CN105039572A - 一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，它包括下述步骤：1）采样布点；2）样品采集；3）样品预处理；4）DNA提取；5）实时荧光定量PCR；6）高通量测序；7）数据库建立；8）潜在病原微生物种类和丰度分析。本发明可对某一饮用水管网不同类型管道生物膜微生物群落（包括细菌和真核微生物）进行监测分析，并确定该管网生物膜潜在病原微生物种类和丰度。在饮用水管道生物膜检测方面，与传统培养方法相比，本发明具有检测时间短、分析结果全面等优点，对系统深入地评价饮用水管网潜在微生物风险，优化管网管道配置有重要意义。

Description

一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法
技术领域
本发明属于分子生物学和给排水工程技术领域，特别涉及一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法。
背景技术
饮用水安全与人体健康息息相关。在给水工业中，饮用水管网担负着饮用水输送功能，但管网水质二次污染不可忽视，达标的出厂水经管网输送到用户的过程会发生水质恶化现象。其中，微生物污染是管网水质恶化的重要原因。管网微生物主要有悬浮微生物和吸附在管道内壁的生物膜两种存在形式，研究表明生物膜生物量远大于水体生物量，占管网生物量90%以上。
到目前为止，管网饮用水微生物检测主要集中在水中的悬浮微生物。但实际上，管壁生物膜才是管网生物不稳定的主要源头。多种因素(滞留、水力波动)皆会导致生物膜从管壁脱落进入水体，进而造成水体颜色和气味恶化，对人体健康造成潜在危害。然而目前国内对管网生物膜微生物的研究和监测较少，且方法多停留在细菌学指标，较多的采用传统培养方法检测分析微生物，包括异养菌平板技术法测定生物膜中可培养异养菌数量，或利用选择性培养基对生物膜中某些指示性的微生物，如大肠杆菌、肠球菌和沙门氏菌进行检测。对大多数微生物样本而言，形态学仅能提供极少的线索。且传统培养方法由于其高度选择性，仅能培养少量的微生物，不能反映管网生物膜中大量的微生物信息特征。此外，培养方法耗时、耗力、操作误差大，并不适合对管网微生物群落进行动态监测的要求。近年来，基于分子生物学的方法如定量PCR、高通量测序等方法快速发展，与传统培养方法相比，此类方法更为准确、灵敏，且能够对微生物群落数量及群落多样性进行全面深入地分析。但到目前为止，此类方法在饮用水生物膜微生物监测中应用较少。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，并提供了一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，该方法包括以下步骤：
1）样品采集：在无菌条件下对管壁生物膜进行采集，获得管壁生物膜样品；
2）样品预处理：将管壁生物膜样品摇床振荡，摇床振荡转速设置为160-200转每分钟；通过70-80目的筛网进行过筛，并将其制成生物膜悬液，将生物膜悬液离心，离心转速设置为6000-8000转每分钟，使离心管管底的离心沉淀物富集至0.5-1g，离心后的样品如不能立即进行DNA提取，样品需置于-20℃以下温度冻存；操作过程中与管壁生物膜样品直接接触的所有物品进行灭菌处理；
3）DNA提取：提取步骤2）离心沉淀物中的总DNA；
4）PCR扩增步骤3）总DNA中的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列，将两种目标基因序列分别导入质粒，制备质粒标样；将质粒标样10倍梯度稀释后进行荧光定量PCR，根据每个稀释度的循环阈值和基因拷贝数绘制细菌和真核微生物定量标准曲线，其中：定量标准曲线的R2>0.99，每个稀释度重复3次荧光定量PCR，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值用于绘制定量标准曲线；对步骤3）总DNA进行荧光定量PCR，并重复3次，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值作为样品循环阈值，根据样品循环阈值和定量标准曲线计算管壁生物膜样品的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA基因拷贝数；
5）高通量测序：通过高通量测序获取步骤3）总DNA中细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列；
6）数据库建立：
利用Mothur软件对步骤5）中总DNA中细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列进行质量控制，获取优质序列；其质量控制标准为：引物错配率和模糊碱基数低于2，序列评分高于85，序列长度为300-500bp，无嵌合体；将优质序列分别与Silva细菌库或真核微生物库序列进行比对，确定生物膜样品细菌和真核微生物的系统分类，建立管网管道生物膜微生物数据库；
7）潜在病原微生物种类和丰度分析：根据饮用水管网常见病原微生物库，从NCBI获取该库中病原微生物16SrRNA或18SrRNA基因序列，建立饮用水管网常见病原微生物基因序列库，将步骤6）获得的优质序列与饮用水管网常见病原微生物基因序列库进行比对，确定潜在病原微生物种类及丰度。
所述的饮用水管网常见病原微生物库通过查找公开文献中报导的饮用水管网病原微生物进行建立。
所述的样品采集的具体方法为：拆卸管道，用试管刷刷取管道内壁生物膜，同时用生理盐水冲洗管壁和试管刷，全部生物膜样品保存于玻璃瓶中；采样过程与生物膜有直接接触的物品，包括试管刷、生理盐水和专用样品保存瓶，在采样前需进行灭菌处理，样品如不能立即预处理，需置于4℃冰箱冷藏。
所述的步骤4）中荧光定量PCR反应体系为25μL体系：12.5μLSYBRGreenSupermix、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、10.5μL灭菌去离子水及1.0μL模板DNA；细菌16SrRNA扩增引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG；真核微生物18SrRNA扩增引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。
