CN102409100A

CN102409100A - 地中海贫血实时荧光定量pcr检测引物和试剂盒

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Publication number: CN102409100A
Application number: CN2011103881159A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 杨立业; 郑佳坤; 吴教仁
Original assignee: CENTRAL HOSPITAL CHAOZHOU
Current assignee: CENTRAL HOSPITAL CHAOZHOU
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN102409100B

Abstract

本发明公开了一种地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测试剂盒和相关引物，该试剂盒包括有以下引物中的一对以上：针对TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ IDNO.2；针对CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；针对CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS1-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS1-5M)基因型的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；针对CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；针对IVS2-654C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；针对基因型为constant spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ IDNO.14。所述试剂盒的优点是检测特异性好，检测灵敏度高。

Description

地中海贫血实时荧光定量PCR检测引物和试剂盒

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体是涉及地中海贫血实时荧光定量PCR检测引物和试剂盒。

背景技术

地中海贫血是一组遗传性溶血性贫血，其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组成成分改变。这种疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血。

地中海贫血以地中海沿岸国家和东南亚各国多见，我国长江以南各省均有报道，以广西、广东、海南、四川、重庆等省区发病率较高，在北方较为少见。若夫妻为同型地中海贫血的基因携带者，每次怀孕，其子女有1/4的机会为正常，1/2的机会为携带者，另1/4的机会为重型地中海贫血患者。因此，在遗传咨询及产前诊断方面，这是非常重要的疾病。通常将地中海贫血分为α、β、δ和δβ等4种类型，其中以α和β地中海贫血较为常见。

1.β地中海贫血

人类β珠蛋白基因簇位于11p15.5。β地中海贫血(简称β地贫)的发生主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。基因缺失和有些点突变可致β链的生成完全受抑制，称为β0地贫；有些点突变使β链的生成部分受抑制，则称为β+地贫。

β地贫基因突变较多，迄今已发现的突变点达100多种，国内已发现30多种。其中常见的突变有8种，包括CD41-42-TCCT(41-42M)、IVS-II-654C→T(654M)、CD17A→T(17M)、-28A→G(-28M)、CD26G→A(βEM)、CD71-72+A(71-72M)、CD43G→T(43M)、-29A→G(-29M)的检测，以及少见的9个位点突变CD14-15+G(14-15M)、CD27-28+C(27-28M)、-32C→A(-32M)、-30T→C(-30M)、IVS-I-1G→T(IVS-I-1M)、IVS-I-5G→C(IVS-I-5M)、CD31-C(31M)、CAP-40-43-AACC(CAPM)和起始密码子突变ATG→AGG(IntM)。

重型β地贫是β0或β+地贫的纯合子或β0与β+地贫双重杂合子，因β链生成完全或几乎完全受到抑制，以致含有β链的HbA合成减少或消失，而多余的α链则与γ链结合而成为HbF(a₂γ₂)，使HbF明显增加。由于HbF的氧亲合力高，致患者组织缺氧。过剩的α链沉积于幼红细胞和红细胞中，形成α链包涵体附着于红细胞膜上而使其变僵硬，在骨髓内大多被破坏而导致“无效造血”。部分含有包涵体的红细胞虽能成熟并被释放至外周血，但当它们通过微循环时就容易被破坏；这种包涵体还影响红细胞膜的通透性，从而导致红细胞的寿命缩短。由于以上原因，患儿在临床上呈慢性溶血性贫血。贫血和缺氧刺激红细胞生成素的分泌量增加，促使骨髓增加造血，因而引起骨骼的改变。贫血使肠道对铁的吸收增加，加上在治疗过程中的反复输血，使铁在组织中大量贮存，导致含铁血黄素沉着症。

轻型地贫是β0或β+地贫的杂合子状态，β链的合成仅轻度减少，故其病理生理改变极轻微。中间型β地贫是一些β+地贫的双重杂合子和某些地贫的变异型的纯合子，或两种不同变异型珠蛋白生成障碍性贫血的双重杂合子状态，其病理生理改变介于重型和轻型之间。

