CN101245389A

CN101245389A - 一种微量dna的多重pcr检测方法

Info

Publication number: CN101245389A
Application number: CNA200810035152XA
Authority: CN
Inventors: 王剑晖; 于明辉; 李凯; 陆炯; 肖君华
Original assignee: SHANGHAI YIHE APPLICATION BIO-TECH Co Ltd; Donghua University
Current assignee: SHANGHAI YIHE APPLICATION BIO-TECH Co Ltd; Donghua University
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明涉及一种微量DNA的多重PCR检测方法，通过改变引物浓度和引物添加方式来避免多重PCR技术中引物过多造成的竞争抑制问题，可用于起始样本非常有限的DNA，尤其是一些很珍贵的临床样本，如受精卵，激光捕获显微切割获得的细胞等。本发明整个检测方案操作过程简单，特异性高，并且灵敏度与PCR效率都很高，易于自动化，在实际应用中有广泛的应用前景。

Description

一种微量DNA的多重PCR检测方法

技术领域

本发明属核酸检测领域，特别是涉及一种通过改变引物浓度和引物添加方式的多重PCR技术实现对微量DNA的超灵敏检测。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是现今生物检测中最常用的扩增技术，它能将某一DNA片段在几个小时内扩增几十万至百万倍。并且随着荧光定量PCR的普及和应用，目标序列的定量也能准确的完成。但是一般PCR仅应用一对引物，通量低，而且对起始模板浓度有要求，灵敏度低。但对于很多研究来说，起始样本的DNA非常有限，尤其是一些很珍贵的临床样本，比如受精卵，激光捕获显微切割获得的细胞等。因此，建立一种通量高、灵敏度高的方法用于分析少量细胞DNA显得十分迫切和必要。

多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性的引物，针对多个DNA模板或者同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。这一概念由Charnberian等【Nucleic Acids Res.1988，16：11141-11156】率先于1988年提出。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样本，所以一经提出，即得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域，多重PCR已经成为一项成熟而重要的研究手段。

由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因而技术难度增大。一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复实验，建立适宜的反应体系和反应条件。大量的实验表明，多重PCR的主要技术问题在于引物的设计，组合和浓度优化。目前的研究在对多重PCR的引物优化主要从两个方面进行：一方面是对引物的设计进行序列间的比对，减少引物之间的互补和配对几率；另一方面是在实验中对各位点引物的浓度条件进行摸索，调整各组引物的相对浓度，以达到各位点平衡而高效的扩增。这样的优化对于正常的多重PCR反应效果很好，但是对于微量DNA的多重PCR效果不明显，因为在正常的多重PCR反应中，由于模板分子数比较多，引物和模板之间的相互作用比较容易进行；但是，当模板的浓度过低，比如低于100个分子时，由于分子之间的相互作用减少，引物和模板之间就很难发生退火反应，而另一方面，由于引物很多，浓度很高，分子数大大过量，引物自身进行反应形成二聚体的几率就大大增加，其结果就导致体系中各组分在形成二聚体的过程中大量消耗，而无法完成目的产物的扩增。

1989年发展出了一种Booster PCR的方法【Nucleic Acids Res，1989，17：5407】，可以解决低模板量下的PCR扩增问题。其原理是在低模板分子数的情况下，同时降低引物的浓度，使得引物和模板之间的作用，与引物和引物之间的作用的相对比例增加，使反应向目的片段的扩增方向进行。具体操作为：开始几个循环中保持引物的低浓度，以确保开始扩增的准确性。在目的片段的数量有了一定的增加以后，然后在后面的循环中，将引物的浓度提高，保证扩增的效率。整个操作简单易行，可以有效地对微量模板DNA进行检测，但是此方法仅限于单一位点分析，无法进行多位点分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种微量DNA的多重PCR检测方法，是一种超灵敏的多重PCR方法来检测微量DNA，该方法通过改变多重PCR反应中引物浓度和引物添加方式来解决低模板量下的PCR扩增问题。整个方法操作过程简单，不需要专业人员，特异性高，并且灵敏度与PCR效率都很高，在实际应用中有广泛的应用前景。

