针设计
根据Genbank中13种细菌的序列，通过序列比对，结合相关文献，筛选出13种微生物的特异DNA序列。由于Genbank上这些菌株的序列资源较为丰富，分析这些特异序列之后直接进行靶序列的筛选，并根据靶序列设计相应的引物，得到了针对这13种菌株的13对PCR引物，同时选择所有细菌中都含有的16S基因设计引物和探针作为阳性参照。引物和探针的设计选用Primer Premier 5.0软件进行，且所有引物和探针设计完成后，进行Blast，与GenBank已有序列的同源性不高于40%，以确保引物和探针之间的特异性。
在PCR引物设计过程中主要考虑以下因素：引物长度为20~25bp，产物长度100-700bp，且不同细菌的PCR产物可以通过琼脂糖电泳进行区分；Tm值为58~60℃左右；参数设计尽量严格，尽量避免引物二聚体、发夹等结构形成，G+C%含量为40％~60%，引物对的3’端没有3个碱基以上的互补配对，且考虑与序列内其他部位序列的同源性较低。对很难按照上述标准设计引物的一些序列，降低标准重新设计引物，直至设计出合适的引物。
探针设计时，选择Tm值为65~70℃之间；尽量避免引物二聚体、发夹等结构形成；且与序列内其他部位序列的同源性低；3’端没有3个碱基以上的互补配对。设计的引物和探针序列见表1
表1  用于检测13种细菌的引物和探针序列
实施例2：芯片的点制
芯片采用的片基为醛基化片基，在湿度60％，温度为25℃的条件下点样。点样矩阵为10×7，每张玻片10个矩阵。
醛基化修饰的片基表面使用硅烷化试剂通过共价键在玻片表面形成氨基，再利用醛基化试剂进行修饰，使其成为表面含有醛基的片基。一个典型的醛基化表面上通常有一个大约10个碳原子组成的脂肪族基团的手臂分子，在其末端是一个反应活性醛基。在醛基化表面固定的DNA分子必须具有一个伯胺基，因此我们研究中设计的所有探针在5’端均修饰有氨基，氨基化探针分子和片基表面的醛基间发生反应形成希夫（Schiff）碱，从而将探针连接在片基表面，形成芯片。
芯片上探针排布参见图1和表3。 
P P P P P P P
P 金葡 金葡 金葡 结核 结核 结核
P 炭疽 炭疽 炭疽 O157 O157 O157
P 鼠疫 鼠疫 鼠疫 志贺 志贺 志贺
P 幽门 幽门 幽门 霍乱 霍乱 霍乱
P N N N 沙门 沙门 沙门
P 肺克 肺克 肺克 军团 军团 军团
P 大肠 大肠 大肠 李斯特 李斯特 李斯特
P 16S 16S 16S N N N
P N N N B B B
实施例3：基因芯片的检测效果
1、 引物和探针的特异性
根据所有引物和细菌DNA的实验结果，将各种引物和细菌的交叉反应结果见表4。
表4  引物和细菌DNA之间的交叉反应试验结果汇总
Figure 500432DEST_PATH_IMAGE004
注：（1）由于大肠杆菌和O157的亲缘关系很近。因此用大肠杆菌引物和O157菌DNA之间产生一条特异性的条带。但用O157的引物扩增大肠杆菌的DNA无条带产生，因此，不影响O157的检出。
（2）用O157的引物扩增肺炎克雷伯菌的DNA产生一个非特异性的约1500bp的条带，但无杂交信号；用李斯特菌的引物扩增大肠杆菌和肺炎克雷伯菌DNA，也产生一个约1500bp的条带，但无杂交信号。因此这几个非特异片段的产生不影响杂交结果的检测。
2、基因芯片的特异性
分别使用所设计的每一条探针，对相应的菌株DNA进行检测，每个标准菌株DNA检测结果见图2的1-14。从图中可以看出，所设计的探针对相应的菌株检测均可以得到正确的检测结果。
3、灵敏度实验
用PCR方法扩增经10倍梯度稀释的致病菌标准菌株DNA，以肠炎沙门氏菌（ATCC13076）为例，将扩增后的产物进行芯片杂交。检测结果的扫描图见图3，利用Gene Pix Pro 6.0软件对数据进行分析，见图4。
图中所使用的DNA量分别为：A:20ng；B:2ng；C: 2×10-1 ng；D: 2×10-2 ng；E: 2×10-3 ng；F: 2×10-4 ng；G: 2×10-5 ng；H: 2×10-6ng；I: 2×10-7 ng；J: 2×10-8 ng。