临床表现

根据病情轻重的不同，β地中海贫血分为以下3型：(1)重型，又称Coo1ey贫血。患儿出生时无症状，至3-12个月开始发病，呈慢性进行性贫血，面色苍白，肝脾大，发育不良，常有轻度黄疸，症状随年龄增长而日益明显。本病需持续输血或者骨髓移植，如不治疗，多在5岁前死亡；(2)轻型。患者无症状或轻度贫血，也可不贫血，脾不大或轻度大，病程经过良好，能正常存活；(3)中间型。多于幼童期出现症状，其临床表现介于轻型和重型之间，中度贫血，脾脏轻或中度大，黄疸可有可无，骨骼改变较轻。其中，轻型β地中海贫血为地中海贫血基因突变杂合子，可无临床症状或症状较轻，容易漏诊。因此可以主要针对轻型β地中海贫血做筛查，对预防重型β地贫的产生有一定的意义。根据临床特点和实验室检查，轻型地中海贫血的临床表现和红细胞的形态改变与缺铁性贫血有相似之处，故易被误诊。

2.α地中海贫血

人类α珠蛋白基因簇位于16Pter-p13.3。每条染色体各有2个α珠蛋白基因，一对染色体共有4个α珠蛋白基因。大多数α地中海贫血(简称α地贫)是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。若仅是一条染色体上的一个α基因缺失或缺陷，则α链的合成部分受抑制，称为α+地贫；若每一条染色体上的2个α基因均缺失或缺陷，称为α0地贫。中国南方地区常见的缺失型有东南亚缺失(--^SEA)、右侧缺失(-α^3.7)、左侧缺失(-α^4.2)，常见的三种突变类型为Hb WS(Westmead)、Hb QS(Quong Sze)和Hb CS(constant spring)。

重型α地贫是α0地贫的纯合子状态，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HbA、HbA2和HbF的合成均减少。患者在胎儿期即产生大量γ链合成γ4(Hb Bart′s)。Hb Bart′s对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征。中间型α地贫是α0和α+地贫的杂合子状态，是由3个α珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α链，其多余的β链即合成HbH(β4)，这种情况临床称为血红蛋白H病。HbH对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短。因血红蛋白H(HbH)病贫血较轻，还伴有肝脾肿大、黄疸，少数病例还可有肝功能损害，故易被误诊为黄疸型肝炎或肝硬化。

轻型α地贫是α+地贫纯合子或α0地贫杂合子状态，它仅有2个α珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α链合成，病理生理改变轻微。

静止型α地贫是α+地贫杂合子状态，它仅有一个α基因缺失或缺陷，α链的合成略为减少，病理生理改变非常轻微。

临床表现：

1.静止型患者无症状。红细胞形态正常，出生时脐带血中Hb Bart′s含量为1％～2％，但3个月后即消失。

2.轻型患者无症状。红细胞形态有轻度改变，如大小不等、中央浅染、异形等；红细胞渗透脆性降低；HbA2和HbF含量正常或稍低。患儿脐血HbBart′s含量为3.4％～14％，于生后6个月时完全消失。

3.中间型又称血红蛋白H病。此型临床表现差异较大，出现贫血的时间和贫血轻重不一。大多在婴儿期以后逐渐出现贫血、疲乏无力、肝脾大、轻度黄疽；年龄较大患者可出现类似重型β地贫的特殊面容。合并呼吸道感染或服用氧化性药物、抗疟药物等可诱发急性溶血而加重贫血，甚至发生溶血危象。也有部分患者临床表现只有轻度到中度的贫血，伴有脾大，不用输血治疗。

实验室检查：外周血象和骨髓象的改变类似重型β地贫；红细胞渗透脆性减低；变性珠蛋白小体阳性；HbA2及HbF含量正常。出生时血液中含有约25％Hb Bart′s及少量HbH；随年龄增长，HbH逐渐取代Hb Bart′s，其含量约为2.4％～44％。包涵体生成试验阳性。

