CN107022607B - 通过碱基错配解决多重pcr时等位基因扩增不平衡的方法 - Google Patents

通过碱基错配解决多重pcr时等位基因扩增不平衡的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡的方法。该方法是针对由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡的情况的，包括如下步骤：通过对原有多重PCR引物中扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基，来削弱所述扩增效率相对较强的引物与模板的结合能力，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有多重PCR引物为对所述待测等位基因进行多重PCR扩增出现等位基因扩增不平衡情况时所采用的多重PCR引物。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡。

Description

通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡的方法
技术领域
本发明属于基因扩增领域，涉及一种解决等位基因扩增不平衡的方法，具体涉及一种通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡的方法。
背景技术
PCR技术即基于聚合酶链式反应，是一种可以特异放大扩增特定基因片段的技术，可以使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而寡核苷酸引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G(鸟嘌呤)：C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)：T(胸腺嘧啶)/U(尿嘧啶)的Watson-Crick碱基配对原则。
人体内每个细胞内有23对染色体，通常基因为双等位基因。进行普通PCR扩增时，两个等位基因一般情况下没有扩增效率的差异。但在复杂基因时，影响PCR扩增效率的因素会导致两个等位基因的扩增效率存在明显扩增差异，即等位基因扩增不平衡，严重时可出现一个等位基因扩增产量极少(扩增失败)，杂合的等位基因被错误的检测为纯合等位基因。例如HLA基因就是典型的复杂基因，具有高GC含量、高度同源性，高度多态性等特点。目前，HLA基因总数已经超过1万个，这些基因的有效扩增是HLA高分辨分型的重要基础。但以上特点决定了HLA基因的扩增引物设计特别困难以及扩增难度很高，容易出现HLA基因非特异扩增、等位基因丢失或等位基因扩增不平衡等问题，即相应基因扩增效率低或失败(扩增不平衡)使杂合基因位点丢失一个等位基因，分型错误为纯合基因位点。
在多重PCR中，因不同引物之间和相应匹配的模板序列结合时有竞争关系，引物Tm差异大等原因，不同引物结合等位基因模板序列能力存在差异。如果不同引物之间与模板序列结合能力差异较大，则导致不同的等位基因扩增效率相差较大，即等位基因扩增不平衡现象。针对以上出现的等位基因扩增不平衡现象，现有技术一般采用如下策略进行解决：对于多重PCR中不同引物结合等位基因模板序列能力的差异，除了常规的更换引物结合模板位置或调整引物长度(Tm值)等策略去平衡引物与模板序列结合能力的差异，还可以考虑在特异引物5’端引入通用的引物序列，在多重引物扩增基础上，进行通用引物的PCR扩增，平衡不同引物的最终扩增产量。
然而现有的解决方案存在着如下弊端：通用引物多重PCR，在面临高度复杂的基因，例如HLA基因，因有大量的等位基因，只采用常规的多重PCR扩增以及结合通用引物的多重PCR扩增策略，并不能很好的解决等位扩增不平衡问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种解决等位基因扩增不平衡的方法。
本发明所提供的解决等位基因扩增不平衡的方法，是针对由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡的情况的，具体可包括如下步骤：通过对原有多重PCR引物中扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基(即用其它碱基替换引物序列中匹配的碱基，形成碱基错配)，来削弱所述扩增效率相对较强的引物与模板的结合能力，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有多重PCR引物为：对待测等位基因进行多重PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的多重PCR引物。
所述方法中，对所述扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基具体可为在所述扩增效率相对较强的引物序列的5’端或/和中段引入错配碱基。
所述5’端可认为是将所述引物序列按照碱基数的多少自5’末端到3’末端进行三等分后，位于5’端的1/3。所述中段可认为是将所述引物序列按照碱基数的多少自5’末端到3’末端进行三等分后，位于中间的1/3。
