CN103184291A - 一种检测人hla-b*57:01等位基因的试剂盒 - Google Patents
一种检测人hla-b*57:01等位基因的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，包括含有检测HLA-B*57:01和所有HLA-B*57引物的PCR反应液，检测HLA-B*57:01的引物为引物B57F、B57R1、B57R2，引物B57F的序列如SEQIDNO：1所示，引物B57R1的序列如SEQIDNO：2所示、引物B57R2的序列如SEQIDNO：3所示，检测所有HLA-B*57的引物为引物BF11N和BIR57，引物BF11N的序列如SEQIDNO：4所示、引物BIR57的序列如SEQIDNO：5所示，本发明检测灵敏度高，特异性好，无需测序就可精确地对其基因型进行分型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因分型检测试剂盒，特别是一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒。
背景技术
人白细胞抗原(HLA)是细胞表面分子，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，HLA基因位于第6号染色体短臂，由众多复杂的等位基因构成，是目前所知多态性最复杂的遗传系统。由HLA多态性的基因编码的HLA蛋白对免疫介导或控制的疾病的易感性，个体变异，及药物诱发的副反应中起重要作用。以前往往通过血清学检测进行HLA分型，但结果并不精确。现在一般则是通过HLA的序列来分析HLA的基因型。尽管测序的方法能得到最准确的序列信息，但是这会花费大量的时间，在临床中并不适用。
近年的研究表明，HLA-B的基因的多态与药物的不良反应密切相关。一些研究人员发现，在对HIV携带者进行治疗时，一些患者对抗艾滋药物阿巴卡韦(Abacavir，简称ABC)会产生严重的全身过敏性反应，甚至危及生命。进一步研究发现，HLA-B*57:01与ABC产生的严重的全身过敏反应存在密切关系,是目前发现的与药物反应的相关性最好的遗传标记物之一，此耐药项目的研究人员SimonMallal于2003申请的专利WO03/068958A1中公开了使ABC产生药物反应的基因座位置和检测方法。因此，为此艾滋病治疗指南要求患者在使用ABC药物前，必须筛查HLA-B*57:01基因，当检测结果为阴性，即患者不含HLA-B*57:01基因时方可使用ABC药物。
虽然以前的研究证实了HLA-B*57:01基因与抗艾滋药物阿巴卡韦的过敏反应存在相关性，艾滋病治疗指南也要求患者在使用ABC药物前必须筛查HLA-B*57:01基因，但目前缺乏对HLA-B*57:01基因检测的试剂盒。同时，现在的测序方法虽然能得到精确的序列信息，但并不适合在检测时大规模推广。因此，获得HLA检测结果所需的高额费用和相对长的检测时间就成为有效实施治疗指南的主要障碍。对于能以低费用进行的简单、精确且快速的HLA-B*57:01检测存在巨大的需求。使用PCR序列特异性引物（sequence specific primer，SSP）分析技术检测，这种方法是使用能够特异识别特定等位基因的引物，以PCR扩增后检测序列多态性。根据决定某等位基因的碱基性质，设计3′端第一个碱基分别与各等位基因的特异性碱基相匹配的序列特异性引物，在PCR反应过程中，只有引物3′端第一个碱基与决定特定等位基因的碱基互补时才能实现DNA片段的完全复制，根据PCR产物的有无进行等位基因的分型。这种方法可使我们目前开展的检测手段的标准化，无需测序，通过序列条带就能分辨特异性的HLA基因。
但是，虽然PCR-SSP只需要PCR就可以确定基因型的SNP，简便、廉价，适合于分子标记的要求。但是该技术没有被大量用于检测基因型的SNP，其主要原因是引物的稳定性较差。
鉴于国内现在尚无HLA-B*57:01基因检测试剂盒，国际上虽然有对HLA-B*57:01基因检测的试剂盒，但是采用通用引物扩增后测序的方法进行HLA-B*57:01基因的检测，导致了样品检测时间较长，检测成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，所述的这种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒解决了现有技术中的试剂盒检测HLA-B*57:01基因的时间长，检测成本高的技术问题。
本发明提供了一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，包括含有检测HLA-B*57:01和所有HLA-B*57等位基因引物的PCR反应液，所述的检测HLA-B*57:01的引物为引物B57F、引物B57R1、引物B57R2，所述的引物B57F的序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物B57R1的序列如SEQ ID NO：2所示，所述的引物B57R2的序列如SEQ ID NO：3所示，所述的检测所有HLA-B*57的引物为引物BF11N和引物BIR57，所述的引物BF11N的序列如SEQ ID NO：4所示、所述的引物BIR57的序列如SEQ ID NO：5所示,所述的引物B57F、引物B57R1、引物B57R2、引物BF11N和引物BIR57在PCR反应液中的浓度分别为0.5μM。