4.重型又称Hb Bart′s胎儿水肿综合征。胎儿常于30～40周时流产、死胎或娩出后半小时内死亡，胎儿呈重度贫血、黄疽、水肿、肝脾肿大、腹水、胸水。胎盘巨大且质脆。

实验室检查：外周血成熟红细胞形态改变如重型β地贫，有核红细胞和网织红细胞明显增高。血红蛋白中几乎全是Hb Bart′s或同时有少量HbH，无HbA、HbA2和HbF。

目前对于重型β地贫的治疗主要是进行输血维持，但本法容易导致含铁血黄素沉着症，故应同时给予铁鳌合剂治疗；另一种方法是造血干细胞移植治疗，异基因造血干细胞移植是目前根治重型β地贫的方法。如有HLA相配的造血干细胞供者，应作为治疗重型β地贫的首选方法。

无论是哪一种方法，都对患者家庭造成巨大的经济损失和心理负担。实际上大部分家庭负担不起高昂的医药费而导致患儿夭折。预防和减少地贫患儿的出生，是解决问题的根本办法。

基因诊断

一般来说，如果两名属同一类型(α或β)的地中海贫血患者结合，便有机会生下重型贫血患者。在华南最常见的便是同属极轻型(静止型)和轻型α或β地贫父母生下的α或β重型地贫患者。

要想知道个体是否有极轻型或轻型地中海贫血，需抽血进行血常规分析和基因检测，在轻型的地中海贫血(基因携带者)，血常规常表现为小红细胞增多症，即红细胞数比正常人增多，而红细胞的平均体积(MCV)变小，一般小于82fL。对于有生育要求的夫妇，如果血常规检查发现小红细胞增多症，就应该进行基因诊断。若证实本身和配偶同属β型极轻型或轻型地贫患者，儿女将有四分之一的机会完全正常、二分之一的机会成为轻型贫血患者和四分之一的机会成为中型或重型贫血患者。由于α型地中海贫血的遗传基因病变较为复杂，同属α型轻型贫血者的配偶需要作详细的遗传基因分析，才能预测下一代成为中型或重型地中海贫血患者的机会。

地中海贫血是由于球蛋白基因的突变或缺失导致的，在东南亚，包括中国，常见的α地贫是由于α球蛋白基因的缺失所致，常见的基因缺失种类包括-SEA、-4.2和-3.7，在少数情况是由于α球蛋白基因突变引起，华南地区常见的点突变类型包括CS(constant spring)、QS(Quong Sze)和WS(Westmead)。常见的β地贫是由于β球蛋白基因的突变所致，中国南方人群有8个常见位点突变的β地中海贫血，包括CD41-42(-TCTT)(41-42M)、IVS-II-654(C→T)(654M)、CD17(A→T)(17M)、TATA盒nt-28(A→G)(28M)、CD26(G→A)(βEM)、CD71-72(+A)(71-72M)、CD43(G→T)(43M)、-29(A→G)(29M)，以及少见的9个位点突变，包括CD14-15(+G)(14-15M)、CD27-28(+C)(27-28M)、-32(C→A)(32M)、-30(T→C)(30M)、IVS-I-1(G→T)(IVS-I-1M)、IVS-I-5(G→C)(IVS-1-5M)、CD31(-C)(31M)、CAP-40-43(-AACC)(CAPM)和起始密码子突变ATG→AGG(IntM)。

基因诊断的方法

一、缺失型α-地中海贫血的基因诊断

对于缺失型的α-地中海贫血的诊断，目前的基因诊断方法有：

1.Southern印迹杂交诊断，Southern杂交是早期使用的方法，由于它耗时、过程繁锁、不经济，不可能作为常规方法使用。

2.以PCR为基础的诊断方法。

2.1缺口PCR(gap-PCR)，此法是最常用的对缺失型突变的检测法，其原理之一为，在缺失区域内设计一对引物，由于4个α基因完全缺失(Barts’水肿胎)，引物没有可互补的模板，故不能扩增出相应的PCR产物，但此法不能识别杂合子携带者。现在常用的另一方法是缺口连接PCR，其原理是，设计的引物和缺失序列的两侧翼序列互补，由于缺失两端相接，使本来在正常DNA序列中相距很远的这一对引物之间的距离，因断端连接而靠近，以至于能扩增出特定长度的片段。另外一对引物则设计位于缺失区域，这样仅在杂合子或完全正常的情况下，其中的正常等位基因才会扩增出来。此法可以检出大片段缺失的杂合子，如我国常见的α地贫1(东南亚型，即SEA型)和-α^3.7及-α^4，2两种α地贫2。

