CN106086176A - 一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法 - Google Patents

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Abstract

一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR试验特异性引物和方法，涉及污水生物处理领域。该特异性引物的序列为正向引物(序列为5’‑AATCAGGTTGAGGTAGGC‑3’)；反向引物(序列5’‑CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT‑3’)。PCR反应体系：2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5‑1μl；正向引物和反向引物(浓度为10μm/L)各0.5‑1μl；加灭菌水到总体积20μl。按上述引物、反应体系进行PCR反应，并将扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳中跑胶，得到分离良好的DNA亮条带(图1)。本发明对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够更高效地进行PCR试验，方便后续对其定性和定量分析，同时只需对PCR产物进行单向测序，省去了双向测序及拼接等操作步骤，节省测序费用。

Description

一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物和方法
技术领域
本发明涉及污水生物处理领域，提供一种Haliscomenobacter hydrossis(H.hydrossis)丝状菌群PCR引物和方法，该引物对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够高效准确地进行H.hydrossis丝状菌群的PCR试验，可以对后续H.hydrossis丝状菌群进行准确定性和定量，同时只需对PCR产物进行单向测序，省去了双向测序及后续序列拼接等操作步骤，节省测序费用。
背景技术
目前，活性污泥法污水处理厂及活性污泥法工艺时常发生以H.hydrossis丝状菌引起的污泥膨胀问题。目前对H.hydrossis丝状菌群的鉴定通常采用较早的Eikelboom丝状菌鉴定方法及荧光原位杂交(FISH)技术。随着PCR和实时定量PCR试验技术的发展，给H.hydrossis丝状菌群的鉴定及定量提供了新的技术方法。
然而，目前针对H.hydrossis丝状菌群进行PCR试验的引物稀少，且现有引物的特异性不是很高，在进行PCR过程中同时可以扩增大量非目的菌种，对后续的序列分析带来不便。此外现有H.hydrossis丝状菌的引物PCR产物序列较长，序列测序过程同时需要正向和反向测序，后期再进行拼接才能完成，测序费用较高。
因此，目前缺乏针对H.hydrossis丝状菌群进行PCR试验简便且特异性高的引物和方法，对H.hydrossis丝状菌群进行高效准确的PCR试验分析，以便对H.hydrossis丝状菌序列进行简便准确测序分析，以便后期对其菌群进行准确定性和定量。
发明内容
针对上述研究的不足之处，本发明提供针对H.hydrossis丝状菌群PCR试验特异性引物和方法，对H.hydrossis丝状菌群特异性高，能够高效地进行H.hydrossis丝状菌群的PCR试验，同时只需对PCR产物进行单向测序，节省测序费用。
1.一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物，其特征在于：
正向引物序列为5’-AATCAGGTTGAGGTAGGC-3’；
反向引物序列为5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’。
2.包含所述引物的试剂盒。
3.使用所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于：包括变性、复性和延伸。
聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；浓度为10μm/L的正向引物和浓度为10μm/L的反向引物各0.5-1μl；加灭菌水到总体积20μl。
聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min；
②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min；
③1个循环：温度72℃，时间5-10min。
与现有引物相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群PCR试验引物和方法特异性高，能高效地进行H.hydrossis丝状菌PCR试验。
(2)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群PCR试验特异性引物可以准确地进行后续H.hydrossis丝状菌群定性及定量分析。
(3)本发明提供的H.hydrossis丝状菌群引物的理论PCR产物只需进行单向测序分析，省去了双向测序及拼接等操作步骤，大大节省了测序分析费用。
附图说明
图1为本发明NCBI数据库中搜索的H.hydrossis丝状菌基因序列
图2为本发明特异性引物在NCBI数据库中特异性比对分析结果图
图3为本发明H.hydrossis丝状菌群PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，本发明提供的H.hydrossis丝状菌群特异性引物和方法包括以下内容：
(1)NCBI库里查找H.hydrossis丝状菌序列，图1；
(2)对H.hydrossis丝状菌群各序列与其他菌序列进行比对分析，选择设计其特异性引物的模板序列：NR_074420.1、M58790.2和NR_042316.1(NCBI检索号)；
(3)根据引物设计的一般原则(引物长度、引物GC含量、引物Tm、引物3’端和5′端注意事项、引物序列与模板序列组成的相似性、ΔG值等)进行引物的设计，主要进行设计引物类型、搜索模式、前后引物搜索范围、产物大小、引物长度等参数设置；
(4)得到前后引物后分析其有无①Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构；②Dimer:同一种引物是否会形成二聚体；③False primiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对；④Cross Dimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体，同时查看引物各指标是否符合引物设计原则；
(5)按需要对设计的引物进行结合位点、酶切位点等相应编辑；
(6)将得到的引物与作为设计模板的序列输入NCBI库进行引物特异性比对，分析其结果(图2)，发现此引物对H.hydrossis丝状菌群特异性高。
(7)准备200μl离心管，依次加入2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板1μl；正向引物和反向引物(10μm/L)各0.5μl；加灭菌水到总体积20μl；同时用灭菌水代替DNA模板进行阴性对照试验。
(8)对PCR仪设定反应程序：①1个循环：温度为94℃时间为2min。②30个循环：依次为变性温度94℃，时间30s；复性温度51℃，时间40s；延伸温度72℃，时间2min。③1个循环：温度72℃，时间10min。
(9)将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳试验，观察目的DNA条带的分离效果良好(图3)，进行下一步。
(10)将目的条带进行凝胶回收和连接转化后送测序公司测序，将测序序列与目的菌种的DNA序列对比分析，发现与目的菌群序列一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种Haliscomenobacter hydrossis丝状菌群PCR引物，其特征在于：
正向引物序列为5’-AATCAGGTTGAGGTAGGC-3’；
反向引物序列为5’-CTTAGCCCCAGTTACTGGTTTT-3’。
2.包含如权利要求1所述引物的试剂盒。
3.使用如权利要求1所述引物进行PCR扩增的方法，其特征在于：包括变性、复性和延伸。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于：
聚合酶链式反应方法的反应体系：
2倍浓度的Taq PreMix试剂10μl；DNA模板0.5-1μl；浓度为10μm/L的正向引物和浓度为10μm/L的反向引物各0.5-1μl；加灭菌水到总体积20μl。
5.如权利要求3所述方法，其特征在于：
聚合酶链式反应的反应程序：
①1个循环：温度为94℃时间为2-5min；
②30个循环：依次为变性温度94℃，时间20-30s；复性温度50-55℃，时间30s-1min；延伸温度72℃，时间2min；
③1个循环：温度72℃，时间5-10min。
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