可以看出，采用芯片的方法检测，当DNA为2 pg 时，信噪比为11.38。一般认为，当信号强度高于背景值2倍时，所测得的信号是有效信号，所以此时的检测信号仍为有效信号，亦即芯片的检测灵敏度为2 pg的DNA。
 实施例4：实际样本的检测
以长江三峡库区饮用水源地水为监测对象，选取位于长江流域重庆段的五个自来水厂的取水口进行水样采集；同时，还选取市政污水处理厂的排放口、食品加工厂的污水排放口以及景观水域进行水样采集，以检测基因芯片的检测结果。
于每个采样点采集5L水，样品采集信息见表5，用无菌塑料瓶封装，当日送往实验室。室温静置1h~2h后，分别取上清和下层沉淀1L~2L加入Milliflex Plus浓缩仪进行浓缩。按照说明书的方法处理并提取DNA，取10μL样本DNA用于本研究中设计的PCR和基因芯片进行检测。与此同时，每份样品取100mL上清和下层沉淀，按GB/T 4789-2008进行大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌的选择性增菌和分离培养、鉴定；志贺氏菌采用GB/T 4789-2003进行分离、培养和鉴定，并与VITEK系统鉴定结果进行比较。
表5  样本采集信息
Figure 936093DEST_PATH_IMAGE005
将提取的水样DNA进行基因芯片检测，部分芯片检测结果见图5（阴性杂交结果未列出）。如图所示，4号水样检测出大肠菌，7号水样检测出鼠疫、肺炎克雷伯和军团菌；8号水样军团菌和大肠菌呈阳性。
采集的水样同步进行分离培养，结果见表6。在15份水体样品中，大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和志贺氏菌的分离结果和芯片检测结果完全一致。有4份样品芯片检测出鼠疫耶尔森氏菌阳性，3份样品肺炎克雷伯菌阳性，经测序验证，芯片检测结果正确。
表6 水样检测结果
编号 分离结果 富集、基因芯片检测
1 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
2 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
3 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
4 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
5 未检出 未检出
6 未检出 未检出
7 大肠杆菌+ 大肠杆菌+，肺炎克雷伯菌+，鼠疫菌+
8 大肠杆菌+ 大肠杆菌+，肺炎克雷伯菌+，鼠疫菌+
9 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
10 大肠杆菌+ 大肠杆菌+
11 未检出 未检出
12 未检出 未检出
13 沙门氏菌+ 鼠疫菌+，肺炎克雷伯菌+，沙门氏菌+，大肠杆菌+
14 沙门氏菌+ 鼠疫菌+，大肠杆菌+，沙门氏菌+
15 未检出 未检出

Claims (2)

1.一种同时检测水中13种致病微生物的基因芯片，芯片采用的片基为醛基化片基，
在醛基化片基上整列分布探针与对照及空白的点样涂层，其特征在于：所述醛基化片基上的点样矩阵为10×7，所述探针包括针对13种菌株的13条定位探针和阳性对照探针，9条阴性对照探针；
其中13条定位探针和阳性对照探针的基因序列分别如下表：
Figure 318470DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的同时检测水中13种致病微生物的基因芯片，其特征在于：所述醛基化片基是在片基表面进行醛基化修饰，其是使用硅烷化试剂通过共价键在玻片表面形成氨基，再利用醛基化试剂进行修饰，使其成为表面含有醛基的片基；所述醛基化片基上的所有探针在5’端均修饰有氨基，氨基化探针分子和片基表面的醛基间发生反应形成希夫（Schiff）碱，从而将探针连接在片基表面，形成芯片。
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