2.2多重PCR(M-PCR)，多重PCR(multiplex PCR，M-PCR)原理为同时引入几对引物，使几个PCR得以在同一反应体系中完成。现已能用于同时诊断以下几种类型的缺失：--SEA、-α^3.7、和-α^4，2。目前我国临床应用的诊断缺失型α地贫主要应用gap-PCR和这种技术。如深圳益生堂、深圳亚能公司和广州达安公司都提供这种试剂盒。

二、非缺失型(突变型)地中海贫血的基因诊断

1.1PCR-酶解法如突变产生或取消了一个限制性酶切点，用特异的限制酶切PCR产物，就能很容易地检测出某种突变。

1.2错配酶切法由于很多突变并不产生或取消限制性酶切点，这种方法的关键是在引物的3’端，通过改变一个碱基创造或消除一个限制酶切点。

1.3PCR-ASO 聚合酶链反应结合寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)，用ASO探针进行各种杂交，已广泛应用于检测基因突变和多态性。此法也曾用于点突变α和β-地贫的检测。

1.4ARMS突变特异性扩增(ARMS)，又称为等位特异性PCR(AS-PCR)。其基本原理是，在一对引物之一的3’端设计一个碱基与突变碱基配对，这样，此引物由于3’端与正常DNA不配对而在PCR反应中不能延伸，突变的DNA则可以延伸。因而可将一段正常DNA与该段突变DNA分开。

1.5DGGE变性梯度凝胶电泳(DGGE)，能够检出基因组DNA中是否存在突变，但不能确定突变的位置和性质的准确信息，而这需由测序来完成。

1.6RDB反向点杂交(RDB)，检测点突变的原理和ASO法相同，但RDB是在膜上固定ASO探针而非固定靶DNA。这样，在一个杂交反应中便能同时分析一个标本中存在的多种点突变。杂交信号的检测现多采用非同位素方法。该技术关键是根据靶序列突变点的碱基结构特点，选择和调整ASO探针组成和长度，使各种固化ASO探针在杂交时具有尽可能一致的解链温度。目前国内应用于检测基因突变引起的β地贫和α地贫就采用这种技术。

1.7PCR-SSCP聚合酶链反应结合单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，其原理为单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA的电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基替代、微小插入或缺失的检测。这种技术较为复杂，目前应用范围越来越窄。

高分辨熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)介绍

一、HRM简介

高分辨熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是近年来国际上兴起的一种最新的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性)及突变研究工具。该技术是2002年由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的应用于SNP检测分析的一项新技术。

这种检测方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。由于其具有灵敏度高、特异性好、高通量、检测成本低等优势，目前已广泛应用于流行病学等大规模的未知突变/SNP和已知突变的genotyping工作。

与RDH(反向斑点杂交)技术相比，这种检测方法不受突变碱基位点与类型局限，在进行针对已知位点的基因分型工作时，无需序列特异性探针，只需要合成低成本的非标记探针或者直接使用小片段扩增的方案，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。

二、HRM原理

高分辨率熔解曲线分析(HRM)是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况。单核苷酸多态性(SNP)位点因不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。

检测的样本是PCR产物，依据杂合异源双链的原理或者不同样品DNA双链的Tm值差异的原理。在PCR反应前加入LC Green饱和荧光染料(LC Green荧光染料只结合DNA双链，对PCR不会有任何抑制作用)，然后将PCR产物(96/384孔板)直接在PCR仪中进行熔解分析，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，使DNA双链逐渐解链，此时LC Green荧光染料分子逐渐从DNA双链上脱落，96孔板中的每一个孔里的荧光信号均下降。

