KR100590621B1 - 하이힐 프라이머를 이용한 ｒｎａ의 선형 증폭방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하이힐 프라이머(high-heel primer)를 이용한 RNA의 선형 증폭방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 하이힐 프라이머를 이용하여 어닐링과 신장을 동일한 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 전체(total) RNA의 선형 증폭방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, RNA 프라이머를 사용하지 않고 DNA 프라이머를 사용하므로 선형 증폭과정이 매우 안정적이고, RNA의 양과 정제방법에 상관없이 같은 기원의 RNA끼리는 높은 상관도를 나타내므로 적은 양의 샘플도 쉽게 증폭할 수 있다. 또한 하나의 하이힐 프라이머만을 사용하여 나노그램 수준의 전체 RNA로부터 한번의 선형 증폭과정을 거쳐서 마이크로어레이 실험에 충분한 양의 타겟(target)을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 선형 증폭방법에 비해, 저비용으로 단시간에 고효율의 선형증폭을 달성할 수 있다.

RNA, 선형증폭, 하이힐 프라이머, cDNA, 마이크로어레이

Description

하이힐 프라이머를 이용한 ＲＮＡ의 선형 증폭방법{Method for Linear Amplification of RNA Using High-Heel Primer}

도 1은 본 발명에 따른 하이힐 프라이머를 이용한 RNA의 선형 증폭방법에 대한 개략도를 나타낸 것이다.

도 2는 대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)] 전체 RNA 각각 1㎍을 본 발명의 선형 증폭방법으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 최종산물을 아가로스 겔로 확인한 것이고, (B)는 최종산물을 정제하고, 형광염료와 결합시켜 17K 인간 cDNA 마이크로어레이에 적용한 것이다.

도 3은 소량(1㎍)의 전체 RNA를 본 발명에 따른 선형 증폭방법으로 증폭하여 재현성을 확인한 것으로, (A)는 독립적으로 2회 선형증폭한 타겟을 17K 인간 cDNA 마이크로어레이에 적용한 결과(1st & 2nd) 및 대조군인 293(ATCC CRL1573) RNA만을 사용하여 동일한 마이크로어레이에 적용한 결과(yellow test)를 나타낸 것이다. (B)의 왼쪽 그래프는 (A)의 결과를 수치화한 것으로, 2회 실험(1st and 2nd amplification)에서 시그널 세기(signal intensity)가 일정치 이상인 유전자 6928개를 선정하여 각 실험간의 상관도를 나타낸 것이고, 오른쪽 그래프는 293(ATCC CRL1573) RNA를 Cy3와 Cy5 염료와 결합시켜 실험한 결과의 상관도를 나타낸 것이 다.

도 4는 대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)]의 하이브리다이제이션 결과를 나타낸 것이다. (A)에서 왼쪽 이미지는 전체 RNA 100㎍을 사용하여 직접 표지된 cDNA와 하이브리다이제이션시킨 어레이를 나타낸 것이고, 오른쪽 이미지는 1㎍의 전체 RNA를 선형증폭한 다음, cDNA와 하이브리다이제이션시킨 어레이의 동일한 섹션을 나타낸 것이다. (B)는 전체 RNA 100㎍으로 실험한 결과와 선형증폭한 결과의 상관도를 비교하고 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 RNA의 양을 변화(1㎍, 5㎍, 10㎍ 및 20㎍) 시키면서 선형증폭하고, 각각의 증폭물을 마이크로어레이에 적용한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 선형 증폭방법의 민감도(sensitivity)를 알아보기 위해, 나노그램 단위의 RNA(200ng, 20ng)를 선형증폭한 다음, 증폭된 타겟을 마이크로어레이에 적용한 결과(A)와 각 실험간의 상관도를 상관계수로 수치화한 그래프(B)를 도시한 것이다.

발명의 분야

본 발명은 하이힐 프라이머(high-heel primer)를 이용한 RNA의 선형 증폭방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 하이힐 프라이머를 이용하여 어닐링과 신장 을 동일한 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는 소량의 RNA를 선형 증폭하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

분자진단분야에서 기존의 침습적인(invasive) 방법 대신 환자 편의적인 방법(non-invasive; stool, sputum 등)을 이용한 소량의 시료를 대상으로 하는 진단의 필요성이 대두되면서 극소량의 샘플을 증폭하는 기술의 필요성이 커지고 있다.

