KR100844010B1 - 다중 유전자 동시 증폭방법 - Google Patents

다중 유전자 동시 증폭방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주형과 결합할 때, 중간에 고리를 형성하도록 설계된 프라이머를 이용하여 다수의 주형유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 다중 유전자 동시 증폭방법에 관한 것이다. 본 발명의 다중 유전자 동시 증폭방법은 하나 이상의 목적 유전자로부터 증폭하고자 하는 부위를 각각 선택하는 단계; 전기 각각 선택된 부위의 5'말단 및 3'말단의 각각의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열의 중앙부에 위치한 2 내지 4bp의 염기서열이 5 내지 8bp의 dNTP 염기서열로 치환된 각각의 센스 및 안티센스프라이머를 제작하는 단계; 전기 각각의 목적 유전자를 주형으로 사용하고, 전기 제작된 각각의센스프라이머 및 각각의 안티센스프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및, 전기 중합효소연쇄반응에 의하여 수득한 증폭산물을 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용하면, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응만으로 증폭시킬 수 있으므로, 유전자 관련 분야의 연구개발의 진보에 이바지할 수 있을 것이다.
중합효소연쇄반응, 다중 유전자 동시 증폭방법, SBS 프라이머

Description

다중 유전자 동시 증폭방법{Method for Simultaneous Amplification of Multi-gene}
도 1은 다중 유전자 동시 증폭방법에 이용되는 프라이머의 구조적인 특징을 나타낸 그림이다.
도 2는 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용하여 증폭된 백혈병 특이적인 융합유전자의 전기영동사진이다.
도 3은 어닐링 온도를 변화시킨 조건에서, 정상 프라이머와 SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
본 발명은 다중 유전자 동시 증폭방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 주형과 결합할 때, 중간에 고리를 형성하도록 설계된 프라이머를 이용하여 다수의 주형유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 다중 유전자 동시 증폭방법에 관한 것이다.
현재 연구자들이 유전자 시료를 수득하기 위하여 가장 보편적으로 사용하는 방법은 DNA 중합효소를 이용한 중합효소연쇄반응 방법이다. 상기 방법은 주형 DNA와 결합할 수 있는 프라이머의 길이와 염기서열을 임의로 조절해서 설계함으로써 목적하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 한번의 반응으로 하나의 관심유전자만을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 관심유전자의 개수가 많을 경우엔 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 한다는 단점이 있다.
이러한 단점을 해결하기 위하여, 2종류 이상의 주형 유전자와 각각의주형 유전자에 해당하는 프라이머들을 하나로 혼합하여, 중합연쇄반응을 수행하는 이른바 다중 중합효소연쇄반응 방법을 개발하려는 노력이 활발히 진행되었고, 일부에서는 성공적인 결과가 보고되고 있다(참조: Hum. Mol. Genet., 2:153?158, 1993; Nucleic Acids Res., 25(16): 3235?3241, 1997; Hum. Mol. Genet., 2(2):143?151, 1993; Clin. Microbiol. Rev., 13(4):559?570, 2000; Clinical Microbiology Reviews, 13(4):559-570, 2000). 그러나, 성공적으로 한번에 증폭시킬 수 있는 유전자의 수가 3 내지 4개에 불과하고, 각 유전자들의 프라이머들 서로간의 경쟁이나 간섭 효과, 그리고 빈번하게 발생하는 비특이적인 산물이 증폭되는 등이 단점이 개선되지 않고 있어, 실질적으로는 사용되지 못하고 있는 실정이다.
또한, 다중 중합효소연쇄반응을 수행하기 위하여는, 목적하는 주형 유전자의 조건을 최적화하여야만 하는데, 이를 위하여 많은 시간과 노력, 그리고 샘플 소모 를 감수해야만 하고, 이처럼 최적화된 조건은 다른 유전자에 적용되지 않기 때문에, 이를 극복하기 위하여, 링커 중합효소연쇄반응(Linker PCR)이나 라이게이션을 통한 중합효소연쇄반응(Ligation Mediated PCR)(참조: Journal of Clinical Microbiology, 43(11):5622-5627, 2005) 등의 방법들이 개발되었다
그러나, 링커 중합효소연쇄반응의 경우 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행하는 실험상의 특성상 발생할 수 있는 서로 다른 샘플들간의 오염이 심각한 문제이며, 라이게이션 중합효소연쇄반응의 경우에는 여러 종류의 효소를 이용한 복잡한 실험방법이 연구자들의 어려움을 야기시켜 일부에서만 이러한 실험기법을 이용하고 있다.