三、HRM与常规熔解曲线的区别

HRM的概念早在上世纪70年代就已经提出并应用于相关的研究中。限于当时有限的实验条件，人们通过紫外吸收来绘制熔解曲线，当然这种方法在检测精度上相比现在的研究手段要大打折扣。随着仪器的改良和定量PCR技术的出现，人们开始用Sybr Green I荧光染料在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化，这也是现今使用最多的熔解曲线研究工具。然而限于分辨率的关系，Sybr Green I熔解曲线一般用于区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其它非特异性的扩增。如果要用Sybr Green I熔解曲线来区分SNP，目前看来是无法实现的，这与该类染料的特性相关。Sybr Green I这类染料属于非饱和性染料，由于染料对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远低于将DNA双螺旋结构中的小沟饱和的浓度，由于使用浓度未达到饱和，加之染料本身的特性，在DNA双链解链的过程中，Sybr Green I分子发生重排，那些从已经解链的DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，无法真实反映DNA熔解的情况，影响了检测的分辨率。

近几年来，人们发现/发明了一类新型的染料，称为饱和染料，如LC Green，LC Green Plus，SYTO 9和Eva Green。这类染料有着更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，在DNA解链过程中不会发生重排，这使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。在仪器精密度提高的基础上，配合这类饱和染料就出现了我们现在所说的高分辨率熔解曲线，即HRM。这样人们便可以利用熔解曲线分析这种极其简单的实验手段来对SNP和突变进行研究了。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种既能单独检测又能并行检测的3种α球蛋白基因突变和10多钟β-球蛋白基因突变的地中海贫血基因检测试剂盒。

一种地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括有以下引物中的一对以上：针对TATA盒nt-28(A→G)(28M)、-29(A→G)(29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；针对CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；针对CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS1-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS1-5M)基因型的SEQID NO.5及SEQ ID NO.6；针对CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；针对IVS2-654C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；针对基因型为Constant spring(CS)、QuongSze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14。

所述α-和β-地中海贫血基因诊断剂盒，针对不同位点突变检测的反应可以在一个或多个反应管中进行。如在多个反应管中进行PCR反应，理想的状况是反应条件相同，即具有相同的变性、退火和延伸的温度，这样所有的检测就可以一次完成，不用多次检测。

本发明的另一目的是提供一种用于地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测的引物。

一组用于地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测的引物，包括有以下引物中的一对以上：针对TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；针对CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；针对CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS1-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS1-5M)基因型的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；针对CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；针对IVS2-654 C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；针对基因型为constant spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14。

本发明试剂盒诊断的原理是运用双链DNA特异荧光进行的实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，结合高分辨熔解曲线分析(high resolution meltinganalysis，HRM)进行基因诊断的方法，能够同时检测α-和β-球蛋白的基因突变，可用于α-和β-地中海贫血的确诊、携带者的筛查和产前基因诊断。本试剂盒的优点是1.检测特异性好，效果准确可靠。2.检测灵敏度高。3.无PCR产物后处理，省力省时。4.闭管操作，避免了扩增产物的污染。5.成本低廉，无需荧光标记的探针。6.高通量，能满足大量标本快速检测的需要。

附图说明

图1：应用HB01-F和HB01-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图2：应用HB02-F和HB02-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图3：应用HB03-F和HB03-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图4：应用HB04-F和HB04-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图5：应用HB05-F和HB05-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图6：应用HB06-F和HB06-R引物扩增的HRM高分辨率熔解曲线示意图；

