CN103290118B - 一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两个PCR反应试剂，其为：PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅱ，所述PCR反应试剂包括引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱。本发明能一次试验同时检测非缺失型α-地中海贫血的QS和CS两种突变型。操作简单、检测时间短、荧光PCR结束后即可进行结果判读，克服了现有技术需要对PCR产物进行杂交、测序、溶解曲线分析操作繁杂的问题，并且具有灵敏度高，特异性强的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
地中海贫血又称海洋性贫血，是遗传性溶血性贫血。其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常。地中海贫血按照受累的氨基酸链来分类，通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以β和α地中海贫血较为常见。
在国外，地中海贫血以地中海沿岸国家(故名为地中海贫血)及东南亚各国多见。我国长江以南的广大地域为地中海贫血高发区，其中尤以广西、广东和海南三省（区）为甚，其他如香港、台湾、福建、江西、云南、贵州、四川等省（区）也是发病较为严重的低区。广西α和β地中海贫血人群携带率高达24%，居全国之首，广东为11%居全国第二位。
α-地中海贫血是α-珠蛋白基因突变导致α-珠蛋白链合成缺陷所引起的一种遗传性溶血性贫血，简称α-地贫。血红蛋白四聚体的α-链合成量不足或失效，从而引起α链/非α链失衡，是导致溶血发生的直接原因。α-珠蛋白基因缺失或点突变均可导致α-地贫，分别称为缺失型或非缺失型α-地贫。
自1977年报道首例非缺失型α地中海贫血以来，目前至少发现了68种与非缺失型α地中海贫血有关的突变，其中17种位于α1基因，46种位于α2基因，其余5种位于α1、α2基因以外的地方。在中国，目前已报道了至少6种非缺失型α地中海贫血基因突变，其突变类型见表1，这些突变均位于α2-珠蛋白基因上，其中αCSα/，αQSα/，αWSα/是最常见的3种突变。
表1
目前普遍应用的基因突变检测方法为限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）和DNA测序法，也有一些其他方法用于基因突变研究方法，这些方法的优点和不足点见表2。
表2
现有的非缺失型α地中海贫血基因检测相关的专利数目不在少数，其主要是利用基因芯片法或是PCR反向结合点杂交法。这两种方法的涉及的操作步骤多，无法在PCR后直接判读结果，都要对PCR产物进行后续的分析，开管操作容易发生污染，检测过程耗时较长。
而使用TaqMan探针荧光PCR法时，设计相对较难，尤其是TaqMan探针的设计，既要保证特异性又要满足有效和高效地扩增，同时需要解决单管多通道检测时通道间的信号干扰问题，以及之前荧光PCR仪器用户不多的问题等，都影响了TaqMan荧光PCR法的应用。
为了提高检测效率和准确性，开发一种用于非缺失型α地中海贫血的检测系统很有必要，此系统需具有操作简便、检测速度快、准确性高的特点。
发明内容
本发明提供一种用TaqMan探针荧光PCR法检测非缺失型α-地中海贫血的快速检测试剂盒，利用本试剂盒可以同时检测两种非缺失型α-地中海贫血，该试剂盒可高通量操作，操作简单快捷，结果判读直观。
本发明的技术方案为提供一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两个PCR反应试剂，其为：PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅱ，所述PCR反应试剂包括引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱；
所述PCR反应液Ⅰ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因QS突变型和野生型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R为序列SEQ ID No.6；QS野生型探针QSN：SEQ ID No.1，QS突变型探针QSM：SEQ ID No.2；
所述PCR反应液Ⅱ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因CS突变型和野生型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R：SEQ ID No.6；CS野生型探针CSN：SEQ ID No.3，CS突变型探针CSM：SEQID No.4。
优选的，上述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒中，所述探针QSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针QSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB；所述探针CSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针CSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB。
优选的，上述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒中，所述的PCR反应试剂Ⅰ各组分含量为：
10x PCR Buffer：4μL；
25mM Mgcl2：8μL；
25mM dNTPs：0.32μL；
5M甜菜碱：10μL；
100μM引物F：0.16μL；
100μM引物R：0.16μL；
50μM探针QSN：0.16μL；
50μM探针QSM：0.16μL；
5U/μL Taq DNA聚合酶：0.6μL；
1U/μL UNG酶：0.1μL；
PCR级水：14.34μL；
所述的PCR反应试剂Ⅱ各组分含量为：
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25mM Mgcl2：8μL；
25mM dNTPs：0.32μL；
5M甜菜碱：10μL；
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50μM探针QSN：0.16μL；
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5U/μL Taq DNA聚合酶：0.6μL；
1U/μL UNG酶：0.1μL；
PCR级水：14.34μL。
优选的，上述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒中，所述dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液；所述PCR Buffer的pH值为8.0-9.0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl、氯化钾、硫酸铵。