따라서, 한번의 중합효소연쇄반응만으로 다수의 유전자를 증폭시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 한번의 중합효소연쇄반응만으로 다수의 유전자를 증폭시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 증폭하고자 하는 유전자의 염기서열의 프라이머 제작 시, 돌출부(burge)를 형성하도록 가운데 2 내지 4bp의 염기서열을 5 내지 8bp의 dNTP로 대체하고, 3'말단 내지 5'말단의 2 부분의 상보적인 염기서열 부위가 증폭하고자 하는 유전자와 결합하는 형태의(specific bulge specific, SBS) 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 이용할 경우, 한번의 중 합효소연쇄반응으로 서로 다른 많은 유전자를 신속하고 정확하게 동시에 증폭시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 가운데 부분에 돌출부(bulge)가 형성된 프라이머를 이용하여 한번의 중합효소연쇄반응만으로 모든 샘플에서의 존재 가능한 융합유전자를 증폭할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 한번의 중합효소연쇄반응 만으로 다수의 유전자를 증폭시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 주형으로 사용되는 각각의 유전자와 이에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머가 각각 특이적으로 결합할 수 있다면, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있을 것이라는 점에 주목하고, 주형 유전자에 대한 프라이머의 특이적인 선택성을 향상시키고자 하였다.
그 결과, 주형 유전자와 혼성화될 경우 중앙에 돌출부(bulge)를 형성할 수 있도록 고안된 특이적 프라이머를 사용할 경우, 주형 유전자에 대한 프라이머의 특이적인 선택성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다(참조: 도 1). 도 1은 다중 유전자 동시 증폭방법에 이용되는 프라이머의 구조적인 특징을 나타낸 그림이다. 도 1에서 보듯이, 증폭하고자 하는 유전자의 염기서열의 프라이머 제작 시 가운데 2 내지 4bp의 염기서열을 주형의 염기서열과 상보적으로 결합하지 않아, 중합효소연쇄반응시 주형 유전자와 혼성화될 경우 중앙에 돌출부(bulge)를 형성할 수 있도록 5 내지 8bp의 dATP(또는 다른 원하는 데옥시 올리고뉴클레오티드)로 대체하고, 3'말단 및 5'말단부분의 염기서열은 증폭하고자 하는 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 형태의(specific bulge specific, SBS) 염기서열로 구성된 프라이머(이하, 'SBS 프라이머'라 함)를 작제하였다. 이처럼 작제된 SBS 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하면 어닐링 온도가 변화되더라도 정상적으로 주형 유전자가 증폭됨에 반하여, 어닐리 온도가 변화되는 조건에서 돌출부를 형성하지 않는 정상 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하면 어닐링 온도가 증가할 수록 증폭율이 저하되고 정상적으로 주형 유전자가 증폭되지 않음을 확인하였다(참조: 도 3). 따라서, 본 발명의 SBS 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하면, 주형 유전자에 대한 프라이머의 특이적인 선택성이 향상되어, 다수의 주형 유전자와 이에 상응하는 각각의 프라이머를 혼합하여 한번의 중합효소연쇄반응을 수행할 경우에도, 각각의 주형 유전자가 정상적으로 증폭될 수 있음을 확인하고, 이처럼 SBS 프라이머를 사용하여, 다수의 주형 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있는 방법을 “TotalPlex”라 명명하였다.
결국, 본 발명의 다중 유전자 동시 증폭방법은 (i) 2 내지 30개의 목적 유전자로부터 증폭하고자 하는 부위를 각각 선택하는 단계; (ii) 전기 각각 선택된 부위의 5'말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열의 중앙부에 위치한 2 내지 4bp의 염기서열이 5 내지 8bp의 dNTP 염기서열로 치환된, 2 내지 30개의 센스프라이머를 작제하는 단계; (iii) 전기 각각 선택된 부위의 3'말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열의 중앙부에 위치한 2 내지 4bp의 염기서열이 5 내지 8bp의 dNTP 염기서열로 치환된, 2 내지 30개의 안티센스프라이머를 작제하는 단계; (iv) 전기 2 내지 30개의 목적 유전자와, 전기 목적유전자에 각각 상응하는 전기 작제된 2 내지 30개의 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 모두 혼합하고, 전기 혼합물을 이용하여 한번의 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및, (v) 전기 중합효소연쇄반응에 의하여 수득한 증폭산물을 확인하는 단계를 포함한다.
