CN104946779A - 一种检测HLA-B*57:01等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法 - Google Patents
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Abstract
本发明设计了适用于TaqMan探针实时荧光PCR法检测HLA-B*57:01基因型的特异性引物探针组合，即上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，下游引物Rp：5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’，探针Probe：5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’；同时使用β-Globin做内参基因，将目的基因和内参基因的引物和探针加入同一反应体系进行双通道实时荧光PCR反应，通过扩增曲线分析结果。采用本发明设计的特异性引物探针组合以及检测方法，特异性和灵敏度高，同时具有操作简便、分辨率高、无污染、高通量等特点。
Description
技术领域
本发明属于药物基因分析领域，针对HLA-B*57:01等位基因的特异性引物及探针设计，以及检测方法。
背景技术
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成，是早期从组织器官移植实验中发现的，人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体，其编码的分子表达于白细胞上，称为人类白细胞抗原(human leucocyteantigen，HLA)。丰富的多态性是HLA基因系统的一个最重要特点，HLA复合体中的许多DNA序列都存在变异体，称为等位基因。HLA基因系统的多态性保证了个体对各种病原体的免疫应答。近年来临床药物基因组学研究将阿巴卡韦(Abacavir，ABC)所致的超敏反应(HSR)和HLA-B*57:01等位基因密切关联起来。在服用ABC的HSR患者中，HLA-B*57:01等位基因的携带率为94.4％，相比于未产生ABC HSR的患者，其HLA-B*57:01的携带率仅为11.7％，证明HLA-B*57:01与ABC HSR具有明显的统计学关联。
阿巴卡韦，是一种选择性艾滋病病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virusⅠ，HIV-1)和Ⅱ型(HIV-2)抗病毒制剂，作为一种核苷类反转录酶抑制剂,，从1999年即作为经典的联合用药中的一种药物，被欧美一些国家采用，目前仍是美国食品与药品管理局推荐的初次服用的首选药物。但是据现有资料报道服用阿巴卡韦药物后，大约有5％-8％的人会出现阿巴卡韦过敏反应(ABC HSR)。ABC HSR是一种多器官综合征，最常见的症状包括发热(见于约80％的病例)、皮疹(见于约70％的病例)、不适、疲劳、恶心、呕吐，其他还包括：肌肉痛或关节痛、头痛、腹泻、瘙痒、低血压和各种呼吸系统症状。研究表明94％的反应出现在用药6周内发生，近50％患者有3-4个器官或系统受累表现，如果曾发生过ABCHSR，再次用药后各种相关临床症状出现的几率远高于首次用药的反应。
2002年Mallal等研究发现阿巴卡韦斑贴实验阳性者人群遗传的HLA-B*57:01单体型基因频率更高。利用阿巴卡韦特异性的免疫学反应进行判断，结果发现临床诊断ABC HSR阴性组中斑贴实验阳性率为2.7％，HLA-B*57:01试验阳性率为0％，HLA-B*57:01阴性预测率为100％，证明基因筛查能排除免疫介导的类似ABCHSR，减少假阳性诊断。因此越来越多的医师推荐在服用阿巴卡韦之前进行HLA-B*57:01基因检测，以降低阿巴卡韦引起的不良反应。
目前常用HLA等位基因检测方法包括：PCR-SSP，PCR-SBT等。PCR-SSP即序列特异性引物法，根据某一等位基因的核苷酸序列设计特异的引物，直接进行PCR，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物片段大小来判断；虽然该技术操作简便，对样本要求不高，但由于此方法需要进行电泳，在操作过程中易造成二次污染、时间长，而且在PCR过程中容易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果。PCR-SBT即直接测序法，该方法可直接获得DNA序列，鉴定所有可能存在的多态性，为最直接的方法，同时特异性强，灵敏度高，是国际公认的HLA等位基因分型方法的“金标准”；但是由于该方法成本高、耗时长，同时目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果。尤其，操作繁琐，耗费时间，价格昂贵等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测“快速、简便”的特点。因此，对HLA等位基因的检测，实时荧光定量PCR法被越来越多的人所推荐，该方法是在普通PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用信号积累检测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线或测量指数扩增期的荧光值来进行定量或者定性的方法；该技术不仅能实现对DNA模板的定量，而且灵敏度高、特异性强、稳定性好、能实现多重反应、反应后不需要开盖避免了二次污染。目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