所述的步骤5）中高通量测序所采用的细菌16SrRNA扩增引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG。PCR程序为：95.0℃5min；95.0℃30s，55.0℃30s，72.0℃1min，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever；真核微生物18SrRNA扩增引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。PCR程序：PCR程序为：95.0℃2min；95.0℃30s，56.0℃30s，72.0℃1min30s，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever。
与现有技术相比，本发明建立了一种全面、系统地监测饮用水管网管道生物膜微生物的方法，可对饮用水管网不同类型管道，如不同位置、不同管材、不同管龄、不同管径、不同流速区管道生物膜微生物群落（包括细菌和真核微生物）进行监测，并可分析管网生物膜潜在病原微生物种类和丰度。本发明内容对全面反映饮用水管网潜在微生物风险，保障饮用水安全有重要意义。
附图说明
图1是一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明技术实现的方法、创新特征、达成目的易于明白了解，下面结合具体实施案例对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，技术方案如下：
1、采样布点，
根据中国东部某市饮用水管网常规水质监测指标及管网运行情况，对中国东部某市饮用水管网不同管材、不同管龄、不同管径管道生物膜微生物群落进行调查。对照饮用水管网施工设计图，确定生物膜样品采集对应管道位置，确定采样时间和地点。为确保样品间有对比性，取样时间间隔小于1个月。
2、样品采集，
关闭采样管道上游阀门，挖去覆盖管道泥土，清洗管道外壁，切下管道，用长柄试管刷刷取管道内壁生物膜，同时用生理盐水冲洗管壁，将生物膜样品全部取下，保存于无菌玻璃瓶中，4℃冷藏。采样过程与管道生物膜有直接接触，包括试管刷、生理盐水和专用样品保存瓶，在采样前进行灭菌处理。
3、样品预处理，
1）将生物膜样品从4℃冰箱取出；
2）取灭菌的100ml玻璃瓶，加入50-60粒灭菌的玻璃珠（5mm），将60-80ml生物膜样品装入玻璃瓶，摇床震荡15min，转速设置为160转每分钟；
3）将振荡后生物膜样品过筛，筛网规格为80目；
4）取40-45ml过筛的生物膜样品置于50ml离心管，离心10min，转速设置为6000-8000转每分钟；弃去上清液，将剩余生物膜样品重复加载离心，直至离心完所有生物膜样品；
5）用分析天平测定离心管内生物膜样品质量，取0.5-1g样品保存在2ml离心管，置于-20℃冰箱冻存。
4、DNA提取，
取出-20℃冰箱冻存生物膜样品，称取0.25g，按照MOBIO的强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil?DNAIsolationKit)说明提取DNA。
5、实时荧光定量PCR，
1）质粒标样制备。分别PCR扩增生物膜样品总DNA细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列，将两种目标基因序列分别导入质粒中，制备质粒标样；
2）标准曲线制作。将携带细菌16SrRNA或真核微生物18SrRNA目标基因序列的质粒标样进行10倍梯度稀释后荧光定量PCR，根据每个稀释度的循环阈值和基因拷贝数绘制细菌和真核微生物定量标准曲线。R2>0.99标准曲线有效，每个稀释度质粒样品重复3次定量PCR，循环阈值相差小于0.5数据有效；
3）生物膜细菌和真核微生物数量测定。将生物膜样品总DNA荧光定量PCR，根据样品循环阈值和标准曲线，计算生物膜样品细菌16SrRNA或真核微生物18SrRNA基因拷贝数；
4）PCR反应体系为25μL体系：12.5μLSYBRGreenSupermix(Bio-Rad,CA)、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、10.5μL灭菌去离子水及1.0μL模板DNA；
5）细菌引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG；
6）真核微生物引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。
6、高通量测序，
分别扩增生物膜样品细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因片段，利用IonTorrent-PGM测序平台获取细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列。
1）细菌16SrRNA扩增引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG。PCR程序为：95.0℃5min；95.0℃30s，55.0℃30s，72.0℃1min，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever；
2）真核微生物18SrRNA扩增引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。PCR程序：PCR程序为：95.0℃2min；95.0℃30s，56.0℃30s，72.0℃1min30s，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever。
7、数据库建立，
1）利用Mothur软件对高通量测序获得的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列进行质量控制，获取优质序列。质量控制标准为：引物错配率和模糊碱基数低于2，序列评分高于85，序列长度为300-500bp，无嵌合体；
2）将优质序列分别与Silva细菌库或真核微生物库序列进行比对，确定生物膜样品细菌和真核微生物的系统分类，建立该管网管道生物膜微生物数据库。
8、潜在病原微生物种类和丰度分析，
根据饮用水管网常见病原微生物库，从NCBI获取该库中病原微生物16SrRNA或18SrRNA基因序列，建立饮用水管网常见病原微生物基因序列库，将步骤6）获得的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列与饮用水管网常见病原微生物基因序列库进行比对，确定潜在病原微生物种类及丰度。