이때, 중합효소연쇄반응시 온도 및 시간조건은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 수득한 증폭산물의 확인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 비드어레이나 마이크로어레이를 이용한 교잡반응 방법으로 수행함이 바람직하다.
본 발명의 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용하면, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응만으로 증폭시킬 수 있으므로, 유전자 관련 분야의 연구개발의 진보에 이바지할 수 있을 것이다.
이하, 백혈병 특이 융합유전자의 발현 유무를 확인하는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 백혈병 특이 유전자의 증폭
44명의 백혈병의 발명이 의심되는 환자로부터 혈액을 수득하였다. 전기 각 혈액에서 림프구를 피콜(Ficoll-Hypaque)을 이용한 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)방법으로 분리하고, 분리된 림프구에서 RNAsol용액(PnE RNAsol, YeBT, INC.)을 이용하여 각각의 총 RNA를 수득하였다. 전기 수득한 총 RNA 2㎍과 100μM 랜덤 프라이머(random 9mer primer) 1㎕를 혼합하고, 70℃에서 5분간 가열한 다음, 4℃에서 5분간 냉각시켰다. 이어, 100units 역전사효소(M-MLV Reverse Transcriptase, Promega, USA), 20units 수퍼라제(SUPERase·InTM, Ambion, USA, 1.25mM dNTP(Takara, USA) 및 5X 합성완충용액을 가하고, 증류수를 가하여 총 20㎕로 적정한 다음, 38℃에서 2시간, 95℃에서 5분 및 4℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 1N NaOH를 7㎕ 첨가하고 70℃에서 10분간 가열시켜 반응을 종료시키고, 10㎕의 1M Tris-HCl 완충용액을 첨가하여, 환자시료당 각각 10종류의 cDNA를 합성하였다.
이어, 전기 합성한 10종류의 cDNA 2㎕, 10X 중합효소연쇄반응 완충용액(750mM Tris-HCl(pH 9.0), 20mM MgCl2, 500 mM KCl, 200mM (NH4)2SO4,) 2㎕, 2.5mM dNTP 혼합물(2.5mM dATP, 2.5mM dGTP, 2.5mM dTTP, 2.5mM dCTP) 2㎕, Taq 중합효소(Biotools, Spain) 2.0unit 및 서열번호 1 내지 21의 염기서열을 갖는 SBS 프라이머 혼합물(0.5μM) 1㎕를 혼합하고, 3차 증류수를 가하여 20㎕로 적정한 다음, 중합효소연쇄반응을 수행하여(94℃에서 5분, 94℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초, 35사이클), 증폭산물을 수득하였다. 이때, 사용된 각각의 SBS 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
SBS 센스 프라이머
abl-F: 5'- GGCGCaaaaaaTGTTG aaaaaa GATCTGCCTGAAG-3' (서열번호 1)
bcr13/14-F: 5'- GTGGAGCTGCAGAT aaaaaa TGACCAACTCGTGT-3' (서열번호 2)
aml1-F: 5'- CTCAGGTTTGTCGG aaaaaa GAAGTGGAAGAGG-3' (서열번호 3)
bcr1-F: 5'- GCTCTCCCTCGCAG aaaaaa CTCGCAACAGTCC-3' (서열번호 4)
bcr19-F: 5'- GTGCGTGGAGGAGA aaaaaa GAGCGCCGAGGC-3' (서열번호 5)
rara-F: 5'- GGTACCCGGTGCCT aaaaaa CTACGCCTTCTTCT-3' (서열번호 6)
pmla1-F: 5'- CATCAAGATGGAGT aaaaaa GAGGAGGGGAAGG-3' (서열번호 7)
pmlb1-F: 5'- AGGAGGAGCCCCG aaaaaa CCTGCAAGCTGC-3' (서열번호 8)
plzf-F: 5'- TGCAGCGTGTGTGG aaaaaa TCGAGCTTCCTGAT-3' (서열번호 9)
numa-F: 5'- AGGCTAGCCTGCGA aaaaaa CACCTCCTCTACTC-3' (서열번호 10)
cbfb-F: 5'- ACAACAGGCCTTTG aaaaaa GAGGCTCGGAGAA-3' (서열번호 11)
SBS 안티 센스프라이머
abl-R: 5'-TGGAGTTCCAACGA aaaaaa GGCTTCACTCAGAC-3' (서열번호 12)
bcr13/14-R: 5'-CAGTTTGGCTCAGC aaaaaa TGTCCCTGTAGACG-3' (서열번호 13)
aml1-R: 5'-TTCACTGAGCCGCT aaaaaa GaaaaaaGGACAAGCTC-3' (서열번호 14)
