CN110656158A - 一种提高pcr扩增效率的引物设计方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用，所述引物设计方法包括以下步骤：在待测基因的一侧设计两条或两条以上的同向扩增的引物，或在待测基因的两侧分别设计两条或两条以上的同向扩增的引物，其中，位于待测基因同一侧的两条或两条以上的同向扩增的引物，其3’端部分重叠或者不重叠，其5’端完全重叠、部分重叠或不重叠。利用本发明方法设计的引物，能够事先预防和避免引物和待检模板的结合区存在碱基突变时导致PCR效率急剧下降乃至失败，解决因上述突变而导致的等位基因缺失和扩增不平衡问题，提高PCR成功率。此外，利用本发明方法可以直接应用公开序列来设计引物，大大降低了引物设计难度。

Description

一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用。
背景技术
PCR技术即聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)，是一种可以通过扩增特异放大特定基因片段的技术，使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而寡核苷酸引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G(鸟嘌呤)：C(胞嘧啶)、A(腺嘌呤)：T(胸腺嘧啶)/U(尿嘧啶)的Watson-Crick碱基配对原则。
引物的作用在于通过在扩增程序的复性阶段与模板特异结合，在核酸聚合酶参与下延伸合成与模板碱基互补的产物。理论上，依据包含待测基因的一段公开核酸序列，遵循一定的原则如长度、退火温度、GC含量等就很容易设计出引物。然而，由于依据的DNA序列来源于有限的基因组测序数据，并不能完全保证这段公开核酸序列不存在个别碱基错误；另一方面，由于核酸序列碱基存在变异的现象(如SNP)，如果上述的错误碱基和变异恰好位于模板上与引物结合区域，尤其是引物的3’端，就会引起引物与模板结合区域发生碱基错配，使核苷酸间结合能力下降，引物与模板结合的DNA双链结构不稳定，就会使PCR扩增效率低下或扩增失败，造成等位基因缺失或等位基因扩增不平衡，在定量PCR上就表现为待检基因拷贝数低(假阴性)的结果。因此设计出序列匹配的引物成为PCR的关键因素。
现有技术的解决方法，一是依据现有的研究资料，重新选择相对保守的核酸序列来设计引物，二是不改换引物设计区域，根据测序已经确定的碱基突变设计兼并引物，即包含突变碱基的引物。
然而现有的解决方案是一种被动的、事后处理的方法，存在着如下弊端：如前所述，无论是重新选择相对保守的序列(避开可能的核酸序列高变区)，还是使用兼并引物，这两种方法仍然是依据已知的核酸序列突变来设计引物。重新设计匹配的PCR引物，在面临高度复杂的基因，而且还有很多新的多态性(突变)位点没发现时，如果采用发现一次引物与模板序列不匹配，就重新设计引物的策略，很快就会面临需要设计大量引物，引起引物设计极其困难的情况。
上述两种引物设计都不可避免地会遇到以前未知的序列变异，而当此核酸变异位于所选的相对保守区域，或是兼并引物区尤其是3’端附近，一样会导致PCR效率降低，造成等位基因缺失和等位基因扩增不平衡，在定量PCR上就表现为待检基因拷贝数低(假阴性)的结果。
因此，提供一种能够克服碱基突变时导致PCR效率急剧下降乃至失败的方法，成为人们亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用，能够有效解决遇到碱基突变时PCR效率急剧下降乃至失败的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种提高PCR扩增效率的引物设计方法，所述引物设计方法包括以下步骤：在待测基因的一侧设计两条或两条以上的同向扩增的引物，或在待测基因的两侧分别设计两条或两条以上的同向扩增的引物，其中，位于待测基因同侧的两条或两条以上的同向扩增的引物，其3’端部分重叠或不重叠，其5’端完全重叠、部分重叠或不重叠。
进一步的，位于待测基因同一侧的所述引物的3’端不重叠区域长度为1个碱基以上。
根据本发明的第二方面，提供一种提高PCR扩增效率的引物,所述引物采用所述引物设计方法设计得到。
根据本发明的第三方面，提供一种提高PCR扩增效率的引物在制备用于提高PCR扩增效率的产品中的应用。
进一步的，所述产品包括试剂或试剂盒，但不限于此。
根据本发明的第四方面，提供一种试剂，包括所述提高PCR扩增效率的引物。
根据本发明的第五方面，提供一种试剂盒，包括所述提高PCR扩增效率的引物或所述的试剂。
