CN105861673A - 用于hla基因分型的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

用于hla基因分型的引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于HLA基因分型的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及用于HLA基因分型的方法。本发明基于序列特异性HLA基因分型(GSA‑SBT)技术，因此快速，简便、准确、直观。同时，本发明的引物组合均可与商品化试剂盒同步扩增和测序，降低了实验成本。此外，本发明在引物的3’端引入错配碱基的特异性设计，增强了引物扩增的特异性，确保了分型结果的准确性。

Description

用于HLA基因分型的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于HLA基因分型的引物、试剂盒及方法。
背景技术
我国白血病的发病率在十万分之六左右，骨髓移植已经成为唯一的有可能治愈以白血病为首的多种血液病的治疗手段。目前急性淋巴性白血病已成为可以治愈的恶性肿瘤，5年无病生存率(EFS)达70—80％，也是当今疗效最好、治愈率最高的恶性肿瘤之一，在血液病的终极治疗手段中，骨髓移植的重要作用可见一斑。
随着人类基因组学和分子生物学研究的不断深入，骨髓移植的成功与否与供者和受者的白细胞抗原HLA基因型的匹配程度具有明确的对应关系。HLA复合体遗传区位于人类第6号染色体短臂上，全长4000kb，其功能与免疫反应相关。HLA分子递呈抗原肽给T淋巴细胞识别，在适应免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因也是人类极其重要的遗传结构，在器官移植免疫排斥、司法鉴定等领域均有着非常重要的意义。
HLA基因位于人体第6号染色体上，分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，是一群紧密连锁的复等位基因.包括100多个基因座位，已发现9000多个等位基因，全长3600kb，占人类整个基因组的1/3000。HLA是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，在不同种族或同一种族的不同群体中，存在明显的分布差异性。其中，HLA-B、-C位点属Ⅰ类基因，截至2014年7月，国际免疫遗传IMGT/HLA数据库中公布的HLA-B、-C位点的等位基因分别多达3455和2529个。
目前检测HLA基因型的主要方法有PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链反应)、PCR-SSP(序列特异引物引导的聚合酶链反应)和PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应)。其中，PCR-SBT方法是对HLA基因的各个位点分别进行扩增测序，进而确定HLA基因型的高分 辨率方法，它也是HLA基因分型的“金标准”，是目前业内公认的器官移植前和造血干细胞移植前HLA高分辨配型的最佳方法。然而，PCR-SBT方法的检测步骤繁琐，费用昂贵并且周转时间长。同时，由于PCR-SBT方法是对HLA两条等位基因同时测序，加上HLA复杂的多态性，因此经常出现模棱两可的分型结果，这就需要增加测定其他引物才能得到最终唯一正确的分型结果。此外，随着HLA新等位基因不断被发现，HLA基因每个位点上等位基因的数量也逐年增多，产生模棱两可的分型结果的比例也随之不断增高，IMGT/HLA数据库中关于模棱两可等位基因组合的统计数据充分证实了这点，即从单个HLA位点来看，HLA-B和-C位点产生模棱两可的分型结果的比例分别为91.08％和97.69％。因此，目前亟需一种快速、灵敏、重复性强的对HLA基因进行分型的方法，该方法能有效避免分型过程中产生模棱两可的分型结果。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的HLA等位基因数据库，重新设计了HLA基因分型引物以及序列特异性HLA基因分型方法。本发明的方法快速、简便、准确、直观，且实验成本低。
为此，本发明一方面提供了一种用于HLA基因分型的引物组合，其由SEQ ID NO.1-156所示的引物组成。
在本发明优选的实施方案中，该引物组合进一步由第1-5组引物组成，其中第1组由SEQ ID NO.1-24所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.25-52所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.53-78所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.79-130所示的引物组成，第5组由SEQ ID NO.131-156所示的引物组成。
