CN102703589A - 基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增病原微生物的特异性基因片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得检测结果；所检测的13种病原微生物包括：大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌。
Description
技术领域
本发明属于环境科学与工程技术。
背景技术
现阶段国内外常用于检测和鉴定致病微生物的方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、PCR等一些简单的分子生物学和免疫学方法。
传统生化鉴定法（如分离培养、生化鉴定等）应用最广泛，是《食品卫生微生物学检验（GB/T 4789-2003）》等国标检测程序，该方法能够得到样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果，但是大都需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定4个步骤，整个过程通常需要3~7天，检测周期长，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落，另外，培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测都增加了实验室的工作量，并且检测灵敏度低，不能实现有效的实时快速监测和防控。
免疫学检测技术主要是采用酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA），ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可测抗原，也可测抗体，可进行定性和定量测定，基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应。该法可检测沙门氏菌、军团菌、大肠杆菌O157等致病微生物。免疫学检测技术简单、方便，较传统检测技术快速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。
聚合酶链式反应（Ploymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增技术，其基本原理是在体外适宜的条件（如镁离子浓度）和Taq DNA聚合酶的作用下，利用游离的脱氧核糖核苷酸（dNTP），以目标基因组DNA上正、反相两引物间的特定的双链DNA片段（或称靶DNA）进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25~35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍，经琼脂糖或聚丙烯酰氨凝胶电泳和染色剂如溴化乙锭（EB）染色后在紫外光下观测到相应的条带。PCR虽为一种特异、灵敏、简便快速的检测技术，但该方法需要较长时间的样品纯化处理过程，且一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性；同时，一次一般只能检测一种或少数几种微生物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法。
本发明采用以下技术方案：
一种基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法，采用多重PCR扩增13种致病微生物大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌的特异性基因序列片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得检测结果。
所述方法具体包括以下步骤：
（1）水样处理
采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；
（2）DNA模板提取
采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒或者具有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒进行核酸提取，取10uL样本DNA进行下一步程序；
（3）多重PCR扩增目的片段
采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，浓度为2.5 mmol/L的dNTP0.1－0.3μL，浓度为10－20μmol/L的各种混合引物（指13种病源微生物的引物）0.4－0.8μL，50×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL；
PCR循环参数：
95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；PCR产物4℃保存备用；
（4）样本标记：
