CN105886503A - 一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法 - Google Patents
一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物和方法,涉及污水生物处理领域。该特异性引物的序列为正向引物(序列为5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTC‑3’);反向引物(序列5’‑AGGTATTCCAGCCACACC‑3’)。(2)聚合酶链式反应方法的反应体系:2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl;DNA模板0.5‑1μl;正向引物和反向引物(浓度为10μm/L)各0.5‑1μl;加灭菌水到总体积20μl。按上述引物、反应体系进行PCR反应,并将扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中跑胶,得到分离良好的DNA亮条带(图1)。本发明对H.hydrossis丝状菌群特异性高,能够更高效地进行PCR试验,方便后续对其菌群进行准确定性和定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及污水生物处理领域,提供一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis(H.hydrossis)丝状菌群特异性引物和方法,与其他引物相比,该引物对H.hydrossis丝状菌群特异性高,能够高效准确地进行H.hydrossis丝状菌群的PCR试验,对后续H.hydrossis丝状菌群进行准确定性和定量分析。
背景技术
目前,活性污泥法污水处理厂及活性污泥法工艺时常发生以H.hydrossis丝状菌群引起的污泥膨胀问题。目前对H.hydrossis丝状菌群的鉴定通常采用较早的Eikelboom丝状菌鉴定方法及荧光原位杂交(FISH)技术。随着聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR试验技术的发展,给H.hydrossis丝状菌群的鉴定及定量提供了新的技术方法。
然而,目前针对H.hydrossis丝状菌群进行PCR试验的引物稀少,且现有引物的特异性不是很高,在进行PCR过程中同时可以扩增大量非目的菌种,对后续的序列分析带来不便。
因此,目前缺乏针对H.hydrossis丝状菌群的特异性引物和方法,对H.hydrossis丝状菌群进行更高效准确的PCR试验分析,以便后续对H.hydrossis丝状菌群进行准确定性和定量。
发明内容
针对上述研究的不足之处,本发明提供针对H.hydrossis丝状菌群新特异性引物和方法,对H.hydrossis丝状菌群特异性高,能够高效地进行H.hydrossis丝状菌群的PCR试验,方便后续对其定性和定量分析。
1.一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物,其特征在于:
正向引物序列为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’;
反向引物序列为5’-AGGTATTCCAGCCACACC-3’。
2.包含所述引物的试剂盒。
3.使用所述引物进行PCR扩增的方法,其特征在于:包括变性、复性和延伸。
聚合酶链式反应方法的反应体系:
2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl;DNA模板0.5-1μl;浓度为10μm/L的正向引物和浓度为10μm/L的反向引物各0.5-1μl;加灭菌水到总体积20μl。
聚合酶链式反应的反应程序:
①1个循环:温度为94℃时间为2-5min。
②30个循环:依次为变性温度94℃,时间20-30s;复性温度50-53℃,时间30s-1min;延伸温度72℃,时间2min。
③1个循环:温度72℃,时间5-10min。
与现有引物相比,本发明具有以下优点:
(1)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群特异性引物和方法能更高效地进行H.hydrossis丝状菌群PCR试验。
(2)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群特异性引物可以更准确地进行后续H.hydrossis丝状菌群定性及定量分析。
附图说明
图1为本发明NCBI数据库中搜索的H.hydrossis丝状菌基因序列
图2为本发明特异性引物在NCBI数据库中特异性比对分析结果图
图3为本发明H.hydrossis丝状菌群PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明,本发明提供的H.hydrossis丝状菌群特异性引物和方法包括以下内容:
(1)NCBI库里查找H.hydrossis丝状菌序列(图1);
(2)对H.hydrossis丝状菌各序列与其他菌序列进行比对分析,选择设计其特异性引物的模板序列:NR_074420.1、M58790.2和NR_042316.1(NCBI检索号);
(3)根据引物设计的一般原则(引物长度、引物GC含量、引物Tm、引物3’端和5′端注意事项、引物序列与模板序列组成的相似性、ΔG值等)进行引物的设计,主要进行设计引物类型、搜索模式、前后引物搜索范围、产物大小、引物长度等参数设置;
(4)得到前后引物后分析其有无①Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构;②Dimer:同一种引物是否会形成二聚体;③False primiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对;④Cross Dimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体,同时查看引物各指标是否符合引物设计原则;
(5)按需要对设计的引物进行结合位点、酶切位点等相应编辑;
(6)将得到的引物与作为设计模板的序列输入NCBI库进行引物特异性比对,分析其特异性(图2),特异性高进行下一步,特异性不高重新进行设计。
(7)准备200μl离心管,依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl;DNA模板1μl;正向引物和反向引物(10μm/L)各0.5μl;加灭菌水到总体积20μl;同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(8)对PCR仪设定反应程序:①1个循环:温度为94℃时间为3min。②30个循环:依次为变性温度94℃,时间30s;复性温度50℃,时间45s;延伸温度72℃,时间2min。③1个循环:温度72℃,时间10min。
(9)将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳试验,观察目的DNA条带的分离效果良好(图3),进行下一步。
(10)将目的条带进行凝胶回收和连接转化后送测序公司测序,将测序序列与目的菌种的DNA序列对比分析,发现与目的菌群序列一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种针对膨胀污泥中Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群特异性引物,其特征在于:
正向引物序列为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’;
反向引物序列为5’-AGGTATTCCAGCCACACC-3’。
2.包含如权利要求1所述引物的试剂盒。
3.使用如权利要求1所述引物进行PCR扩增的方法,其特征在于:包括变性、复性和延伸。
4.如权利要求3所述方法,其特征在于:
聚合酶链式反应方法的反应体系:
2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl;DNA模板0.5-1μl;浓度为10μm/L的正向引物和浓度为10μm/L的反向引物各0.5-1μl;加灭菌水到总体积20μl。
5.如权利要求3所述方法,其特征在于:
聚合酶链式反应的反应程序:
①1个循环:温度为94℃时间为2-5min。
②30个循环:依次为变性温度94℃,时间20-30s;复性温度50-53℃,时间30s-1min;延伸温度72℃,时间2min。
③1个循环:温度72℃,时间5-10min。
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