图7：本发明所述PCR引物位置和质粒的构建图谱；

图8：HRM高分辨率熔解曲线示意图，图中N/N表示野生型基因型(正常)，CS和QS分别表示两者的熔解曲线；

图9：经PCR-HRM鉴定的基因型测序结果。

具体实施方式

本发明应用所述地中海贫血基因诊断试剂盒的检测，在PCR前将适当的荧光染料与反应缓冲液、引物、模版DNA等PCR反应液混合，然后将混合液加入96孔板或384孔板，并直接放入荧光定量PCR仪器中(如Roche LC480)，首先进行PCR，然后在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性。在此期间，仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号变化并绘制温度熔解曲线，根据曲线准确区分野生型、杂合突变、纯和突变，通过软件自动分型，从而区分不同位点发生的突变。

本发明采用实时荧光定量PCR反应的DNA可以来源于人类所有含有核酸的细胞及组织，如血液、精液、脐带血、羊水、血液中的游离DNA、绒毛组织、毛囊以及植入前的胚胎等。

本发明所用的质粒对照的构建按照本领域的常规方法，大致如下：

构建过程如下，首先获得beta-globin的序列信息如下：加重为外显子部分。NCBI Reference Sequence：NG-000007.3。参见图7。

材料：

pUC18 vector、限制性内切酶(Kpn I、Hind III)、T4 DNA Ligase购自TaKaRa公司；KOD plus-Mutagenesis Kit购自TOYOBO公司。

方法：

以正常人基因组DNA为模板，通过PCR扩增出包含β珠蛋白基因转录起始位点前-128位到转录起始位点后第586位共714bp的序列(GenBankNG_000007.3)，构建重组质粒pUC18-NP1。pUC18-NP1的上游引物为5′-AGGGTACCTACGGCTGTCATCACTTAGA-3′，下游引物为5′-CCAAAGCTTACTGTACCCTGTTACTTATC-3′。通过PCR扩增出包含β珠蛋白基因转录起始点后第1074位到第1813位共740bp的序列，构建重组质粒pUC18-NP2。pUC18-NP2的上游引物为5′-TTGGTACCGGGCAATAATGATACAATG-3′，下游引物为5′-TGAAAGCTTTTCTGAGGGATGAATAAGG-3′。其中GGTACC为Kpn I的酶切位点，AAGCTT为Hind III的酶切位。用Premix PrimeSTAR HS聚合酶进行PCR反应，反应条件为，98℃ 10s；68℃ 1min；30个循环。将PCR反应产物用Kpn I和Hind III双酶切后回收，与经同样酶切回收后的载体pUC18，通过T4 DNA Ligase在16℃进行连接反应10h，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。以pUC18-NP1和pUC18-NP2为模板，利用定点突变技术分别构建12种β地贫突变质粒。引物序列见表2。用KOD plus高保真聚合酶进行PCR反应，反应条件为：94℃ 2min，98℃ 10s，68℃ 4min，反应7个循环。扩增反应结束后，首先用Dpn I处理PCR产物，然后加入Ligation high和T4 Polynucleotide Kinase进行连接反应，最后连接产物转化大肠杆菌DH5α。对阳性克隆进行DNA测序鉴定。

表1.12种地贫质粒引物序列

实施例1

本实施例所述的地中海贫血基因诊断试剂盒，

包括表2中的引物：

表2.HRM突变筛查中HBB基因所用引物。

荧光染料成分：LC Green Plus。

本发明也可以使用其它染料，例如LC green、SYTO 9、Eva Green或其它饱和荧光染料。

实验步骤

(1)DNA提取：外周静脉血采用EDTA抗凝管收集2ml。采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，经定量后稀释成10-20ng/μl备用。

(2)引物设计：根据我国南方人的HBB的基因突变特点共设计6对引物(表1，图7)，在设计中，根据发明人丰富的经验和大量的实验，设计出尽可能多覆盖中国人群已知的β地贫突变位点，同时尽可能排除内含子中的多态位点的引物。具体见表1。

(3)PCR反应：采用96孔板(Roche480专用)进行PCR扩增，扩增体系为20μl：基因组DNA 1μl(约10-20ng)或10³copy/ml的质粒1μl(对照)，5×反应缓冲液，dNTP 250μM，引物各0.2μM，1×LC Greens PLUS染料(IdahoTechnology)，Promega聚合酶1.0U，加灭菌蒸馏水至20μL。循环条件：95℃3min；98℃10s，60℃10s，72℃20s，33个循环。