本发明的一种微量DNA的多重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)待检样本DNA的抽提；

(2)以上面抽提得到的DNA为模板，选取引物1进行PCR反应；

(3)反应进行至15个循环的时候，将含有另外引物2的工作液补加到反应体系中，继续进行未完成的反应；

(4)将PCR反应产物进行巢式PCR，分析结果。

所述DNA的抽提可以采用常规酚-氯仿抽提法，或用试剂盒抽提。

所述的步骤(2)中选取的引物1至少为一对。

所述的步骤(3)中补加的引物2至少为一对。

所述的步骤(2)与(3)所加的引物区别在于扩增的目的片段不同，步骤(3)所加的引物是用于对步骤(2)没有扩增的基因进行扩增。

本发明为了避免引物过多造成的竞争抑制问题，采用低引物浓度和引物“补加”方式来进行多重PCR反应。

本发明的有益效果：

(1)本发明在对微量DNA进行检测时，避免了多重PCR过程中引物过多造成的竞争抑制问题，可用于起始样本非常有限的DNA，尤其是一些很珍贵的临床样本，如受精卵，激光捕获显微切割获得的细胞等；

(2)特异性、灵敏度、PCR效率高；

(3)成本低；

(4)整个方法操作过程简单，不需要专业人员，易于自动化，在实际使用中有广泛的应用前景。

附图说明

图1是用降低引物浓度和引物“补加”方式来进行多重PCR反应的示意图，按照图示所标记，(A)为选取一些引物进行PCR反应；(B)为反应进行至15个循环的时候，将含有另外引物的工作液补加到反应体系中；(C)为反应继续进行，直到完成未完成的反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

GnRH神经元甲基化的研究：

(1)用低熔点琼脂糖包埋小鼠GnRH神经元细胞500个，抽提DNA；

(2)亚硫酸盐处理抽提的DNA，在这一步大约会有90％的DNA降解掉，因此实际上所留下的DNA相当少；

(3)通过NCBI的GeneBank获取GnRH神经元中可能甲基化的10个候选基因DNA序列，利用软件设计引物，并合成相关序列，见表1；并将这些引物各稀释为10p/mol。

表1引物序列

引物名称	序列(5’→3’)
引物名称	序列(5’→3’)	GnRHL-F	TTTGTTTTGTTTTGTTTTTGA
GnRHL-R	AACTTCAAAACTAAAAAAAAACTA	GnRHL-F	TTTGTTTTGTTTTGTTTTTGA
GnRHL-R	AACTTCAAAACTAAAAAAAAACTA	P2ry2L-F	TTGGTATTAGTAGTTTGAAAG
P2ry2L-R	ACCCTTCTAAACAAATACTTC	P2ry2L-F	TTGGTATTAGTAGTTTGAAAG
P2ry2L-R	ACCCTTCTAAACAAATACTTC	NmbrL-F	AAGTTTTAAAGATAGAAAAAAGGT
NmbrL-R	ATTAAAAAAAAACCTAAAAAACAT	NmbrL-F	AAGTTTTAAAGATAGAAAAAAGGT

GPR54L-F	GTTGTTGGGTTAGAAGTTTTGTTT
GPR54L-F	GTTGTTGGGTTAGAAGTTTTGTTT	GPR54L-R	TCTCACAAACAATAATCTAAAAAT
AprtL-F	GTTGATATTTATTTTTTTTTTGTTT	GPR54L-R	TCTCACAAACAATAATCTAAAAAT
AprtL-F	GTTGATATTTATTTTTTTTTTGTTT	AprtL-R	TAAACTTCAAATAACTAACCAAAA
ERbL-F	AGTTTAGAATTTTTGGGGATTTG	AprtL-R	TAAACTTCAAATAACTAACCAAAA
ERbL-F	AGTTTAGAATTTTTGGGGATTTG	ERbL-R	ACCTCCTCTACTCCCAAAAAAT
Gabrr1L-F	TTTTTTTTTTATTTAGTTGATTTGA	ERbL-R	ACCTCCTCTACTCCCAAAAAAT
Gabrr1L-F	TTTTTTTTTTATTTAGTTGATTTGA	Gabrr1L-R	TTCATATTCTAAACAACCAACAT
Vipr1L-F	GGAGGGAGAGTAGTTTTAGATTATT	Gabrr1L-R	TTCATATTCTAAACAACCAACAT
Vipr1L-F	GGAGGGAGAGTAGTTTTAGATTATT	Vipr1L-R	TTTCCAAAACTAAAAACTAACCTCC
Drd2L-F	ATGGTTTGAAGGTAAGAATTGG	Vipr1L-R	TTTCCAAAACTAAAAACTAACCTCC
Drd2L-F	ATGGTTTGAAGGTAAGAATTGG	Drd2L-R	TACCCTACCCTCTAAAACCACA
Fgfr1L-F	GGTTGTAGTTTGAGAATTATAAGG	Drd2L-R	TACCCTACCCTCTAAAACCACA
Fgfr1L-F	GGTTGTAGTTTGAGAATTATAAGG	Fgfr1L-R	CCCCTAAAACCTAAAAAAAAT