进一步的，在所述的PCR反应液中还含有内对照引物，所述的内对照引物为引物HGHF和引物HGHR，所述的引物HGHF的序列如SEQ ID NO：6所示、所述的引物HGHR的序列如SEQ ID NO：7所示，所述的内对照引物HGHF和HGHR在PCR反应液中的浓度分别为0.2μM。
进一步的，在所述的PCR反应液中还包括染料，dNTPs和PCR缓冲体系。
优选的，所述的染料为甲酚红，浓度为0.01%(wt/vol)；dNTPs的浓度为0.2mM。
优选的，所述的PCR缓冲体系为由Tris-HCl、氯化钾、氯化镁和明胶组成，在所述的缓冲体系中，所述的Tris-HCl的浓度为10mM，所述的氯化钾的浓度为50mM，所述的氯化镁的浓度为1.5mM，所述的明胶的浓度为0.001%(wt/vol)。
进一步的，本发明试剂盒中还包括Taq酶，所述的Taq酶的最终使用量为0.3单位/微升。
本发明还提供了用于上述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了用于上述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了用于上述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供了用于上述的试剂盒的检测人所有HLA-B*57等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了用于上述的试剂盒的检测人所有HLA-B*57等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO：5所示。
具体的，引物B57F（SEQ ID NO:1），B57R1（SEQ ID NO:2），B57R2（SEQID NO:3）用于检测HLA-B*57:01等位基因，两条反向引物B57R1（SEQ ID NO:2）和B57R2（SEQ ID NO:3）能完全涵盖目标的SNP位点，杜绝了对此基因漏检的可能，并在引物的3’端引入了错配碱基以增加引物的特异性。引物BF11N（SEQ IDNO:4）和引物BIR57（SEQ ID NO:5）用于检测所有HLA-B*57等位基因，引物BIR57位于HLA-B基因内含子，能特异性检测所有B57等位基因，使用这对引物是对B57基因的双重确认，能保证此检测试剂盒的检测结果准确性。引物HGHF（SEQ ID NO:6）和HGHR（SEQ ID NO:7）是内对照引物，扩增人类生长因子基因片段，扩增片段长度429bp，以保证反应体系正确进行。
本发明中的引物序列：
1、检测HLA-B*57:01等位基因引物:PCR产物93bp
B57F（SEQ ID NO:1）：CCA GGG TCT CAC ATC ATC CAC GTG
B57R1（SEQ ID NO:2）：GTA ATC CTT GCC GTC GTA GCC GG
B57R2（SEQ ID NO:3）：GTA ATC CTT GCC GTC GTA CGC AG
2、检测所有HLA-B*57等位基因:PCR产物197bp。
BF11N（SEQ ID NO:4）：TAT TGG GAC GGG GAG ACA CGG CAC AT
BIR57（SEQ ID NO:5）：GTC CCC GCG GCC TCA GGG CGG T
3、内对照引物:PCR产物429bp
HGHF（SEQ ID NO:6）：GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG
HGHR（SEQ ID NO:7）：TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT CCT CCC
本发明的另一方面，提供了上述HLA-B*57:01筛选试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1）、以样本DNA作为模板，采用试剂盒中的引物及试剂进行PCR，PCR反应在PCR管或96孔板中完成，向反应微孔中加入模板基因组DNA，含有引物的PCR预混合液和Taq聚合酶，加样完成后将反应混合液混匀，简短离心，进行PCR反应，对HLA-B*57:01基因进行筛选，反应后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测；
2）、根据凝胶电泳的目视结果，即可判断样品中此基因座上存在哪种基因。
进一步的，上述PCR的反应条件为：95°C5min；再依次按照以下程序进行30个循环，95°C30s，60°C30s，72°C90s；最后72°C5min，降温至4°C即可进行凝胶电泳检测。
上述步骤1）中，所述作为模板的样本DNA的量为20-50ng。所述的PCR反应液中包含染料甲酚红，当PCR完成后，无需再加入上样缓冲液（loading buffer），即可直接将PCR产物加至凝胶孔中。
上述步骤2）的凝胶电泳结果判定，根据条带的数量，对基因座的检测结果有3种可能：HLA-B*57:01基因，HLA-B*57族的其它基因，此基因座无HLA-B*57族基因。
本发明中，所述作为模板的样本DNA可以由本领域技术人员根据现有提取方法制备。