本发明能一次试验同时检测非缺失型α-地中海贫血的QS和CS两种突变型。操作简单、检测时间短、荧光PCR结束后即可进行结果判读，克服了现有技术需要对PCR产物进行杂交、测序、溶解曲线分析操作繁杂的问题，并且具有灵敏度高，特异性强的特点。
由于α-globin基因序列的高同源性，引物、探针设计时充分考虑引物、探针的长度、GC含量与退火温度，本发明通过对设计的引物、探针进行试验，并在试验的基础上调整重新设计引物、探针，并且优化了荧光定量PCR实验的反应液，特别是在反应液中加入了PCR增强剂，如甜菜碱增强长片段PCR的扩增效率，解决了长片段PCR扩增效率偏低等问题，如此反复最终获得适合本发明的扩增特异性强及扩增效率高的引物，本发明的PCR全过程闭管检测，无需对PCR产物进行后续处理，同时加入了UNG-dUTP防产物污染系统，大大降低了交叉污染发生几率；检测通量高，为α-地中海贫血的临床诊断或遗传分析提供依据。
附图说明
图1为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS杂合子即野生型与突变型的荧光PCR扩增曲线图；
图2为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS野生型纯合子的荧光PCR扩增曲线图；
图3为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS突变型纯合子的荧光PCR扩增曲线图；
图4为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS杂合子即野生型与突变型的荧光PCR扩增曲线图；
图5为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS野生型纯合子的荧光PCR扩增曲线图；
图6为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS突变型纯合子的荧光PCR扩增曲线图；
图7A为QS杂合子、图7B为QS野生型纯合子、图7C为QS突变型纯合子、图7D为CS杂合子、图7E为CS野生型纯合子、图7F为CS突变型纯合子的DNA测序结果。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明提供一种用TaqMan探针荧光PCR法检测非缺失型α-地中海贫血的快速检测试剂盒，该方法高通量、操作简单快捷、闭管操作、结果判读直观，利用本试剂盒可以同时检测两种非缺失型α-地中海贫血，分别是QS和CS型非缺失型α-地中海贫血。
本发明提供一种基于TaqMan探针荧光PCR法对单核苷酸多态性进行检测的方法，包含以下步骤：
1、根据α珠蛋白基因中发生QS和CS突变的区域α2基因，针对待检的QS和CS位点的两个靶向区域设计TaqMan MGB探针；包括检测QS野生型的探针QSN具有SEQ ID No.1序列，检测QS突变型的探针QSM具有SEQ ID No.2序列，检测CS野生型的探针CSN具有SEQ ID No.3序列，检测CS突变型的探针CSM具有SEQ ID No.4序列，设计的探针能特异性区别QS和CS位点的野生型和突变型。探针可由专业合成公司合成，如Invitrogen等。
PCR反应液Ⅰ包括检测QS的野生型和突变型的两条TaqMan探针。
SEQ ID No.1：5’-CAAGCCTCCCTGGACA-3’；
5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB。
SEQ ID No.2：5’-CAAGCCTCCCCGGAC-3’；
5’端荧光报告基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为MGB。
上述SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的第三个碱基位点可为脱氧次黄嘌呤I，提高了扩增效果，经济实用。
PCR反应液Ⅱ包括检测CS的野生型和突变型的两条TaqMan探针。
SEQ ID No.3：5’-CCAAATACCGTTAAGCTG-3’；
5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB。
SEQ ID No.4：5’-CCAAATACCGTCAAGCT-3’；
5’端荧光报告基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为MGB。
2、根据α珠蛋白基因中发生QS和CS突变的区域α2基因，针对待检的QS和CS位点的两个靶向区域设计引物；包括上游引物F，具有SEQ ID No.5序列，包括下游引物R，具有SEQ ID No.6序列，设计的引物对能够特异性扩增包含QS和CS位点的区域。引物可由专业合成公司合成，如Invitrogen等。
SEQ ID No.5：5’-GACCCTGGCCGCCCACCTC-3’；
SEQ ID No.6：5’-AGGAGGAACGGCTACCGAG-3’；
3、对外周血、羊水、脐血、绒毛等样本进行处理，提取基因组DNA。
4、采用合适的PCR反应体系包含步骤1、2的引物和探针，对步骤3提取的基因组DNA进行扩增和检测。
5、在包含所述的引物和探针的PCR反应液Ⅰ和PCR反应液Ⅱ中，所涉及的组分PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、Mgcl2溶液购自Promega公司，dNTPs、UNG酶购自Fermentas公司，甜菜碱购自Sigma公司。所述dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液；所述PCR Buffer的pH值为8.0-9.0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl，氯化钾、硫酸铵。
PCR试剂包括PCR试剂Ⅰ和PCR试剂Ⅱ，其中PCR试剂Ⅰ由一对引物F和R、两条TaqMan MGB探针QSN和QSM、PCR buffer、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs、UNG酶、甜菜碱及模板DNA组成。
PCR试剂Ⅱ由一对引物F和R、两条TaqMan MGB探针CSN和CSM、PCR buffer、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs、UNG酶、甜菜碱及模板DNA组成。
根据本发明的实施方案，PCR试剂Ⅰ和PCR试剂Ⅱ中各组分的终浓度如表3所示。
表3
优选地，所述模板DNA来自外周血全血、羊水细胞、绒毛、脐血样本中提取。
所述dNTPs为dATP、dUTP、dCTP、dGTP等摩尔浓度的混合液。
优选的上述TaqMan探针法检测非缺失型α-地中海贫血基因的方法，其特征在于，荧光PCR扩增程序为：40-60℃UNG酶反应3-10分钟；93-98℃预变性3-15分钟；93-98℃变性10-25秒、58-63℃退火、延伸及采集荧光信号40-60秒，40-50个循环。