최근, RNA 샘플의 증폭에 의해 민감도(sensitivity)가 증가되고, 실험편차(technical variation)가 감소되어, 마이크로어레이 실험결과의 질(quality)이 향상됨으로써 좀더 의미있는 생물학적 발견(biological discovery)이 가능하다는 보고가 있었다 (Park, PJ et al., J. Biotechnol., 112:225, 2004; Feldman, AL et al., Biotechniques, 33:906, 2002; Polacek, DC et al., Physiol Genomics, 13:147, 2003; Kurn, N and Heath, JD, Genetic Engineering News, 24(3), 2004). 결국, 성공적인 마이크로어레이 실험을 수행하기 위해서는 샘플에 상관없이 루틴하게 적용할 수 있고 민감도가 높은 표준화된, RNA 샘플의 증폭방법이 필수적이다.

유전자 발현패턴 연구 및 진단을 위한 샘플준비(sample preparation) 과정에서 가장 중요한 측면 중 하나는 사용되는 total RNA에 상관없이 샘플내에 존재하는 모든 전사체(transcripts)를 효율적으로 대변(relative representation)해 주어야 한다는 것이다. 이러한 관점에서 사용되는 증폭방법의 선형도(linearity)가 매우 중요하다.

마이크로어레이용 샘플준비를 위한 증폭방법으로, T7-폴리머라제 기반 프라이머(T7-polymerase based primer)를 이용한 in vitro 전사방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다 (van Gelder, RN et al., PNAS, 87:1663, 1990; Glanzer, JG and Eberwine, JH, Br. J. Cancer, 90:1111, 2004). 이 방법은 마이크로어레이 실험에서 요구하는 양을 충족시킴에도 불구하고, 실험데이타의 질을 저하시킬 수 있는 중요한 한계점을 여전히 지니고 있다. 첫째, 실험과정이 복잡하기 때문에 마이크로어레이 샘플을 준비하는데 4일 이상의 시간을 필요로 할 수 있다. 둘째, 100ng 이하의 전체 RNA로부터 마이크로어레이 실험에 충분한 샘플 양을 확보하기 위해서는 적어도 2번이상의 증폭과정이 필요하게 된다. 이 과정에서, 많은 실험적 편차가 발생될 수 있다. 게다가 서로 다른 수의 증폭과정을 거친 샘플들은 서로 다른 양의 타겟을 만들어, 양이 많은 샘플과 적은 샘플간의 오차를 유발시킴으로 결과적으로 데이터의 신뢰도를 떨어뜨리게 된다.