根据本发明的第六方面，提供一种提高PCR扩增效率的引物或所述试剂或所述试剂盒在核酸检测领域中的应用，如：荧光定量PCR、法庭科学个体识别、亲缘关系鉴定。本发明的保护范围不限于此，各种需要应用PCR的领域均包含在本申请的设计要点内。
根据本发明的第七方面，提供一种避免人类STR基因座Penta E等位基因缺失或等位基因扩增不平衡的方法，包括以下步骤：
步骤一、提取样本DNA，设计第一引物对和第二引物对，备用；
步骤二、用第一引物对进行PCR反应，之后进行结果分析，若存在等位基因缺失或等位基因扩增不平衡，则同时用第一引物对和第二引物对进行PCR反应。
进一步的，所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
本发明的有益效果体现在：本发明提供一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用，利用本发明方法设计的引物，能够事先预防和避免引物和待测模板的结合区存在碱基突变时导致PCR效率急剧下降乃至失败，解决因上述突变而导致的等位基因缺失和扩增不平衡问题，提高PCR成功率。此外，利用本发明方法可以直接应用公开序列来设计引物，而不用过多考虑该序列是否相对保守，是否可能存在碱基变异，大大降低了引物设计难度。与目前的引物设计方法相比，具有预见性、主动性。通过采用本申请引物设计方法设计的引物，可广泛用于各类PCR反应，包括多重PCR，具体应用方面如核酸检测领域、荧光定量PCR、法庭科学个体识别、亲缘关系鉴定等，为人们生活提供极大方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1a为引物与模板完全匹配而正常延伸扩增的示意图；
图1b为引物与模板不匹配、无法正常扩增的示意图；
图2a为模板、下游引物以及两条上游引物的示意图；
图2b为引物区无突变，上游两条引物都延伸的示意图；
图2c为突变发生在上游引物1的3’端，上游引物1不延伸，上游引物2延伸的示意图；
图2d为突变发生在上游引物2的3’端，上游引物1延伸，上游引物2不延伸的示意图；
图3为实施例1中采用第一引物对的示意图；
图4为实施例1同时采用第一引物对和第二引物对的示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
为便于理解本申请的技术方案，申请人认为有必要阐述以下内容：
目前STR(短串联重复序列)复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段,多个STR基因座复合扩增身份鉴定试剂盒，引物序列设计的原则是尽量避开SNP位点，或者是尽量避免SNP位点出现在靠近引物的3’末端，因为3’末端的碱基不匹配会严重降低PCR的扩增成功率，造成位点片段信号降低甚至缺失，从而引起分型错误。由于人类基因组序列中还存在广泛单核苷酸多态性(SNP)，有报道在人类编码区平均220-350bp出现1个SNP，而在人类全基因组中平均1000bp则出现一个SNP，虽然有些SNP位点发生率比较稀少但仍然可能存在。引物序列设计不可避免会遇到SNP位点。所以，即使选择相对保守序列设计引物，以及设计兼并引物，仍然会遇到一些样本，出现引物模板结合区存在变异，导致等位基因丢失的情况。
本发明引物设计的工作原理是：如果待检样本的引物与模板结合区没有变异，则同侧的两条或两条以上的引物都能发挥作用，都能引发PCR反应，如图2b所示；如果待检样本的引物与模板结合区尤其是3’端附近存在变异，与其中一条引物不匹配导致此条引物不能发挥作用，但如果同侧的另外的一条引物避开了此处变异(不含此变异碱基)，则此条引物将完全不受影响而成功引发PCR反应，如图2d所示；如果同侧的另外的引物也含有此变异碱基，则其3’端距离此处变异碱基会较远，因而所受影响较小，依然可以成功进行PCR反应，避免PCR反应失败，如图2c所示。
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
采用本发明引物于检测引物模板结合区存在碱基变异的样本。
本实施例中以常用的法医个体识别和亲子鉴定中经常用的人类STR基因座PentaE为例，来说明本发明的引物设计方法。
本实施例中所用的引物序列如下表：
SEQ ID NO.1 5’-HEX-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTAC-3’
SEQ ID NO.2 5’-AGAAAATTGTGGACAGGTGCG-3’
SEQ ID NO.3 5’-HEX-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTC-3’