本发明基于最新的HLA等位基因数据库，设计了涵盖HLA I类(A、B、C)和II类(DRB1、DQB1)常见等位基因的引物组合。本发明的引物组合一般2-4条引物为一组，能够高效特异性地扩增该组所有的HLA等位基因，而不会扩增其他组的等位基因。本发明的引物组合不仅基本覆盖了所有常见及部分罕见的HLA等位基因，并且在引物的3’端还引入了错配碱基的特异性设计，从而增强了引物扩增的特异性，确保了分型结果的准确性。本发明设计的具体引物情况分别如表1-表5所示。
表1、本发明检测HLA-A等位基因的引物情况表
PCR目的片段的大小为2kb-3kb。
表2、本发明检测HLA-B等位基因的引物情况表
PCR目的片段的大小为2kb-2.5kb。
表3、本发明检测HLA-C等位基因的引物情况表
PCR目的片段的大小为2kb-3kb。
表4、本发明检测HLA-DRB1等位基因的引物情况表
PCR目的片段的大小为300bp-1.5kb。
表5、本发明检测HLA-DQB1等位基因的引物情况表
PCR目的片段的大小为300bp-2.5kb。
在本发明进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为0.4μM。
本发明另一方面提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒，其包含本发明所述的引物组合。
在本发明优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含用于HLA基因分型的PCR反应液，其中包括dNTPs和PCR缓冲体系。dNTPs浓度优选0.4mM；PCR缓冲体系中，包含浓度为10mM的Tris-HCL，终浓度为2.5mM的Mg2+。本发明的试剂盒中还包含Taq酶，其浓度为5U/μL。
在本发明进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为0.4μM。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备HLA基因分型试剂盒中的应用。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在HLA基因分型中的应用。
本发明最后一方面提供了一种HLA基因分型的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品DNA。
2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。
PCR反应可以在PCR管或96孔板中进行。向反应微孔中加入模板基因组DNA，含有引物的PCR预混合液和Taq酶，加样完成后，将反应混合液混匀，短暂离心，进行PCR反应。
PCR反应条件为：96℃2min；再依次按照以下程序运行35个循环， 95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec；最后72℃10min，降温至15℃，即可进行凝胶电泳检测结果。
3、PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，获得待测样品的HLA基因型别。
在本发明优选的实施方案中，每条引物的浓度均为0.4μM。
在本发明进一步优选的实施方案中，模板样品DNA为20-50ng，Taq酶浓度为5U/μl。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、本发明基于最新的HLA数据库，对同类的不同HLA等位基因进行分组，采用不同的引物设计，能够高效特异性扩增该组所有的HLA等位基因，而不会扩增其他组的等位基因，具有高度的特异性。
2、本发明设计的引物组合基本覆盖了所有常见及部分罕见的HLA等位基因，覆盖面广。
3、本发明在引物的3’端引入了错配碱基的特异性设计，增强了引物扩增的特异性，确保了分型结果的准确性。
4、本发明属于序列特异性SBT(GSA-SBT)，由于使用了特异性引物，因此增强了特异性的结合，防止了非特异性扩增的产生，避免了模棱两可问题的出现，显著提高了分型效率及准确性。
5、本发明的分型方法可以直观地根据PCR扩增后电泳条带的有无，初步判断HLA等位基因的型别。在拥有合格DNA样品的情况下，本发明在3小时内即可完成样本HLA的初步分型，大大缩短了分型时间，
综上所述，本发明提供了一种快速，简便、准确、直观的HLA基因分型方法。此外，本发明的引物组合均可与商品化试剂盒同步扩增和测序，不仅提高了工作效率，而且明显降低了实验成本，对HLA基因分型有着非常重要的意义。
附图说明
图1：HLA-A11电泳谱图。
引物GSA3/GSA4特异性扩增HLA-A11型纯合子，其他等位基因的纯合子没有出现目的条带，说明引物特异性良好。
图2：HLA-A02/11电泳谱图。
图3：HLA-A02/11检测样本扩增产物的测序峰图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：设计用于HLA基因分型的PCR引物