在15μL的 SBE-tags荧光标记反应体系（单碱基延伸标签SBE-tags）中含10×Reaction Buffer1.0－2.0 μL，混合SBE-tags引物（10－20μmol/L）各0.4－0.8 μL，Cy3-ddATP（10μmol/L）0.1－0.5 μL，Sequencing多聚酶（5 U/μL）0.1－0.5 μL，多重PCR纯化产物2－6μL，双蒸水补至15μL；循环参数：96℃预变性3min，接着作36个循环，每个循环包括96℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸20 s；循环结束后在72℃延伸5 min；标记产物避光保存于4℃；
（5）芯片杂交与洗片
芯片杂交前使用预杂交液进行预杂交处理，之后将荧光标记产物、阳性质控和杂交液混合均匀后，滴加在芯片上，在48℃杂交2 h。杂交完成后，洗片；
（6）芯片扫描图像分析；根据芯片排布图（如图1），分析确定样本中所含微生物的种类。
发明的优点及积极效果：
本检测方法采用基于单碱基延伸标签反应的基因芯片技术（上面的（4）步骤可以看出）与多重PCR方法联用，优化了上述13种致病菌的基因芯片检测方法，具有较强的特异性、灵敏度和实际检测的适用性。用常规的方法检测上述13种致病菌，需要的时间至少为两天，而对于李斯特菌的常规检测方法全过程至少需要四至七天，本检测方法可将整个检测时间缩短至8小时以内，比现有的细菌学诊断更快速、简便、经济和实用，并且同时检测多种致病菌。
通常水体中的病原微生物含量相对较少，尤其是水源水体，有时部分病原微生物处于亚致死状态，这就需要一个前增菌过程以达到系统的检测限。本检测方法采用Milliflex Plus浓缩仪或者可以达到浓缩收集效果的类似仪器，对水样进行前期浓缩集菌后，就可以快速地完成微量病原微生物的快速检测。通过对水样的浓缩集菌，基因芯片对致病菌的检出率达到5.0×102 cfu/mL，较原来提高了100倍。
本检测方法具备重复性好、稳定性强、灵敏度及特异性高、操作简单、高通量及快速检测等诸多优点，为水体致病菌检测技术的发展提供了良好的理论和实践基础。
附图说明
图1是基因芯片示意图；
图2是自然水体芯片杂交结果，其中A表示4号水样检测，B表示8号水样检；C表示14号水样；
图3是使用BLAST进行序列比对结果。
具体实施方式
以下进一步详细说明本发明的内容：
本方法主要针对水中可能存在的和突发公共事件发生时可能进入水中的13种致病微生物，其名称见下表。
表1 检测对象
| 序号 | 中文名 | 英文名 |
| 1 | 大肠埃希菌 | E. coli |
| 2 | 肠出血性大肠杆菌O157:H7 | Enterohemorrhagic E. coli O157:H7 |
| 3 | 嗜肺军团菌 | L. peneumophila |
| 4 | 肠炎沙门菌 | S. enteritidis |
| 5 | 志贺氏菌 | Shigella |
| 6 | 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus |
| 7 | 单核细胞增生李斯特菌 | L. monocytogenes |
| 8 | 幽门螺旋杆菌 | Helicobacter pylori |
| 9 | 结核分枝杆菌 | M. tuberculosis |
| 10 | 肺炎克雷伯菌 | K. penumoniae |
| 11 | 霍乱弧菌 | V. cholerae |
| 12 | 炭疽杆菌 | B. anthracis |
| 13 | 鼠疫耶尔森菌 | Y. pestis |
检测方法：
1 水样处理
采集适量水样，用无菌塑料瓶封装，当日送往实验室。室温静置1h~2h后，取上清液加入Milliflex Plus浓缩仪滤清漏斗装置的漏斗内。开启浓缩仪进行浓缩集菌，时间3分钟。浓缩完成后，抽干滤膜，将整个漏斗开口放入4℃冰柜，30min~60min后待滤膜表面完全干燥后取出，用镊子将含有细菌的滤膜从浓缩仪滤瓶内取下，放入1.5mL离心管内，用已经灭菌过的手术剪剪成细末状。采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒进行核酸提取，按试剂盒说明书所述的试剂量的3倍进行加样和提取，DNA最后溶解于50??L ddH2O中。取每份水样中提取的核酸10??L分别进行1%琼脂糖电泳，观察核酸提取质量；取10uL样本DNA进行下一步程序。
2 多重PCR扩增目的片段
采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.1－0.3μL，浓度为10－20μmol/L的各种混合引物0.4－0.8μL，50×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL；
PCR循环参数：95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；4℃保存备用。
3 样本标记
在15μL荧光标记反应体系（单碱基延伸标签 single base extension-tags ,SBE-tags)中含10×Reaction Buffer 1.5μL，混合SBE-tags引物（20μmol/L）各0.6μL，Cy3-ddATP（10μmol/L）0.2μL，Sequencing多聚酶（5 U/μL）0.2μL，3μL多重PCR纯化产物，9.5μL ddH2O。循环参数：96℃预变性3min，接着作36个循环，每个循环包括96℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸20 s；循环结束后在72℃延伸5 min；标记产物避光保存于4℃。
[0021] 4 芯片杂交与洗片