(4)取亚硫酸盐处理后的低熔点琼脂糖包埋的DNA、引物GnRHL-F、GnRHL-R、P2ry2L-F、P2ry2L-R、NmbrL-F、NmbrL-R、GPR54L-F、GPR54L-R、AprtL-F、AprtL-R、高温聚合酶0.5U、高温聚合酶缓冲液混合反应，反应条件为：95℃，15分钟(94℃，30秒；45℃，90秒；66℃，90秒)45循环；66℃，10分钟；在第十五个循环的时候，将含有剩下5对引物、高温聚合酶、高温聚合酶缓冲液的工作液补加到反应中。

(5)把PCR反应产物稀释1000倍，以此为模板用引物分别进行巢式PCR，并将巢式PCR的结果进行测序检测，分析各序列的甲基化状态。

实施例2

口腔粘膜脱落细胞GPR54基因全基因组测序：

(1)采集20名性早熟患者口腔棉拭子，并用试剂盒抽提DNA。

(2)通过NCBI的GeneBank获取GPR54基因的全基因组序列，对序列分析可知，只要进行4个片段的扩增，即可完全覆盖GPR54基因的全基因组序列。利用软件设计引物，并合成相关序列，见表2，并将这些引物各稀释为10p/mol。

表2引物序列

引物名称	序列(5’→3’)
引物名称	序列(5’→3’)	L-IF	GCG ACA GAG CGA GAT GCT GT
L-IR	TGG TGG ATT AGA GGC GTC AG	L-IF	GCG ACA GAG CGA GAT GCT GT

L-IIF	TGG TGA AAC CTG GTC TCT AC
L-IIF	TGG TGA AAC CTG GTC TCT AC	L-IIR	GCA TCA GCG CCG CGA AGA AG
L-IIIF	AGC ACA GCT GCC CTC TGG AC	L-IIR	GCA TCA GCG CCG CGA AGA AG
L-IIIF	AGC ACA GCT GCC CTC TGG AC	L-IIIR	CTG AGT GCA TCT CCC TCC GT
L-IVF	CTC AAC CCG CAC TGG ACA CT	L-IIIR	CTG AGT GCA TCT CCC TCC GT
L-IVF	CTC AAC CCG CAC TGG ACA CT	L-IVR	CAC TTG AAC CCG GGA GGC AG

(3)取口腔棉拭子抽提的DNA、引物L-IF、L-IR、L-IIF、L-IIR、L-IIIF、L-IIIR、高温聚合酶0.5U、高温聚合酶缓冲液混合反应，反应条件为：95℃，15分钟(94℃，40秒；59℃，90秒；72℃，90秒)45循环，72℃，10分钟，在第十五个循环的时候，将含有引物L-IVF、L-IVR、高温聚合酶、高温聚合酶缓冲液的工作液补加到反应中。

(4)把PCR反应产物稀释1000倍，以此为模板用引物分别进行巢式PCR，并将巢式PCR的结果进行测序，最后把序列拼接起来，即为全基因组序列，可以进行后续相关研究。

Claims

1.一种微量DNA的多重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)待检样本DNA的抽提；

(2)以上面抽提得到的DNA为模板，选取引物1进行PCR反应；

(4)将PCR反应产物进行巢式PCR，分析结果。

2.根据权利要求1所述的微量DNA的多重PCR检测方法，其特征在于：所述DNA的抽提采用常规酚-氯仿抽提法，或用试剂盒抽提。

3.根据权利要求1所述的微量DNA的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中选取的引物1至少为一对。

4.根据权利要求1所述的微量DNA的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)中补加的引物2至少为一对。

5.根据权利要求1、3或4所述的微量DNA的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)与(3)所加的引物区别在于扩增的目的片段不同，步骤(3)所加的引物是用于对步骤(2)没有扩增的基因进行扩增。