其中，对所述扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基时，所引入的错配碱基的个数可为1个，也可为多个，如2-5个。当所引入的错配碱基的个数为多个时，多个错配的碱基既可为连续存在，也可为间断存在。
所述方法中，对所述扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基，是为了调整对所述待测等位基因进行多重PCR扩增时该引物与模板的结合能力，实现减少或消除与其它多重引物扩增效率的差异。
在对所述扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基时，具体可参照如下原则进行：
(1)所引入的错配碱基的个数越多和/或越靠近引物3’末端，引物与模板的结合能力变得越弱；
(2)一般而言，碱基错配形式中T/G、A/G错配稳定性最高，A/C、C/C错配稳定性最低，其它错配形式稳定性介于中间。引入人工错配碱基时，可以参考错配稳定性去选择错配形式。
在所述方法中，所述待测等位基因可为任意基因，特别是高度复杂的基因，例如HLA基因，具体如HLA-DRB1基因。
在本发明的一个实施例中，所述待测等位基因具体为基因型分别为DRB1*01:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00664)和DRB1*15:01:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00865)的HLA-DRB1基因。
相应的，所述原有多重PCR引物中用于扩增基因型为DRB1*01:01:01的HLA-DRB1基因的引物对由上游引物A1和下游引物B组成，用于扩增基因型为DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因的引物对由上游引物A5和所述下游引物B组成；
上游引物A1：5’-CACAGCACGTTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT-3’(序列1)；
上游引物A5：5’-CACAGCACGTTTCCTGTGGCAG-3’(序列2)；
下游引物B：5’-GCTCACCTCGCCGCTGCAC-3’(序列3)。
在所述原有多重PCR引物中，所述扩增效率相对较强的引物为用于扩增所述基因型为DRB1*01:01:01的HLA-DRB1基因的引物；所述方法中，将所述上游引物A1自5’末端起的5个碱基由“CACAG”替换为“AGACA”，其余碱基序列保持不变，从而解决了所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因扩增不平衡的问题。
进一步，在引入错配碱基后，对所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，反应体系中所述上游引物A1、所述上游引物A5和所述下游引物B的摩尔浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.3μM。
更加具体的，在引入错配碱基后，对所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，反应程序如下：96℃3min；96℃25s，66℃50s，72℃1min30s，10个循环；96℃25s，64℃50s，72℃1min30s，24个循环；72℃5min；12℃保存。
本发明针对由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡的情况，提供了通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡的方法。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡。
附图说明
图1为DRB1*01:01:01/DRB1*15:01:01:01基因型样品在向引物序列引入错配碱基前后的测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡
本发明研究发现，调节多重PCR引物间扩增效率平衡，可以考虑多重扩增体系中一些引物序列引入人为突变，即用其它碱基替换引物序列中匹配的碱基，形成碱基错配。碱基不匹配时使双螺旋骨架扭曲失去稳定性而解旋，结构稳定性下降，这就降低了杂交双链的结合力。因DNA聚合酶延伸机制，在引物的3’端引入突变对扩增效率影响最大，可优先考虑在引物中段及5’端引入突变碱基，调整相应引物的扩增效率；另外，一般而言，碱基错配形式中T/G、A/G错配稳定性最高，A/C、C/C错配稳定性最低，其它错配形式稳定性介于中间。引入人工错配碱基时，可以参考错配稳定性去选择错配形式。
下面以具体实例对这种通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡问题的方法进行阐述。
一、HLA-DRB1多重PCR扩增平衡性问题的解决