优选地，所述荧光PCR扩增程序，具体如表4所示。
表4
实施例1
1、样本基因组DNA的制备
本试剂盒对人基因组DNA的提取方法没有指定要求，可用实验室常规方法（酚氯仿抽提法）或试剂盒提取人基因组DNA，推荐使用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，并按试剂盒说明书进行操作。血液样本需用EDTA或枸橼酸钠抗凝。
2、PCR反应液Ⅰ和Ⅱ的配制
1）PCR反应液Ⅰ配制如表5所示。
表5
2）PCR反应液Ⅱ配制如表6所示。
表6
将配制好的PCR反应液Ⅰ和Ⅱ混匀后，瞬时离心5秒，分装到PCR管中。
3、向装有PCR反应液Ⅰ和Ⅱ的PCR反应管中，加入2μL提取的基因组DNA模板，2000g离心5秒后，放入荧光PCR仪器中进行扩增。
4、荧光PCR扩增程序如表7所示，荧光通道选择FAM和VIC通道。
表7
5、本发明试剂盒经检测最低检测限度达到1.5ng/μL基因组DNA。对缺失型α地中海贫血携带者基因组DNA、β地中海贫血携带者基因组DNA、缺铁性贫血患者基因组DNA、G6PD基因携带者基因组DNA、正常人基因组DNA等的检测均为阴性结果，具有良好的特异性。
图1为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS杂合子即野生型与突变型的荧光PCR扩增曲线图。
图2为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS野生型纯合子的荧光PCR扩增曲线图。
图3为本发明实施例使用PCR反应液Ⅰ对QS突变型纯合子的荧光PCR扩增曲线图。
图4为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS杂合子即野生型与突变型的荧光PCR扩增曲线图。
图5为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS野生型纯合子的荧光PCR扩增曲线图。
图6为本发明实施例使用PCR反应液Ⅱ对CS突变型纯合子的荧光PCR扩增曲线图。
本发明的上述的TaqMan探针法检测结果与DNA测序结果一致。
图7A为QS杂合子、图7B为QS野生型纯合子、图7C为QS突变型纯合子、图7D为CS杂合子、图7E为CS野生型纯合子、图7F为CS突变型纯合子的DNA测序结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCELISTING
<110> 深圳益生堂生物企业有限公司 创益生物科技有限公司
<120> 一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caagcctccc tggaca 16
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caagcctccc cggac 15
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaaataccg ttaagctg 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaaataccg tcaagct 17
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaccctggcc gcccacctc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggaggaacg gctaccgag 19
Claims (3)
1.一种非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两个PCR反应试剂，其为：PCR反应试剂Ⅰ和PCR反应试剂Ⅱ，所述PCR反应试剂包括引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、UNG酶、甜菜碱；
所述PCR反应试剂Ⅰ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因QS突变型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R为序列SEQ ID No.6；QS野生型探针QSN：SEQ ID No.1，QS突变型探针QSM：SEQID No.2；
所述PCR反应试剂Ⅱ包括扩增非缺失型α地中海贫血基因CS突变型的两个位点的一对引物和两条探针，其为：上游引物F：SEQ ID No.5，下游引物R：SEQ ID No.6；CS野生型探针CSN：SEQ ID No.3，CS突变型探针CSM：SEQ ID No.4；
所述探针QSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针QSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB；
所述探针CSN的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述探针CSM的5’端标记VIC，3’端标记MGB。
2.根据权利要求1所述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂Ⅰ各组分含量为：
10x PCR Buffer：4μL；
25mM Mgcl2：8μL；
25mM dNTPs：0.32μL；
5M甜菜碱：10μL；
100μM引物F：0.16μL；
100μM引物R：0.16μL；
50μM探针QSN：0.16μL；
50μM探针QSM：0.16μL；
5U/μL Taq DNA聚合酶：0.6μL；
1U/μL UNG酶：0.1μL；
PCR级水：14.34μL；
所述的PCR反应试剂Ⅱ各组分含量为：
10x PCR Buffer：4μL；
25mM Mgcl2：8μL；
25mM dNTPs：0.32μL；
5M甜菜碱：10μL；
100μM引物F：0.16μL；
100μM引物R：0.16μL；
50μM探针QSN：0.16μL；
50μM探针QSM：0.16μL；
5U/μL Taq DNA聚合酶：0.6μL；
1U/μL UNG酶：0.1μL；
PCR级水：14.34μL。
3.根据权利要求1所述的非缺失型α地中海贫血实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液；所述PCRBuffer的pH值为8.0-9.0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl、氯化钾、硫酸铵。
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| 陈文强等.应用Taqman-MGB探针法检测地中海贫血Hb Westmead突变.《重庆医学》.2012,第41卷(第32期),第3408页右1-2段. |
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