(4)HRM分析：PCR结束后将96孔板直接进行HRM分析(Roche 480II)。温度范围设置为70-96℃，温度变化速度为0.1℃/s。用软件对采集后的曲线进行分析。

(5)DNA测序：对所有研究对象的HBB基因进行测序分析，以验证HRM分析结果。

(6)构建含有野生型和常见的突变型DNA的质粒。

(7)结果

应用这种方法能够鉴定和诊断华南地区常见的β地贫，能够鉴定的基因型包括TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)、-28M/-28M(图1)，CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG(IntM)(图2)，CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS1-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS1-5M)(图3)，CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M(图4)，CD71-72(+A)(71-72M)(图5)，IVS2-654C→T(654M)、654M/654M(图6)。

从图1中可看出，应用HB01-F和HB01-R引物扩增，可以对在此片段内的-28M、-29M、-28M/-28M进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型，-28M/N表示-28M杂合子，-29M/N表示-29M杂合子，-28M/-28M表示-28M纯合子。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域常见的地中海贫血的基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图2中可以看出，应用HB02-F和HB02-R引物扩增，可以对在此片段内的17M、14-15M、IntM进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型(正常)，17M/N表示17M杂合子，14-15M/N表示14-15M杂合子，IntM/N表示IntM的杂合子，17M/17M表示17M的纯合子，SNP C/T表示在此区域的一个位点的SNP，通过测序证明。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域常见的地中海贫血的基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图3中可以看出，HRM高分辨率熔解曲线示意图。应用HB03-F和HB03-R引物扩增，可以对在此片段内的27-28M、26M、IVS1-1M、IVS1-5M进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型(正常)，27-28M/N表示27-28M杂合子，26M/N表示26M杂合子，IVS1-1M/N表示IVS1-1M的杂合子，IVS1-5M/N表示IVS1-5M的杂合子。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域常见的地中海贫血的基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图4中可以看出，HRM高分辨率熔解曲线示意图。应用HB04-F和HB04-R引物扩增，可以对在此片段内的41-42M、43M进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型(正常)，41-42M/N表示41-42M杂合子，43M/N表示43M杂合子，41-42M/41-42M表示41-42M的纯合子。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域常见的地中海贫血基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图5中可以看出，HRM高分辨熔解曲线示意图。应用HB05-F和HB05-R引物扩增，可以对在此片段内的71-72M进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型(正常)，71-72M/N表示71-72M杂合子。图中可见N/N和71-72M/N表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域常见的地中海贫血基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图6中可以看出，HRM高分辨率熔解曲线示意图。应用HB06-F和HB06-R引物扩增，可以对在此片段内的654M进行基因诊断，图中N/N表示野生型基因型(正常)，654M/N表示654M杂合子，654M/654M表示654M纯合子。SNP T/C表示在此区域的一个位点的SNP，通过测序证明。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域的不同基因型进行准确的基因诊断。图右侧表示相关的基因型应用反向斑点杂交(基因芯片)技术对基因型的确认。

从图6中可以看出，PCR引物位置和质粒的构建图谱。上图为质粒结构、常见β-球蛋白基因突变位点和引物位置图，C为构建质粒的测序结果，成功构建-29M、14-15M、17M、27-28M、41-42M、654M等的突变质粒和野生型质粒(图7)。

除了以上的基因型，对处于不同扩增片段的β地贫的双重杂合子(表现为中、重度地贫)，如654M/-28M，其熔解曲线表现为图1和图6的组合。

采用此种方法能够对绝大多数的中国人的β地贫进行基因诊断。

HRM验证实验结果HRM分析结果显示，β地贫患者的16种突变都可与正常对照正确区分，且不同基因型之间也可相互区分，每种基因型都有其独特的熔解曲线。此外，-28M/-28M、41-42M/41-42M和654M/654M这三种纯合突变也均得到正确检测。