虽然HLA-B*57:01的基因检测有重要的临床意义，但迄今为止HLA-B*57:01的基因检测仍面临着很多问题。目前针对HLA-B*57:01的检测技术以PCR-SSP方法为主，该方法需要在PCR之后进行琼脂糖凝胶电泳，作为HLA-B*57:01基因检测的金标准PCR-SBT测序法，这些方法都需要在PCR之后开管，易造成基因扩增产物污染，且检测通量较低、操作繁琐、成本高、时间长。
考虑到HLA等位基因的多态性，HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针的前期准备和具体设计需要进行充分的研究和实验，目前尚未见有关文献披露合适的HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针。
发明内容
本发明的目的是在现有的PCR技术基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特异性高的实时定量荧光PCR方法来检测人类白细胞抗原等位基因HLA-B*57:01，以改善现有技术上所存在的缺陷。本方法能为艾滋病患者服用阿巴卡韦后出现过敏反应的可能性的判断提供有意义的参考，从而有利于HLA-B*57:01基因型指导下的阿巴卡韦的安全用药。
本发明在设计HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针之前，通过HLA-B中3500个其它等位基因序列的比对，发现HLA-B*57:01与多个HLA-B等位基因都具有很高的同源性，尤其是HLA-B*57:01与HAL-B*58:01等位基因序列最为相似；同时，HLA-B*57:01等位基因的特异性位点相对来说较少，这些针对HLA-B*57:01等位基因特异性的位点主要分布在外显子2和内含子2的区域中。然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计TaqMan探针检测的特异性引物(可排除大多数HLA-B等位基因)以及特异性探针(主要区别HLA-B*58等位基因)，因此，探针和引物设计的位置能够排除其它HLA-B等位基因的结合、识别，尤其是HLA-B*58:01等位基因。采用TaqMan探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线的分析结果，来判断未知样本是否携带HLA-B*57:01等位基因。
具体而言，本发明主要设计了以下引物序列：
(1)HLA-B*57:01特异引物和探针
上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’
下游引物Rp：5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’
探针Probe：5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’
(2)β-Globin内参引物和探针：
上游引物Fp：5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’
下游引物Rp：5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’
配套探针Probe：5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2；
本发明所提供的检测HLA-B*57:01等位基因PCR检测方法，包含以下步骤：
(1)待测样本DNA的提取；
(2)设计目的基因的一对特异性引物和一条探针；
(3)设计内参基因的一对引物和一条探针；
(4)分别各自将目的基因、内参基因的引物及探针按照一定比例混合(Mix)；
(5)通过Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480进行实时定量荧光检测；
(6)分析判断待测样本是否携带HLA-B*57:01等位基因。
质控样本和检测样本的制备：
(1)质控样本类型
选取经PCR-SBT检测HLA-B*57:01等位基因型为阳性的样本作为待测样本的阳性质控；经PCR-SBT检测不携带HLA-B*57:01等位基因的样本作为阴性样本。
(2)检测样本的准备
用相应的DNA提取试剂盒处理血液样本或组织样本得到基因组DNA，并用紫外分光光度计NanoDrop检测DNA的浓度和质量；将质量合格的DNA稀释至50ng/μL或10ng/μL，备用。
所述实时荧光PCR检测的扩增程序为：95℃预变性15s；95℃5s，64℃34～40s，共计35～40个循环。
本发明的优点主要有：
1、节省时间和耗材、高通量
本发明在很大程度上节省时间和耗材，同时也操作简单，其检测过程只需要50min-1h，整个实验可以在2h内全部完成。使用本发明方法，可一次同时高通量进行96例或者384例样本的检测，因此，可完全使用本发明进行HLA-B*57:01等位基因检测，适用于临床分子诊断。
2、结果可靠、灵敏度高
采用本发明方法与HLA等位基因分型“金标准”PCR-SBT测序进行方法学对比，100例样本结果完全吻合；本发明中，只需10ng-20ng基因组DNA便可进行准确的HLA-B*57:01等位基因检测，大大提高了检测的灵敏度。
3、检测方法灵活、无污染
本发明方法与传统的HLA等位基因检测方法相比，未涉及多重扩增、重复开盖等二次污染的可能。本发明，操作简便、耗时短、安全、无污染。
4、成本低、经济适用
由于本发明具有高通量的特点，因此使得本发明中每个反应管的成本低；同时，此技术适用于检测人类全血、组织等全基因组DNA样本，较经济适用。
附图说明
图1为利用内参基因(β‐Globin)的引物与探针对人基因组DNA实时荧光扩增结果。曲线1为阳性样本(2条DNA链至少有一条携带HLA-B*57:01等位基因)，曲线2为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA-B*57:01等位基因)，NTC扩增曲线表明此实验无污染。