将HLA-DRB1基因分为6大组(合计1285个等位基因，包括DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01)，但每个组内一些等位基因的5'端、3'区域仍存在一定的差异。根据HLA-DRB1基因外显子2的5'端及与内含子1的交界处的多态性，分组设计相应的6条上游引物和1条下游引物。使用常规的多重PCR扩增以及结合通用引物的多重PCR扩增策略后，仍有一些等位基因出现扩增不平衡现象。
为使这6大组基因型以及组内等位基因都能有效平衡扩增，避免多重引物间竞争等多种因素所致的扩增不平衡，在常规方法及通用引物的多重PCR扩增基础上，通过在特异性引物5’端引入碱基错配的引物设计(调节引物与基因序列的结合能力)，实现了等位基因有效扩增与扩增平衡，同时又保证了扩增的特异性。
以下将具体阐述该多重PCR扩增中是如何通过碱基错配解决基因型分别为DRB1*01:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00664)和DRB1*15:01:01:01(IMGT/HLA Acc No:HLA00865)的HLA-DRB1基因扩增不平衡的问题的。
1、原有多重PCR引物及反应体系和反应程序
(1)原有多重PCR引物
六条上游引物和一条共用的下游引物，分别记为上游引物A1、A2、A3、A4、A5、A6和下游引物B。其中所述上游引物A1和所述下游引物B用于扩增基因型为DRB1*01:01:01的HLA-DRB1基因，所述上游引物A5和所述下游引物B用于扩增基因型为DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因；其余上游引物与所述下游引物B的组合用于扩增其他基因型的HLA-DRB1基因。
上游引物A1：5’-CACAGCACGTTTCTTGTGGCAGCTTAAGTT-3’(序列1)；
上游引物A5：5’-CACAGCACGTTTCCTGTGGCAG-3’(序列2)；
下游引物B：5’-GCTCACCTCGCCGCTGCAC-3’(序列3)。
上游引物A2：5’-AGACACACGTTTCTTGGAGCAGGTTAAAC-3’；
上游引物A3：5’-ACCAGCACGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTT-3’；
上游引物A4：5’-AACAGCACGTTTCTTGGAGGAGGT-3’；
上游引物A6：5’-CACAGCACGTTTCTTGGAGTACTCTA-3’。
(2)多重PCR反应体系：
(3)多重PCR反应程序：
96℃3min；96℃25s，66℃50s，72℃1min30s，10个循环；96℃25s，64℃50s，72℃1min30s，24个循环；72℃5min；12℃保存。
结果显示：采用如上原有多重PCR引物及反应体系和反应程序对基因型为DRB1*01:01:01/DRB1*15:01:01:01杂合型的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，会产生等位基因扩增不平衡的情况，DRB1*01:01:01/DRB1*15:01:01:01组合中DRB1*15:01:01:01峰较低，表明DRB1*15:01:01:01基因型扩增效率明显低于DRB1*01:01:01。如图1中“普通策略”所示。
2、引入错配碱基后的多重PCR引物及反应体系和反应程序
(1)引入错配碱基后的多重PCR引物
根据步骤1的结果，可知DRB1*15:01:01:01基因扩增效率明显低于DRB1*01:01:01基因，因此需要人为降低多重PCR反应体系中DRB1*01:01:01基因型的扩增效率，以平衡这两个等位基因的扩增效率。
具体是将用于扩增DRB1*01:01:0基因型的原引物特异性序列(即上游引物A)中位于5’端的5个碱基替换(具体如下所示)，从而降低引物与DRB1*01:01:01基因的结合能力，即降低多重PCR反应体系中DRB1*01:01:01基因的扩增效率。其余引物与步骤1一致，保持不变。
(2)多重PCR反应体系：同步骤1(2)。
(3)多重PCR反应程序：同步骤1(3)。
结果显示：采用如上引入错配碱基后的多重PCR引物及反应体系和反应程序对基因型为DRB1*01:01:01/DRB1*15:01:01:01杂合型的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01两等位基因峰型均明显，扩增效率接近。如图1中“新策略”所示。
<110> 北京博奥晶典生物技术有限公司；成都博奥晶芯生物科技有限公司
<120> 通过碱基错配解决多重PCR时等位基因扩增不平衡的方法
<130> GNCLN170604
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cacagcacgt ttcttgtggc agcttaagtt 30
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
cacagcacgt ttcctgtggc ag 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gctcacctcg ccgctgcac 19