SEQ ID NO.4 5’-AGAAAATTGTGGACAGGTGCGGTGATTCAC-3’
第一引物对的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
实验过程如下：
步骤一、以常规方法提取亲子鉴定样本的DNA。
步骤二、用第一引物对进行PCR扩增，以及第一引物对和第二引物同时进行PCR扩增，上述引物在PCR反应中的终浓度分别为0.2μM，PCR反应体系中还分别含10mM的Tris(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2，以及Tween20(吐温20)、BSA(牛血清白蛋白)等，DNA模板加入0.5ng。
以如下程序进行PCR反应：95℃11min；94℃10sec，59℃1min，62℃1min，29cycles；60℃20min。
PCR产物在3130xl Genetic Analzyer基因测序分析仪上检测，所得数据用GeneMapperIDX软件分析。
在亲子鉴定样本中，当仅使用第一引物对时，Penta E位点分型为11(孩子)、11/15(父亲)、15(母亲)，分析结果表明，PCR存在等位基因丢失，实验结果如图3所示。
当使用第一引物对和第二引物对时，上述孩子和母亲样本的结果均为5/11，PentaE的等位基因5成功扩增，实验结果如图4所示。
上述实验结果表明：在待测基因的一侧设计两条以上的引物，或在待测基因的两侧分别设计两条以上的引物，且位于待测基因同侧的相邻引物的3’端部分重叠时，能有效克服因碱基突变导致的扩增失败而使等位基因丢失。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Figure BDA0002209296690000091
序列表
<110> 北京金马晟和科技有限公司
<120> 一种提高PCR扩增效率的引物设计方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggttatta attgagaaaa ctccttac 28
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaaaattgt ggacaggtgc g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggttatta attgagaaaa ctc 23
<210> 4
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaaaattgt ggacaggtgc ggtgattcac 30

Claims (10)

1.一种提高PCR扩增效率的引物设计方法，其特征在于，所述引物设计方法包括以下步骤：在待测基因的一侧设计两条或两条以上的同向扩增的引物，或在待测基因的两侧分别设计两条或两条以上的同向扩增的引物，其中，位于待测基因同侧的两条或两条以上的同向扩增的引物，其3’端部分重叠或不重叠，其5’端完全重叠、部分重叠或不重叠。
2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于：位于待测基因同侧的所述引物的3’端不重叠区域长度为1个碱基以上。
3.一种提高PCR扩增效率的引物，其特征在于：所述引物采用权利要求1或2所述引物设计方法设计得到。
4.一种如权利要求3所述的引物在制备用于提高PCR扩增效率的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品包括试剂或试剂盒。
6.一种试剂，其特征在于：包括权利要求3所述的引物。
7.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求3所述的引物或权利要求6所述的试剂。
8.一种如权利要求3所述引物或权利要求6所述的试剂或权利要求7所述的试剂盒在核酸检测领域中的应用。
9.一种避免人类STR基因座Penta E等位基因缺失或等位基因扩增不平衡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、提取样本DNA，设计第一引物对和第二引物对，备用；
步骤二、用第一引物对进行PCR反应，之后进行结果分析，若存在等位基因缺失或等位基因扩增不平衡，则同时用第一引物对和第二引物对进行PCR反应。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
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