图2为利用目的基因(Target)的引物与探针对人基因组DNA实时荧光扩增结果。曲线1为阳性样本(DNA链携带HLA-B*57:01等位基因)，曲线2为阴性样本(2条DNA链均不携带HLA-B*57:01等位基因)，NTC扩增曲线表明此实验及引物和探针无污染。
图3为利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集的实时荧光扩增结果。
图4为HLA-B*57:01标准阳性样本DNA系列稀释后实时扩增曲线，样本系列稀释倍数分别为1:5，1:25，1:125，1:625，1:3125。
具体实施方式
为了便于理解，以下结合附图并通过具体实施例对本发明的方法进行详细地描述。
实施例1TaqMan探针法检测HLA-B*57:01等位基因
1、DNA样本的提取及稀释
按常规方法获得用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血后，使用QIAamp DNA Mini Blood Kit(德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA；将已提取的DNA使用NanoDrop 2000进行浓度测定(A260/280＝1.95～2.15)。用上述方法，分别测得104例布依族DNA样本浓度，然后使用PCR等级的H2O将样本稀释至10ng/μL。
2、设计引物和探针
在HLA-B多态性位点集中区域设计HLA-B*57:01的一对特异性引物：
上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，
下游引物Rp：5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’，
以及配套的荧光探针probe:5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’；
另外在β-Globin基因上设计内参引物：
上游引物Fp:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’，
下游引物Rp:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’，
以及配套的荧光探针probe:5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG–BHQ2-3’。
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2；
委托上海某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(β-Globin)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-B*57:01特异性上游引物Fp 250nM，下游引物Rp 250nM，HLA-B*57:01特异性探针100nM，以及β-Globin基因特异性上游引物100nM，下游引物100nM，探针50nM，然后加入被测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA-B*57:01基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。
4、结果分析
内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线，代表DNA样本质量合格；若待测样本的HLA-B基因座序列与特异性引物覆盖区域序列一致，并且与探针覆盖范围内的序列一致，则会出现相应的荧光扩增曲线；在内参基因出现扩增曲线的前提下，目的基因也必须出现荧光扩增曲线，这样才可判断该样本携带HLA-B*57:01等位基因。
实施例2HLA-B*57:01基因型特异引物灵敏度检测
1、DNA样本的稀释
取HLA-B*57:01标准阳性样本DNA作为试验样品，其浓度为10ng/μL。用PCR等级的H2O 5倍连续稀释样品，即1:5，1:25，1:125，1:625，1:3125；其DNA浓度分别为：10ng/μL，2ng/μL，0.4ng/μL，0.08ng/μL,0.016ng/μL。
2、设计引物和探针
在HLA-B多态性位点集中区域设计HLA-B*57:01的一对特异性引物，上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，下游引物Rp：5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’，以及配套的荧光探针probe:5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’；另外在β-Globin基因上设计内参引物，上游引物Fp:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’，下游引物Rp:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’，以及配套的荧光探针probe:5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-BHQ2-3’。
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2；
委托上海某公司合成。
3、样本检测