所有样本的HRM分析结果与RDB及DNA测序结果一致(图9)。

图9为检测临床标本的测序结果，包括CD41-42-TCCT(41-42M)、IVS-II-654C→T(654M)、CD17A→T(17M)、-28A→G(-28M)、CD26G→A(βEM)、CD71-72+A(71-72M)、CD43G→T(43M)、-29A→G(-29M)、IVS-I-1G→T(IVS-I-1M)，CS和QS的杂合子。

实施例2

非缺失型α-地中海贫血的基因诊断。

我国常见的非缺失型的α-地中海贫血的基因型为CS(constant spring)、QS(Quong Sze)和WS(Westmead)。

实验步骤

(1)DNA提取：外周静脉血采用EDTA抗凝管收集2ml。采用DNA试剂盒提取基因组DNA，经定量后稀释成10-20ng/μl备用。

(2)引物设计：引物Forward：

5‘-CACTGCCTGCTGGTGACC-3’(SEQ ID.NO.13)

Reverse：5’-GCAGGAGGAACGGCTACC-3’(SEQ ID.NO.14)

(3)采用96孔板(Roche480专用)进行PCR扩增，扩增体系为20μl：基因组DNA 1μl(约10-20ng)或10³copy/ml的质粒1μl，5×反应缓冲液，dNTP250μM，引物各0.2μM，1×LC Greens PLUS染料(Idaho Technology)，Promega聚合酶1.0U，加灭菌蒸馏水至20μL。循环条件：95℃3min；98℃10s，60℃10s，72℃20s，33个循环。

(4)HRM分析，PCR结束后将96孔板直接进行HRM分析(Roche 480II)。温度范围设置为70-96℃，温度变化速度为0.1℃/s。用软件对采集后的曲线进行分析。

(5)DNA测序对所有研究对象的HBB基因进行测序分析，以验证HRM分析结果。

(6)结果我们应用与β-地中海贫血相同的方法，可以获得这三种突变型特异的熔解曲线(图8)。

参见图8：图中N/N表示野生型基因型(正常)，CS和QS分别表示两者的熔解曲线。诊断通过测序验证。图中可见不同的基因型表现为不同的HRM熔解曲线形状，能够将此区域的不同基因型进行准确的基因诊断。

将样本经过DNA测序(图9)和RDH(深圳亚能反向斑点杂交试剂盒)，结果证明与HRM分析完全一致。

实施例3：

收集多份不同基因型的地中海贫血的标本，运用实施例1和实施例2的检测方法，将α-地中海贫血和β-地中海贫血一起检测，PCR反应体系和HRM分析与上述相同。同时，将样本经过DNA测序和RDH(深圳亚能反向斑点杂交试剂盒)验证。

表3.1.β-地贫经HRM分析和基因测序以及深圳亚能反向斑点杂交试剂盒检测的标本数

表3.2.α-地贫经HRM分析和基因测序以及深圳亚能反向斑点杂交试剂盒检测的标本数

从上述结果中，可以看出，本发明所述的地中海贫血基因诊断试剂盒，所述的地中海贫血基因诊断的引物和试剂盒，检测特异性好，灵敏度高。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims

1.一种地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是，包括有以下引物中的一对以上：针对TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；针对CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；针对CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS-I-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS-I-5M)基因型的SEQID NO.5及SEQ ID NO.6；针对CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43(G→T)(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；针对IVS2-654C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；针对基因型为Constant spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14。

2.根据权利要求1所述的地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是，还包括有饱和荧光染料。

3.根据权利要求2所述的地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是，所述饱和荧光染料为LC green、LC Green Plus、SYTO 9、或Eva Green。

4.一种用于地中海贫血基因实时荧光定量PCR检测的引物，其特征是，包括有以下引物中的一对以上：针对TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；针对CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密码子突变ATG→AGG基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；针对CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS-I-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS-I-5M)基因型的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；针对CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；针对CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10；针对IVS2-654C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ IDNO.11及SEQ ID NO.12；针对基因型为Constant spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14。