本发明基于PCR-SSP技术开发的HLA-B*57:01基因筛查试剂盒，由于使用了特异性引物，相比现有其它检测方法而言，具有快速、简便、准确、直观的特点，实验成本低，且仅需微量检材即可完成实验所需。本发明的检测试剂盒可以很直观的根据扩增后电泳的条带数量，即可判断等位基因基因型，从而完成HLA-B*57:01的基因筛查。由于试剂盒同时检测HLA-B*57家族基因，能够很大程度的增加检测的可靠性，降低了漏检而出现假阳性的可能。本发明将引物，dNTP，PCR缓冲体系和染料甲酚红预先混合，可大大节省实验者的操作时间和工作量。将等位基因的两种引物混合同时扩增，实现一孔完成一个等位基因的分型，满足高通量的实验需求，直接得出分型和筛查结果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合适DNA样品的情况下，本发明的试剂盒在3小时内即可完成整个基因筛查和分型实验，解决了对艾滋病患者使用ABC治疗时需要HLA-B*57:01基因筛查的问题。
本发明的HLA-B*57:01筛查试剂盒，采用优化的特异性引物进行PCR-SSP检测，能够提高特异性引物的稳定性，并使用从受检者口腔细胞或外周血制备的基因组DNA为样品，通过单核苷酸多态性分析，可精确区分HLA-B*57:01和HLA-B*57的其它基因。使之用于艾滋病患者筛查，更好地服务于临床治疗，为参与HIV-1治疗的患者及临床医生提供用药指导，降低药源性不良反应的发生。这将填补国内HLA-B*57:01无相关检测试剂盒的空白。相比于2004年国外研究者报道的使用PCR-SSP方法进行HLA-B*57:01检测，本试剂盒采用新的引物，并同时检测2个SNP位点及内对照基因，大幅度提高了检测结果的准确性，适合在临床检测中的大规模推广。
附图说明
图1是HLA-B*57:01基因定型电泳图谱。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：本发明试剂盒的PCR引物的设计
在本实施例中，PCR引物设计所需要的所有HLA等位基因序列资料取自国际HLA资料库（IMGT/HLA），该资料库网址：http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/。使用该资料库的软件Sequence Alignment Tool做序列对比。引物设计采用人工方法，设计的引物在美国NIH的GenBank资料库中进行BLAST检测，确认该引物能特异性结合HLA-B*57:01等位基因。本试剂盒中，关键是需要该引物在特定的PCR缓冲体系环境下，特异的扩增HLA-B*57:01基因，即该引物具有“序列特异性SSP”。本引物设计中通过两条解决途径，一是实际试验不同长度的引物，使之特异性结合靶基因；二是在引物3’端引入突变碱基，以提高引物结合的特异性。
为了采用特异性的PCR-SSP对HLA-B*57:01基因进行筛查，在HLA-B*57:01基因SNPs位点的上游，设计特异性的上游引物B57F（SEQ ID NO:1）；在包含HLA-B*57:01基因SNPs的位点设计两条引物B57R1（SEQ ID NO:2）和B57R2（SEQ ID NO:3），使其完全涵盖目标的SNP位点，并使SNPs位点位于下游引物的3’末端，为了增加引物的特异性，在下游引物的3’端引入了错配碱基。针对HLA-B*57家族基因序列的特点，对HLA-B*57基因设计特异性的上游引物BF11N（SEQ ID NO:4）；在HLA-B基因内含子设计特异性的下游引物BIR57（SEQ IDNO:5）。同时，对人类管家基因中的生长因子基因，设计上下游引物HGHF（SEQID NO:6）和HGHR（SEQ ID NO:7），作为内对照引物。
1、检测HLA-B*57:01等位基因引物:PCR产物93bp
B57F（SEQ ID NO:1）：CCA GGG TCT CAC ATC ATC CAC GTG
B57R1（SEQ ID NO:2）：GTA ATC CTT GCC GTC GTA GCC GG
B57R2（SEQ ID NO:3）：GTA ATC CTT GCC GTC GTA CGC AG
2、检测所有HLA-B*57等位基因:PCR产物197bp。
BF11N（SEQ ID NO:4）：TAT TGG GAC GGG GAG ACA CGG CAC AT
BIR57（SEQ ID NO:5）：GTC CCC GCG GCC TCA GGG CGG T
3、内对照引物:PCR产物429bp
HGHF（SEQ ID NO:6）：GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG
HGHR（SEQ ID NO:7）：TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT CCT CCC
实施例2：本发明试剂盒的制备
1、引物的合成：引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物的序列分别为SEQID NO:1-7，具体序列如实施例1中所述。
2、PCR反应混合液的制备：将引物1-7，dNTPs，染料甲酚红，Taq酶缓冲液混合。检测引物（SEQ ID NO:1-5）的浓度为0.5μM，内参引物（SEQ ID NO:6-7）的浓度为0.2μM；dNTP的浓度为0.2mM；甲酚红的浓度为0.01%(wt/vol)；PCR缓冲体系为：Tris-HCl10mM，氯化钾50mM，氯化镁1.5mM，明胶0.001%(wt/vol)。
将上述PCR反应混合液和Taq酶分装后包装，组成试剂盒。