在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因(β-Globin)的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增，反应体系(20μL)包括：10μL Premix Ex Taq(2×)，HLA-B*57:01特异性上游引物Fp 250nM，下游引物Rp 250nM，HLA-B*57:01特异性探针100nM，以及β-Globin基因特异性上游引物100nM，下游引物100nM，探针50nM，然后加入被测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；用于检测HLA-B*57:01基因型的扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计35～40个循环。
4、实验结果
HLA-B*57:01标准样品DNA系列稀释后实时扩增结果见图4。由图4可见，标准样品系列稀释倍数1:5(10ng/μL)，1:25(2ng/μL)，1:125(0.4ng/μL)，1:625(0.08ng/μL)1:3125(0.016ng/μL)。本发明由此可检测低至0.02ng DNA左右的样本。
验证实验：100例样本进行PCR-SBT测序与HLA-B*57:01等位基因检测方法比较
从4个不同民族中随机抽取100例样本，将其送至GenDx公司进行SBT金标准测序，并且测序结果用Excel表格进行展示，以便对本发明实验结果进行复核。将SBT测序结果与本发明的检测方法结果进行比对(见表1)，发现两者之间的阴、阳性符合率均为100％。
表1
本发明在前期准备的标准品使得在建立HLA-B*57:01等位基因检测方法的同时，进一步提高了判断待测样本是否携带HLA-B*57:01的准确度。因此，我们利用全基因组扩增技术将标准品样本进行了富集，以便多次使用。
Claims (7)
1.用于TaqMan探针实时荧光PCR法检测HLA-B*57:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下特异性引物和探针序列：
上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’
下游引物Rp:5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’
探针Probe：5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’
其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括以下内参β-Globin引物和探针序列：
上游引物Fp:5’-AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’
下游引物Rp:5’-TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’
配套探针:5’-FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-BHQ2-3’
其中，FAM为6-carboxyfluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2。
3.一种检测HLA-B*57:01等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，用于非疾病诊断目的；包括以下环节：
(1)待测样本DNA的提取；
(2)设计目的基因的一对特异性引物和一条特异性探针，即权利要求1中所述的特异性引物和探针序列；
(3)设计内参基因的一对引物和一条探针，即权利要求2中所述的内参β-Globin引物和探针序列；
(4)分别将目的基因、内参基因的引物及探针按照一定比例混合(Mix)；
(5)通过荧光定量PCR仪进行实时荧光检测；
(6)分析判断待测样本是否携带HLA-B*57:01等位基因。
4.根据权利要求3所述的检测HLA-B*57:01等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：所述荧光定量PCR仪采用Applied Biosystem 7500或者LightCyclerSystem480。
5.根据权利要求3所述的检测HLA-B*57:01等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：环节(4)和环节(5)是在荧光定量PCR仪上，将目的基因和内参基因的引物、探针同时加入一个管中，分别利用FAM通道和HEX/VIC通道进行双通道荧光采集；使用Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa)进行扩增；反应体系以20μL计，包括：10μLPremix Ex Taq(2×)，HLA-B*57:01特异性上游引物Fp 250nM，下游引物Rp 250nM，HLA-B*57:01特异性探针100nM，以及β-Globin基因特异性上游引物100nM，下游引物100nM，探针50nM,然后加入待测样本基因组DNA约10ng-50ng，补充PCR等级的水至终体积20μL；扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s～10sec，64℃34s～40sec，共计34～40个循环。
6.根据权利要求5所述的检测HLA-B*57:01等位基因的TaqMan探针实时荧光PCR方法，其特征在于：目的基因和内参基因的特异性引物和探针在荧光定量PCR仪上加入同一管中进行扩增，但是用两个通道进行荧光的采集；内参基因作为质控，必须出现荧光扩增曲线；在内参基因观察到扩增曲线的前提下，特异性探针必须同时扩增到曲线，则判定待测样本携带HLA-B*57:01等位基因。
7.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备基因检测试剂盒方面的用途，其特征在于：针对的基因为HLA-B*57:01等位基因。
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