eap-R: 5'-TCACGGTGATCTTG aaaaaa CTTGCTCCTTTCGAT-3' (서열번호 15)
rara-R : 5'-ACAAAGCAAGGCTT aaaaaa AGATGCGGGGTAGA-3' (서열번호 16)
cbfb-R: 5'-GTAAAGATGGGCAG aaaaaa CACATCTGCTGTGC-3' (서열번호 17)
eto-R: 5'-TGGAGCTCCTTGAG aaaaaa GTTGGGGGAGGTG-3' (서열번호 18)
mds-R: 5'-GGAGTGCTGGCTAC aaaaaa CATCTGCATCTGGC-3' (서열번호 19)
myh11(e7/8/9)-R: 5'-CTCCAGCTGGCGCA aaaaaa TTCGTA GACACGTTG-3' (서열번호 20)
myh11(e12)-R: 5'-GCTGCGTCTTCATC aaaaaa CTCCATCTGGGTCT-3' (서열번호 21)
이어, 전기 중합효소연쇄반응이 수행된 반응산물을 1.5% 아가로스 젤상에서 전기영동하였다(참조: 도 2). 도 2는 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용하여 증폭된 백혈병 특이적인 융합유전자의 전기영동사진으로, 1번 레인은 주형을 가하지 않고 증폭한 음성대조군을 나타내고, 2번 내지 6번 레인은 서로다른 환자로부터 수득한 10개의 cDNA를 증폭한 결과이다. 도 2에서 보듯이, 각각의 환자로부터 얻어진 백혈병 관련 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응만으로도 충분히 증폭할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: SBS 프라이머를 이용한 상이한 온도조건에서의 다중 유전자 동시 증폭
상기 실시예 1의 결과에서 나타난, SBS 프라이머를 이용하여 다중 유전자를 동시에 증폭한 결과가, 증폭시 어닐링 온도에 의해 영향을 받는지의 여부를 확인하 였다.
구체적으로, 상업적으로 입수한 인간의 GAPDH, b-ACTIN, COMT 및 TNF-α 유전자를 증폭시키기 위하여, 인간의 지놈 DNA(Invitrogen Inc., USA)를 주형으로 사용하고, 다음과 같은 염기서열을 갖는 정상 프라이머 및 SBS 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응을 수행하였다:
정상 프라이머
GAPDH-151-f: 5'-AAAGGGTCATCATCTCTGC-3'(서열번호 22)
GAPDH-151-R: 5'-TTGTCATGGATGACCTTGG-3'(서열번호 23)
ACTB-199-f: 5'-CCACACCTTCTACAATGAG-3'(서열번호 24)
ACTB-199-R: 5'-GaaaaaaCGGCAGAAGAGAGA-3'(서열번호 25)
COMT-250-f: 5'-GCCTACTGTGGCTACTCA-3'(서열번호 26)
COMT-250-R: 5'-GTGGGTTTTCAGTGAACGT-3'(서열번호 27)
TNFa-300-f: 5'-CAGGACTCAACACAGCTTT-3'(서열번호 28)
TNFa-300-R: 5'-GACACACAAGCATCAAGGA-3'(서열번호 29)
SBS 프라이머
GAPDH-SBS-225-f: 5'-GCAAGAGCACAAGA aaaaaa AAGAGAGAGACCCTC-3'(서열번호 30)
GAPDH-SBS-225-R: 5'-TCCCCCTCTGCCC aaaaaa GACCCTAGAATAAGAC-3'(서열번호 31)
ACTB-SBS-402-f: 5'-CAGCAAGAGAGGCAT aaaaaa TCACCCTGAAGTACC-3'(서열번호 32)
ACTB-SBS-402-R: 5'-TGTCTTAGACACCTAG aaaaaa AGAGAGACAAACACC-3'(서열번호 33)
COMT-SBS-281-f: 5'-CTGGAGCTGGGG aaaaaa CTACTGTGGCTACTC-3'(서열번호 34)
COMT-SBS-281-R: 5'-AGGGGCCTGGTGAT aaaaaa TGGGTTTTCAGTGAAC-3'(서열번호 35)
TNFa-SBS-323-f: 5'-ACCCAAACACAGGC aaaaaa CAGGACTCAACACAG-3'(서열번호 36)
TNFa-SBS-323-R: 5'-GGGGACACACAAGC aaaaaa CAAGGATACCCCTCA-3'(서열번호 37)
즉, 인간 지놈 DNA 2㎕(50ng/㎕), 10X 중합효소연쇄반응 완충용액(750mM Tris-HCl(pH 9.0), 20mM MgCl2, 500 mM KCl, 200mM (NH4)2SO4,) 2㎕, 2.5mM dNTP 혼합물(2.5mM dATP, 2.5mM dGTP, 2.5mM dTTP, 2.5mM dCTP) 2㎕, Taq 중합효소(Biotools, Spain) 1.5unit 및 상기 각각의 정상 프라이머의 혼합물(0.5μM) 또는 SBS 프라이머들 혼합물(0.5μM)을 혼합하고, 3차 증류수를 가하여 20㎕로 적정한 다음, 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이때, 중합효소연쇄반응의 조건은 94℃ 에서 5분, 94℃에서 20초, 어닐링 30초, 72℃에서 40초의 조건하에 35사이클을 수행하였고, 어닐링 온도는 각각 56℃, 58℃ 및 62℃의 다른 온도에서 수행한 다음, 반응이 종료된 후, 증폭된 절편을 2%(w/v) 아가로스 젤에서 전기영동하였다(참조: 도 3).