本实施例中，PCR引物设计所需要的全部HLA等位基因来源于IMGT/HLA数据库(Release 3.15.0,2014-01-17)，其具体网址为：http://www.ebi.nc.uk/ipd/imgt/hla/。
引物设计采用人工方法，设计的引物在IMGT/HLA数据库中进行比对分析，确认该组引物能特异性结合该组所有HLA等位基因，而又不会扩增出其他的等位基因。在本发明的分型方法中，关键是将该组引物在PCR缓存体系环境下，仅特异性扩增目标组HLA基因，即该组引物具有“序列特异性”，该分型方法为序列特异性SBT(GSA-SBT)。
此外，本实施例中，在对PCR引物进行设计时，还在下游引物的3’端引入了错配碱基的特异性设计，从而增强了引物扩增的特异性。
按照上述引物设计原则，本发明针对HLA等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1和HLA-DQB1所设计的具体引物情况分别参见表1-表5。
实施例2：制备用于HLA基因分型的试剂盒
委托上海英骏生物技术有限公司合成本发明全部的PCR引物GSA1-GSA156。
将合成的引物，dNTPs，Taq酶缓冲液混合，制备成PCR反应混合液。其中，检测引物的浓度为0.4uM，dNTPs的浓度为0.2mM。Taq酶缓冲液中，Tris-HCL浓度为10mM，氯化镁浓度为2.5mM。
将PCR反应混合液和Taq酶等进行分装后包装，组成本发明试剂盒。
实施例3：对样本中的HLA基因进行分型检测
本发明的试剂盒既可作为PCR-SBT分型结果中出现模棱两可情况的补充和验证，也可对未知DNA样本的HLA基因进行分型检测。
选取4份已知HLA基因型为A02/A11的模棱两可的DNA样品。用本发明设计的HLA-A位点所有的引物分别对样本DNA进行PCR扩增。加样完成后，将反应混合液混匀，短暂离心，进行PCR反应。
PCR反应条件为：94℃5min；再依次按照以下程序运行30个循环，94℃1min，65℃2min，72℃1min；最后72℃10min，降温至15℃，进行凝胶电泳检测。
使用0.5×TBE缓冲液，配置2％琼脂糖凝胶。取3ul PCR产物直接点样到凝胶孔上，150V电泳40mins，然后在紫外光下拍照记录，结果参见说明书附图2。
从附图2可以看出：编号为1和4的样本在采用GSA3/4引物进行PCR扩增时，产生特异性条带；编号为2和3的样本在采用GSA5/6引物进行PCR扩增时，产生特异性现条带，且均与引物设计时预测的目的条带大小一致，而A位点其他引物组合均没有产生特异性条带。由此可以推断，样本1和4的型别为A11，而样本2和3的型别为A02。样本扩增产物的测序峰图参见说明书附图3。

Claims (10)

1.一种用于HLA基因分型的引物组合，其由SEQ ID NO.1-156所示的引物组成。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-5组引物组成，其中第1组由SEQ IDNO.1-24所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.25-52所示的引物组成，第3组由SEQ IDNO.53-78所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.79-130所示的引物组成，第5组由SEQ IDNO.131-156所示的引物组成。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其中每条引物的浓度均为0.4μM。
4.一种用于HLA基因分型的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中每条引物的浓度均为0.4μM。
6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备HLA基因分型试剂盒中的应用。
7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或者权利要求4或5中所述的试剂盒在HLA基因分型中的应用。
8.一种HLA基因分型方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品DNA；
(2)采用权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或采用权利要求4或5中所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，获得待测样品的HLA基因型别。
9.根据权利要求8所述的方法，其中每条引物的浓度均为0.4μM。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中模板样品DNA为20-50ng，Taq酶浓度为5U/μl。
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