芯片杂交前使用预杂交液进行预杂交处理1 h。洗涤后将荧光标记的样本滴加在芯片上，放在杂交盒中，于48℃杂交2 h。杂交完成后，进行芯片洗涤，离心甩干。洗涤和甩干过程注意避光操作，甩干后的芯片在避光盒中备用。
芯片上探针排布参见图1和表2。
| P | P | P | P | P | P | P |
| P | 金葡 | 金葡 | 金葡 | 结核 | 结核 | 结核 |
| P | 炭疽 | 炭疽 | 炭疽 | O157 | O157 | O157 |
| P | 鼠疫 | 鼠疫 | 鼠疫 | 志贺 | 志贺 | 志贺 |
| P | 幽门 | 幽门 | 幽门 | 霍乱 | 霍乱 | 霍乱 |
| P | N | N | N | 沙门 | 沙门 | 沙门 |
| P | 肺克 | 肺克 | 肺克 | 军团 | 军团 | 军团 |
| P | 大肠 | 大肠 | 大肠 | 李斯特 | 李斯特 | 李斯特 |
| P | 16S | 16S | 16S | N | N | N |
| P | N | N | N | B | B | B |
5、芯片扫描图像分析
芯片用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪扫描。使用532nm单色荧光、10μm分辨率，根据信号点的饱和程度调节PMT（光电倍增管）值，调节范围在PMT550-PMT700。利用GenePixPro软件（Axon Instruments，USA）提取得到每个位点探针的荧光信号强度值。计算每条探针荧光信号平均值后，用cutoff值（背景信号平均值+3SD）去除信号低下的探针，为方便计算起见，低于或等于cutoff值的探针荧光信号值为0。只有高于cutoff值和阳性参照探针信号值的10%的探针信号被视为有效信号。
实施例
以长江三峡库区饮用水源地水为检测对象，选取位于长江流域重庆段的五个自来水厂的取水口进行水样采集；同时，还选取市政污水处理厂的排放口、食品加工厂的污水排放口以及景观水域进行水样采集，应用本方法进行检测，水样信息见下表。
表3 水样信息
| 编号 | 水样名称 | 采集点 | 采集地点描述 |
| 1 | 长江饮用水水源地水1 | 某水厂取水点 | 上游500m处，河边水流平稳处，水下20cm处取水 |
| 2 | 长江饮用水水源地水2 | 某饮品站取水点 | 上游500m处，河边水流平稳处，水下20cm处取水 |
| 3 | 长江饮用水水源地水3 | 某自来水公司取水点 | 上游500m处，河边水流平稳处，水下20cm处取水 |
| 4 | 长江饮用水水源地水4 | 某自来水公司水厂 | 上游500m处，河边水流平稳处，水下20cm处取水 |
| 5 | 对照1 | 实验室 | |
| 6 | 对照2 | 实验室 | |
| 7 | 长江饮用水水源地水5 | 某水厂 | 上游500m处，河边水流平稳处，水下20cm处取水 |
| 8 | 处理后的市政污水1 | 某污水处理厂 | 污水排放口处，用取样桶取水 |
| 9 | 处理后的市政污水2 | 某污水处理厂 | 污水排放口处，用取样桶取水 |
| 10 | 处理后的市政污水3 | 某污水处理厂 | 污水排放口处，用取样桶取水 |
| 11 | 景观水1 | 某景观湖 | 湖边，水下20cm处取水 |
| 12 | 景观水2 | 某花卉园 | 湖中心，水下20cm处取水 |
| 13 | 食品厂废水1 | 某食品厂 | 泡椒凤爪生产废水，污水未经处理，在排放口取样 |
| 14 | 食品厂废水2 | 某饮料厂 | 唯一饮料生产废水，污水未经处理，在排放口取样 |
| 15 | 食品厂废水3 | 某食品厂 | 泡椒凤爪生产废水，污水未经处理，在排放口取样 |
部分检测结果见图2，（阴性杂交结果未列出）。如图2所示，A表示4号水样检测出大肠杆菌，B表示8号水样检测出大肠菌、鼠疫和肺炎克雷伯菌；C表示14号样本检测出鼠疫菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌。
采集的水样同步进行分离培养，结果见表3。在15份水体样品中，大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和志贺氏菌的分离结果和本方法的检测结果完全一致。有4份样品芯片检测出鼠疫耶尔森氏菌阳性，3份样品肺炎克雷伯菌阳性，经测序验证，芯片检测结果正确。结果表明，通过富集提高了基因芯片对细菌的检测效果。联合利用浓缩富集和芯片检测方法同传统的分离培养方法有较好的符合度，与GB法鉴定结果一致，符合率达到100%，说明所研究的水体致病菌基因芯片检测体系稳定性好，特异性高，适用于实际检测工作。
表4 水样检测结果
| 编号 | 分离结果 | 富集、基因芯片检测 |
| 1 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 2 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 3 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 4 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 5 | 未检出 | 未检出 |
| 6 | 未检出 | 未检出 |
| 7 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+，肺炎克雷伯菌+，鼠疫菌+ |
