CN105039510A - 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法 - Google Patents

一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法 Download PDF

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Abstract

一种针对膨胀污泥中H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法，涉及污水生物处理领域。H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式(PCR)方法反应体系：2倍浓度的Taq？PreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物；反向引物；加灭菌水到总体积20μl。反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min。③1个循环：温度72℃，时间5-10min。PCR反应后将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。本发明可以高效PCR反应扩增，对H.hydrossis丝状菌群进行鉴定分析，为后续该菌种相关菌群发育树分析及菌群绝对定量分析提供基础。

Description

一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法
技术领域
本发明涉及污水生物处理领域，提供一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacterhydrossis(H.hydrossis)丝状菌群的聚合酶链式反应方法，可以高效地对H.hydrossis丝状菌群进行PCR反应扩增，对污泥中H.hydrossis丝状菌菌种进行鉴定分析，为后续菌群定量分析提供技术支持。
背景技术
活性污泥膨胀，根据诱因可分为：因丝状菌异常增殖所导致的丝状菌性膨胀和因粘性物质大量产生积累的非丝状菌膨胀。前者为易发与多发性膨胀，导致产生丝状菌性污泥膨胀的细菌主要有：球衣菌属，假单胞菌属，黄杆菌属，酶菌属。H.hydrossis丝状菌群是引起各污水处理工艺污泥膨胀常见菌种之一，因此考察活性污泥中H.hydrossis丝状菌群及与其相互作用菌种的群落结构特性以抑制其过度生长具有重要意义。
然而，目前国内外由于分析技术的限制，对于各种丝状菌的鉴定与分析方法也不尽相同。①传统的丝状菌鉴定方法是根据丝状菌的形态特征和染色反应来确定丝状菌种属。尽管这种方法很有用，但是存在一定的限制性。例如1701,0092,0961等类型丝状菌的形态随条件的变化而变化，且此方法对操作人员要求较高，需专门培训，否则容易出现判断错误的情况。②分子生物法鉴定污泥丝状菌。目前应用最为有效和广泛的是荧光原位杂交(FISH)方法，它采用特殊荧光素标记核酸(DNA)探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，可以检测细胞DNA或RNA的特定序列存在与否。然而此方法无法进行后续菌群的准确定量及相关菌群发育树分析。
因此，目前缺乏针对H.hydrossis丝状菌群的PCR试验方法，对其中的H.hydrossis丝状菌群进行PCR扩增分析，对相关菌群发育树进行分析以及后续进行该菌群的定量分析。
发明内容
针对上述研究的不足之处，本发明提供针对H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法，可以高效地进行H.hydrossis丝状菌群PCR反应扩增，对污泥中H.hydrossis丝状菌菌群进行鉴定分析，分析相关菌群发育树，同时为后续该菌群定量分析研究提供基础。
针对膨胀污泥中H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法，特征在于：
(1)H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的TaqPreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物(序列为5’-AGGATGAACGCTAGCGGG-3’，浓度为10μm/L)0.5-1μl；反向引物(序列为5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’，浓度为10μm/L)0.5-1μl；加灭菌水到总体积20μl。
(2)H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。
②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min。
③1个循环：温度72℃，时间5-10min。
(3)后续进行H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)反应，并将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带。
进一步，本发明膨胀污泥中H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法：
(1)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的TaqPreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；正向和反向引物(10μm/L)各0.5-1μl；加灭菌水到总体积20μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(2)将装有阴性对照及样品的200μlPCR反应离心管做好标记，放入TECHNETC-512型PCR仪。
(3)设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2-5min。②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min。③1个循环：温度72℃，时间5-10min进行试验。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法的反应体系和反应程序可以高效地进行H.hydrossis丝状菌群PCR试验，可以得到分离效果良好的目的条带，对该菌群进行定性分析。
(2)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法后续可以进行H.hydrossis丝状菌菌群发育树研究。
(3)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)方法为后H.hydrossis丝状菌菌群定量分析打下了基础。
附图说明
图1为本发明H.hydrossis丝状菌群革兰氏染色图片(1000倍)
图2为本发明H.hydrossis丝状菌群PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图
图3为本发明H.hydrossis丝状菌群凝胶回收产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，本发明H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应(PCR)包括以下步骤：
(1)将膨胀污泥进行革兰氏和纳氏染色，分析其中有无疑似H.hydrossis丝状菌群(见图1)。
(2)DNA提取试剂盒提取污泥中DNA。
(3)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的TaqPreMix试剂10μl；DNA模板1μl；正向引物和反向引物(10μm/L)各0.6μl；加灭菌水到总体积20μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(4)将装有阴性对照及样品的200μlPCR反应离心管做好标记，放入TECHNETC-512型PCR仪。
(5)设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2min。②30个循环：依次为变性温度94℃，时间30s；复性温度51℃，时间40s；延伸温度72°C，时间2min。③1个循环：温度72℃，时间10min。
(6)将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效果良好(图2)，进行下一步。
(7)将目的条带进行割胶，用DNA回收试剂盒进行目的DNA纯化，将纯化产物跑胶看纯化分离效果，得到单一的亮条带(图3)，进行下一步。
(8)将目的DNA与载体连接后转化到感受态细胞。
(9)将转化后的感受态细胞涂板，37℃恒温箱过夜培养。
(10)挑菌摇菌将菌液送测序公司测序，将测序序列与目的菌种的DNA序列对比分析，发现与目的菌群序列一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacterhydrossis丝状菌群的引物，其核苷酸序列为：
正向：5’-AGGATGAACGCTAGCGGG-3’
反向：5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’。
2.一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacterhydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法，其特征在于：
(1)H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的TaqPreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；正向引物0.5-1μl；序列为5’-AGGATGAACGCTAGCGGG-3’，浓度为10μm/L；
反向引物0.5-1μl；序列为5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’，浓度为10μm/L；加灭菌水到总体积20μl；
(2)H.hydrossis丝状菌群聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min；
②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min；
③1个循环：温度72℃，时间5-10min。
3.一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacterhydrossis丝状菌群的PCR的试剂盒，包括，权利要求1所述引物。
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