도 3은 어닐링 온도를 변화시킨 조건에서, 정상 프라이머와 SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내는 전기영동사진으로, 1번 레인은 56℃의 어닐링 온도에서 정상 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내고, 2번 레인은 56℃의 어닐링 온도에서 SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내며, 3번 레인은 58℃의 어닐링 온도에서 정상 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내고, 4번 레인은 58℃의 어닐링 온도에서 SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내며, 5번 레인은 62℃의 어닐링 온도에서 정상 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타내고, 6번 레인은 62℃의 어닐링 온도에서 SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3에서 보듯이, SBS 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우에는, 어닐링 온도가 변화되더라도, 4종의 유전자가 모두 증폭됨을 알 수 있었으나, 정상 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우에는, 어닐링 온도가 증가될 수록 증폭율이 저하되고, 4종의 유전자가 정상적으로 증폭되지 않음을 알 수 있었다.
이상의 결과에서 보듯이, 본 발명의 SBS 프라이머를 이용한 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용할 경우, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응으로 증폭시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 주형과 결합할 때, 중간에 고리를 형성하도록 설계된 프라이머를 이용하여 다수의 주형유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 다중 유전자 동시 증폭방법을 제공한다. 본 발명의 다중 유전자 동시 증폭방법을 이용하면, 다수의 유전자를 한번의 중합효소연쇄반응만으로 증폭시킬 수 있으므로, 유전자 관련 분야의 연구개발의 진보에 이바지할 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. (i) 2 내지 30개의 목적 유전자로부터 증폭하고자 하는 부위를 각각 선택하는 단계;
    (ii) 전기 각각 선택된 부위의 5'말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열의 중앙부에 위치한 2 내지 4bp의 염기서열이 5 내지 8bp의 dNTP 염기서열로 치환된, 2 내지 30개의 센스프라이머를 작제하는 단계;
    (iii) 전기 각각 선택된 부위의 3'말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열의 중앙부에 위치한 2 내지 4bp의 염기서열이 5 내지 8bp의 dNTP 염기서열로 치환된, 2 내지 30개의 안티센스프라이머를 작제하는 단계;
    (iv) 전기 2 내지 30개의 목적 유전자와, 전기 목적유전자에 각각 상응하는 전기 작제된 2 내지 30개의 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 모두 혼합하고, 전기 혼합물을 이용하여 한번의 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및,
    (v) 전기 중합효소연쇄반응에 의하여 수득한 증폭산물을 확인하는 단계를 포함하는, 다중 유전자 동시 증폭방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    dNTP는 dATP, dTTP, dCTP 또는 dGTP인 것을 특징으로 하는
    다중 유전자 동시 증폭방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    수득한 증폭산물의 확인은 전기영동방법, 비드어레이를 이용한 교잡방법 또는 마이크로어레이를 이용한 교잡반응 방법에 의하여 수행하는 것을 특징으로 하는
    다중 유전자 동시 증폭방법.
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