| 8 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+，肺炎克雷伯菌+，鼠疫菌+ |
| 9 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 10 | 大肠杆菌+ | 大肠杆菌+ |
| 11 | 未检出 | 未检出 |
| 12 | 未检出 | 未检出 |
| 13 | 大肠杆菌+ | 鼠疫菌+，肺炎克雷伯菌+，沙门氏菌+，大肠杆菌+ |
| 14 | 大肠杆菌+ | 鼠疫菌+，肺炎克雷伯菌+，大肠杆菌+ |
| 15 | 未检出 | 未检出 |
表4 样本测序分析结果
结果表明，通过富集提高了基因芯片对细菌的检测效果。联合利用浓缩富集和芯片检测方法同传统的分离培养方法有较好的符合度，与GB法鉴定结果一致，符合率达到100%，说明所研究的水体致病菌基因芯片检测体系稳定性好，特异性高，适用于实际检测工作。
13种细菌的引物和探针序列见《水体中致病菌快速检测的基因芯片技术研究》（解放军医学杂志，2010年第9期，1117-1120）：
用于检测13种细菌的引物和探针序列
序列表：
SEQ ID NO. 1
<110>中国人民解放军后勤工程学院；上海生物芯片有限公司
<120>基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法
<160>14
<210>1
<211> 41bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测志贺菌(Shigella)
<400>1
AGGCTTACCGTCTGATTGCTGGTCATTTGCTGTCACTCCCG
SEQ ID NO. 2
<160>14
<210>2
<211> 41bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400>2
AGCGAGCATACGGCAATACTCGTTGACTGCCTCTTCGCTGT
SEQ ID NO. 3
<160>14
<210>3
<211> 45bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测肠出血性大肠杆菌O157 (Enterohemorrhagic E. coli O157:H7)
<400>3
AACGCTTGGTCTAAACTCCCTCAATTTATCGTTTCCACTACCACC
SEQ ID NO. 4
<160>14
<210>4
<211> 41bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测大肠埃希杆菌(E. coli)
<400>4
CGAATCAGTCTTGCTCATCGTCGCTATCTGGCTGACTGCTT
SEQ ID NO. 5
<160>14
<210>5
<211> 43bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)
<400>5
CGTTGCCGAGTTTCCATGTAGAAATCTGCCAGTCACCTCCGCC
SEQ ID NO. 6
<160>14
<210>6
<211> 42bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测单增李斯特菌(L. monocytogenes)
<400>6
ACTACGCAACACTGAACGGACGATTGGCGTCTTAGGACTTGC
SEQ ID NO. 7
<160>14
<210>7
<211> 41bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测军团菌(L. peneumophila)
<400>7
CTGAATCCTCCATCCGTGTTAATCAGGAATCGCTGTGCGGC
SEQ ID NO. 8
<160>14
<210>8
<211> 40bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测肺炎克雷伯菌(K. penumoniae)
<400>8
CAACGCACTGACCATACCTACTTTGTTATTCGGGCCAAGC
SEQ ID NO. 9
<160>14
<210>9
<211> 43bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)
<400>9
AAGTCAACGTAAGCAGCAGCTTCTGTTACCGCCAATGTCAATC
SEQ ID NO. 10
<160>14
<210>10
<211> 41bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测结合分枝杆菌(M. tuberculosis)
<400>10
GTTTCAGCACATGTCGAGACGCGACACCCGAACAACAGAGC
SEQ ID NO. 11
<160>14
<210>11
<211> 42bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测鼠疫耶尔森菌(Y. pestis)
<400>11
GATGATCGCTCTACGTGACAAAACTGTCTGGCGTGGGTGAAG
EQ ID NO. 12
<160>14
<210>12