Claims (3)

1.一种解决由于多重PCR而导致的等位基因扩增不平衡的方法，包括如下步骤：通过对原有多重PCR引物中扩增效率相对较强的引物序列人为引入错配碱基，来削弱所述扩增效率相对较强的引物与模板的结合能力，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有多重PCR引物为：对待测等位基因进行多重PCR扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的多重PCR引物；
所述待测等位基因为基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因；
所述原有多重PCR引物中用于扩增基因型为DRB1*01:01:01的HLA-DRB1基因的引物对由上游引物A1和下游引物B组成，用于扩增基因型为DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因的引物对由上游引物A5和所述下游引物B组成；所述上游引物A1的序列如序列表中序列1所示；所述上游引物A5的序列如序列表中序列2所示；所述下游引物B的序列如序列表中序列3所示；
所述扩增效率相对较强的引物为用于扩增所述基因型为DRB1*01:01:01的HLA-DRB1基因的引物；所述方法中，将所述上游引物A1自5’末端起的5个碱基由“CACAG”替换为“AGACA”，其余碱基序列保持不变，从而解决了所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因扩增不平衡的问题。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在引入错配碱基后，对所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，反应体系中所述上游引物A1、所述上游引物A5和所述下游引物B的摩尔浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.3μM。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在引入错配碱基后，对所述基因型分别为DRB1*01:01:01和DRB1*15:01:01:01的HLA-DRB1基因进行多重PCR扩增时，反应程序如下：96℃ 3min；96℃ 25s，66℃ 50s，72℃ 1min30s，10个循环；96℃ 25s，64℃ 50s，72℃1min30s，24个循环；72℃ 5min；12℃ 保存。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656158A (zh) * 2019-09-20 2020-01-07 北京金马晟和科技有限公司 一种提高pcr扩增效率的引物设计方法及应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896284A (zh) * 2006-06-30 2007-01-17 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
CN101182585A (zh) * 2007-12-12 2008-05-21 博奥生物有限公司 一种鉴别hbv基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒
CN102312001A (zh) * 2011-09-14 2012-01-11 四川大学 多重pcr-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法
CN103045591A (zh) * 2013-01-05 2013-04-17 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 Hla基因特异性pcr扩增引物及hla分型的方法和试剂盒
CN103320514A (zh) * 2013-06-27 2013-09-25 无锡中德美联生物技术有限公司 一种检测邻近snp的多重pcr方法
CN104004823A (zh) * 2013-02-27 2014-08-27 上海透景生命科技有限公司 一种单核苷酸多态性熔解曲线分析方法
CN104694645A (zh) * 2015-03-04 2015-06-10 郭涛 一种水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i及基因分型方法
CN105861673A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 用于hla基因分型的引物、试剂盒及方法
CN107208145A (zh) * 2014-12-30 2017-09-26 端粒诊断公司 多重定量pcr

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004033649A2 (en) * 2002-10-07 2004-04-22 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey High throughput multiplex dna sequence amplifications
EP2376659B1 (en) * 2008-12-17 2015-12-02 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1896284A (zh) * 2006-06-30 2007-01-17 博奥生物有限公司 一种鉴别等位基因类型的方法
CN101182585A (zh) * 2007-12-12 2008-05-21 博奥生物有限公司 一种鉴别hbv基因突变类型的方法及其专用芯片与试剂盒
CN102312001A (zh) * 2011-09-14 2012-01-11 四川大学 多重pcr-反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性的方法
CN103045591A (zh) * 2013-01-05 2013-04-17 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 Hla基因特异性pcr扩增引物及hla分型的方法和试剂盒
CN104004823A (zh) * 2013-02-27 2014-08-27 上海透景生命科技有限公司 一种单核苷酸多态性熔解曲线分析方法
CN103320514A (zh) * 2013-06-27 2013-09-25 无锡中德美联生物技术有限公司 一种检测邻近snp的多重pcr方法
CN107208145A (zh) * 2014-12-30 2017-09-26 端粒诊断公司 多重定量pcr
CN104694645A (zh) * 2015-03-04 2015-06-10 郭涛 一种水稻S5基因的功能性标记S5-n-j-i及基因分型方法
CN105861673A (zh) * 2016-04-27 2016-08-17 上海荻硕贝肯生物科技有限公司 用于hla基因分型的引物、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多重PCR反应的影响因素及其优化;刘志杰等;《黑龙江畜牧兽医》;20110731(第7期);第26-28页
多重PCR检测冷却肉中的3种致病菌;王艳君等;《食品与发酵工业》;20071231;第33卷(第3期);第111-114页

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