实施例3：样品中HLA-B*57:01的基因定型检测
取PCR管，在每管中加入8μl PCR反应混合液，然后加入1μl分别从8份HLA标准细胞株（所有的HLA标准细胞株均从“IHWG Cell and DNA Bank”购买）中抽提的基因组DNA50ng，再加入0.30-0.5uTaq酶。加样完成后将反应混合液混匀，简短离心，进行PCR反应。
PCR的反应条件为：95°C5min；再依次按照以下程序进行30个循环，95°C30s，60°C30s，72°C90s；最后72°C5min，降温至4°C即可进行凝胶电泳检测。
使用0.5×TBE缓冲液，配制3％琼脂糖凝胶。取5μl PCR产物直接点样到凝胶孔中。使用0.5×TBE缓冲液，以10V/厘米电泳15-20分钟，然后在紫外光下拍照记录（见图1）。
结果判定：对基因座的检测结果有3种可能：HLA-B*57:01基因，HLA-B*57族的其它基因，此基因座无HLA-B*57族基因。其中，后两种结果均表示无HLA-B*57:01基因。根据对电泳条带的分析，检测结果与样本原基因型别完全相符（表1）。
表1使用本发明试剂盒的检测结果与样本真实基因型的比较
实施例4：本发明试剂盒的鉴定特异性检测
检测331例由国际组织相容性讨论会细胞和DNA库（The IHWG Cell and DNABank）提供的标准DNA样品，其中有24例样本含B*57:01基因。使用本发明试剂盒进行检测，检测方法和结果判断方法同实施例3。
对检测结果分析后，所有的样本本试剂盒均能准确检测。331例样品中带有B*57:01基因的24例样品，本试剂盒鉴定结果全部为阳性，其余样品检测结果均为阴性，假阳性和假阴性结果均为0（表2）。大量样本检测的结果说明，本试剂盒的特异性良好，检测结果准确，完全符合临床鉴定的需求。
表2本发明试剂盒所检测样品中的B*57:01基因
Claims (11)
1.一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：包括含有检测HLA-B*57:01和所有HLA-B*57等位基因引物的PCR反应液，所述的检测HLA-B*57:01的引物为引物B57F、引物B57R1、 引物B57R2，所述的引物B57F的序列如 SEQ ID NO ：1所示，所述的引物B57R1的序列如 SEQ ID NO ：2所示，所述的引物B57R2的序列如 SEQ ID NO ：3所示，所述的检测所有HLA-B*57的引物为引物BF11N和引物BIR57，所述的引物BF11N的序列如 SEQ ID NO ：4所示、所述的引物BIR57的序列如 SEQ ID NO ：5所示, 所述的引物B57F、引物B57R1、引物B57R2、引物BF11N和引物BIR57在PCR反应液中的浓度分别为0.5μM。
2.如权利要求1所述的一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：在所述的PCR反应液中还含有内对照引物，所述的内对照引物为引物HGHF和引物HGHR，所述的引物HGHF的序列如 SEQ ID NO ：6所示、所述的引物HGHR的序列如 SEQ ID NO ：7所示，所述的内对照引物HGHF和HGHR24在PCR反应液中的浓度分别为0.2μM。
3.如权利要求1所述的一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应液中还包括染料，dNTPs和PCR缓冲体系。
4.如权利要求3所述的一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：所述的染料为甲酚红，浓度为0.01% (wt/vol)。
5.如权利要求3所述的一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：所述的PCR缓冲体系为由Tris-HCl 、氯化钾、氯化镁和明胶组成，在所述的缓冲体系中，所述的Tris-HCl 的浓度为10mM，所述的氯化钾的浓度为50mM，所述的氯化镁的浓度为1.5mM，所述的明胶的浓度为0.001% (wt/vol)。
6.如权利要求1所述的一种检测人HLA-B*57:01等位基因的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中还含有Taq酶，所述的Taq酶的最终使用量为0.3单位/微升。
7.用于权利要求1所述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其特征在于：其序列如 SEQ ID NO ：1所示。
8.用于权利要求1所述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其特征在于：其序列如 SEQ ID NO ：2所示。
9.用于权利要求1所述的试剂盒的检测人HLA-B*57:01等位基因的引物，其特征在于：其序列如 SEQ ID NO ：3所示。
10.用于权利要求1所述的试剂盒的检测人所有HLA-B*57等位基因的引物，其特征在于：其序列如 SEQ ID NO ：4所示。
11.用于权利要求1所述的试剂盒的检测人所有HLA-B*57等位基因的引物，其特征在于：其序列如 SEQ ID NO ：5所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130703 |