<211> 45bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)
<400>12
TCAGTCCATCTTGCTACAGGTAGGGCTTGCTATTCAACTTGCGGT
EQ ID NO. 13
<160>14
<210>13
<211> 45bp
<212>核苷酸
<213>人工序列，用于检测霍乱弧菌(V. cholerae)
<400>13
GACGAGTATATGCATCTGCGAAAGTCTTACATTGTGCTTGGGTCA
EQ ID NO. 14
<160>14
<210>14
<211> 44bp
<212>核苷酸
<213>人工序列
<400>14
AGCTCACCATGTACGAACTGGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT
Claims (4)
1.一种基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增病原微生物的特异性基因片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得检测结果；所检测的13种病原微生物包括：大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
（1）水样处理
采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；
（2）DNA模板提取
采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒，或者具有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒提取样本的DNA，取10uL样本DNA进行下一步程序；
（3）多重PCR扩增目的片段
采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，浓度为2.5 mmol/L 的dNTP0.1－0.3μL，引物各0.4－0.8μL，浓度为10－20μmol/L，50×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL；所述引物是指13种病原微生物的引物；
PCR循环参数：95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；产物4℃保存备用；
（4）样本标记：
采用单碱基延伸标签反应（SBE-tags）进行；15μL的 SBE-tags反应体系含10×Reaction Buffer 1.0－2.0μL，SBE-tags引物（10－20μmol/L）0.4－0.8μL，浓度为10μmol/L 的Cy3-ddATP 0.1－0.5μL，活性浓度为5 U/μL 的Sequencing多聚酶 0.1－0.5μL，多重PCR纯化产物2－6μL，双蒸水补至15μL；循环参数：96℃预变性3min，接着作36个循环，每个循环包括96℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸20 s；循环结束后在72℃延伸5 min；
标记产物避光保存于4℃；
（5）芯片杂交与洗片
芯片杂交前使用预杂交液进行预处理1h以去除玻璃基片上多余的活性醛基基团，之后将SBE产物、荧光质控探针和杂交缓冲液加入，在48℃杂交2 h，杂交结束后洗片，除去芯片上未杂交上的成分；
（6） 芯片扫描，根据扫描结果，进行图像分析，判断样本中所含有的微生物种类。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述基因芯片可同时检测水体中13种致病微生物，芯片上同时含有阳性质控位点、阴性质控位点、以及空白对照等位点；所述芯片的所有探针在5’端均修饰有氨基。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述芯片在进行预杂交处理之后，进行荧光标记的样本杂交，杂交完成后洗涤、甩干，进行芯片扫描，分析扫描图像，确定样本中含有的微生物种类。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN103540668A (zh) * | 2013-10-22 | 2014-01-29 | 宁波大学 | 检测10种海域致病菌的基因芯片 |
| CN107446999A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-12-08 | 江苏师范大学 | 一种快速诊断肠道耐药细菌的技术 |
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| CN113373248A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-09-10 | 壹健生物科技(苏州)有限公司 | 一种检测致病性细菌的探针组合、芯片、试剂盒及方法 |
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Non-Patent Citations (4)
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|---|
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