Claims (7)

1.一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）样品采集：在无菌条件下对管壁生物膜进行采集，获得管壁生物膜样品；
2）样品预处理：将管壁生物膜样品摇床振荡，摇床振荡转速设置为160-200转每分钟；通过70-80目的筛网进行过筛，并将其制成生物膜悬液，将生物膜悬液离心，离心转速设置为6000-8000转每分钟，使离心管管底的离心沉淀物富集至0.5-1g，离心后的样品如不能立即进行DNA提取，样品需置于-20℃以下温度冻存；操作过程中与管壁生物膜样品直接接触的所有物品进行灭菌处理；
3）DNA提取：提取步骤2）离心沉淀物中的总DNA；
4）PCR扩增步骤3）总DNA中的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列，将两种目标基因序列分别导入质粒，制备质粒标样；将质粒标样10倍梯度稀释后进行荧光定量PCR，根据每个稀释度的循环阈值和基因拷贝数绘制细菌和真核微生物定量标准曲线，其中：定量标准曲线的R2>0.99，每个稀释度重复3次荧光定量PCR，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值用于绘制定量标准曲线；对步骤3）总DNA进行荧光定量PCR，并重复3次，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值作为样品循环阈值，根据样品循环阈值和定量标准曲线计算管壁生物膜样品的细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA基因拷贝数；
5）高通量测序：通过高通量测序获取步骤3）总DNA中细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列；
6）数据库建立：
利用Mothur软件对步骤5）中总DNA中细菌16SrRNA和真核微生物18SrRNA目标基因序列进行质量控制，获取优质序列；其质量控制标准为：引物错配率和模糊碱基数低于2，序列评分高于85，序列长度为300-500bp，无嵌合体；将优质序列分别与Silva细菌库或真核微生物库序列进行比对，确定生物膜样品细菌和真核微生物的系统分类，建立管网管道生物膜微生物数据库；
7）潜在病原微生物种类和丰度分析：根据饮用水管网常见病原微生物库，从NCBI获取该库中病原微生物16SrRNA或18SrRNA基因序列，建立饮用水管网常见病原微生物基因序列库，将步骤6）获得的优质序列与饮用水管网常见病原微生物基因序列库进行比对，确定潜在病原微生物种类及丰度。
2.如权利要求1所述的饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，所述的饮用水管网常见病原微生物库通过查找公开文献中报导的饮用水管网病原微生物进行建立。
3.如权利要求1所述的饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，所述的样品采集的具体方法为：拆卸管道，用试管刷刷取管道内壁生物膜，同时用生理盐水冲洗管壁和试管刷，全部生物膜样品保存于玻璃瓶中；采样过程与生物膜有直接接触的物品，包括试管刷、生理盐水和专用样品保存瓶，在采样前需进行灭菌处理，样品如不能立即预处理，需置于4℃冰箱冷藏。
4.根据权利要求1所述的一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，所述的步骤4）中荧光定量PCR反应体系为25μL体系：12.5μLSYBRGreenSupermix、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物、10.5μL灭菌去离子水及1.0μL模板DNA；细菌16SrRNA扩增引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG；真核微生物18SrRNA扩增引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。
5.根据权利要求1所述的一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，所述的步骤5）中高通量测序所采用的细菌16SrRNA扩增引物为515F：AGATCACGTGCCAGCMGCCGCGG和907R：AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG。
6.PCR程序为：95.0℃5min；95.0℃30s，55.0℃30s，72.0℃1min，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever；真核微生物18SrRNA扩增引物为3NDf：GGCAAGTCTGGTGCCAG和R2：ACGGTATMKAWSTCTTCG。
7.PCR程序：PCR程序为：95.0℃2min；95.0℃30s，56.0℃30s，72.0℃1min30s，25个循环；72.0℃5min；4℃Forever。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151111

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