그 동안 효과적인 선형 증폭방법을 개발하기 위해 여러가지 시도가 있었지만, 상기와 같은 T7-폴리머라제 기반 증폭법에서 크게 벗어나지 못하였다. 최근, Nugen사에 의해 새로운 RNA 등온 증폭법(amplification using isothermal enzyme) 방법이 개발되었다 (WO 02/072772 A2; US 6,251,639B1). 이는 DNA/RNA 프라이머를 이용하여 선형증폭하는 방법으로 1ng정도의 소량시료도 증폭할 수 있고 재현성도 높다는 장점이 있다. 그러나, 일반적으로 대량의 실험을 요하는 유전자 발현분석의 표준화된 타겟 준비방법으로 사용하기에는 너무 고가의 비용이 소요된다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적으로 소량의 RNA 샘플을 선형증폭하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 하이힐 프라이머를 사용하고 프라이머와 주형(template)의 결합(어닐링)과 cDNA 신장을 동일한 온도에서 수행함으로써, 특이성(specificity)과 민감도(sensitivity)가 극대화되고, 짧은 시간에 적은 비용으로 RNA 샘플을 선형증폭할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은 소량의 RNA 샘플로부터 마이크로어레이 실험에 충분한 양의 target을 확보할 수 있는 선형증폭방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 1㎍이하의 샘플 RNA에 서열번호 1인 하이힐 프라이머의 3' 말단에 서열번호 2인 폴리-dT를 결합시킨 폴리-dT-하이힐 프라이머를 첨가하고, 65~75℃에서 반응시켜 샘플 RNA의 폴리-A 부분에 폴리-dT-하이힐 프라이머를 어닐링시키는 단계; (b) 상기 어닐링된 샘플에 역전사 효소, dNTP 혼합물 및 RNAsin을 함유하는 역전사 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 cDNA를 합성하고, RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계; (c) 상기 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNaseH, DNA 중합효소 및 DNA 리가제를 포함하는 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 이중나선 cDNA를 합성하는 단계; 및 (d) 상기 합성된 이중나선 cDNA에 하이힐 프라이머, dNTP 및 DNA 중합효소를 첨가하고 PCR에 의한 선형증폭을 수행하되, 상기 PCR에 의한 선형증폭시 어닐링과 신장을 동일한 온도(65~75℃)에서 수행하는 단계를 포함하는 RNA의 선형 증폭방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 1㎍이하의 샘플 RNA에 서열번호 1인 하이힐 프라이머의 3' 말단에 서열번호 2인 폴리-dT를 결합시킨 폴리-dT-하이힐 프라이머를 첨가하고, 65~75℃에서 반응시켜 샘플 RNA의 폴리-A 부분에 폴리-dT-하이힐 프라이머를 어닐링시키는 단계; (b) 상기 어닐링된 샘플에 Finzyme, dNTP 혼합물 및 RNAsin을 함유하는 역전사 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 cDNA를 합성하고, RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계; (c) 상기 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNA/cDNA 하이브리드에서 RNA를 제거하는 효소를 첨가하여 RNA를 절단하는 단계; (d) 상기 RNA가 절단된 cDNA에 DNA 중합효소, dNTP 및 DNA 리가제를 첨가하고 반응시켜 이중나선 cDNA를 합성하는 단계; 및 (e) 상기 합성된 이중나선 cDNA에 하이힐 프라이머 및 DNA 중합효소를 첨가하고 PCR에 의한 선형증폭을 수행하되, 상기 PCR에 의한 선형증폭시 어닐링과 신장을 동일한 온도(65~75℃)에서 수행하는 단계를 포함하는 RNA의 선형 증폭방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 하이힐 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 폴리-dT-하이힐 프라이머는 서열번호 2로 표시되는 것임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 샘플 RNA의 양은 나노그램 단위인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 역전사 효소반응물은 역전사 효소, dNTP 혼합물 및 RNase 저해제인 RNAsin을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 이중나선 cDNA의 증폭단계에서 아미노알릴-dUTP를 첨가하여 선형증폭하고, 선형증폭된 cDNA의 아미노알릴-dUTP에 Cy-3 또는 Cy-5를 결합시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계는 상기 폴리-dT-하이힐 프라이머에서 폴리-dT를 제외한 하이힐 프라이머 부분은 RNA와 하이브리드를 형성하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 "하이힐 프라이머"라는 용어는 Tm이 65~75℃, 바람직하게는 72℃이고, GC 함량이 70%이상인 올리고뉴클레오티드로 정의한다.

본 발명은 기존의 T7-폴리머라제 기반 증폭법과 전혀 다른 방법으로 하이힐 프라이머(high-heel primer)를 이용한 RNA의 선형 증폭방법에 관한 것이다. 본 발명은 나노그램 수준의 total RNA로부터 한번의 선형증폭과정을 거쳐 마이크로어레이 실험에 충분한 양의 타겟을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 충분한 민감도(sensitivity)를 가진다. 또한 본 발명의 방법은 시간의 효율성뿐 아니라, 마이크로어레이용 샘플의 준비과정에 루틴하게 적용할 정도의 편리성도 갖추고 있다.

본 발명에 따른 하이힐 선형증폭 시스템은 우선 첫 번째 가닥(first strand) cDNA의 합성을 위해서 샘플 RNA에 하이힐 프라이머의 3' 말단에 폴리-dT를 결합시킨 폴리-dT-하이힐 프라이머를 첨가하고, 65~75℃에서 반응시켜 샘플 RNA의 폴리-A 부분에 폴리-dT-하이힐 프라이머를 어닐링시킨다. 이 어닐링된 샘플에 역전사 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 first strand cDNA를 합성한다.

이후, 두 번째 가닥(second strand) cDNA를 합성하는 반응이 이루어지는데, 이 반응은 상기 합성된 첫 번째 가닥 cDNA와 RNase H, E. coli DNA Ligase, 그리고, DNA 중합효소를 첨가하여 이중나선 dDNA를 합성한다. 이때, RNase H는 DNA와 하이브리다이제이션되어 있는 RNA만을 특이적으로 인식하여 잘라주게 되는데, 그 결과로 생기는 RNA조각들이 랜덤 프라이머로 작용하여 이중나선 DNA를 완성하게 되는 것이다.

상기 완성된 이중나선 DNA의 센스 스트랜드(sense strand)는 선형증폭과정의 주형으로 사용되게 되는데, 이 DNA는 3' 말단에 하이힐 프라이머의 서열을 포함하고 있다. 그러므로 여기에 하이힐 프라이머와 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 및 aminoallyl-dUTP) 및 DNA 중합효소를 첨가하여 PCR에 의한 선형증폭을 수행하되, 상기 PCR에 의한 선형증폭시 어닐링과 신장을 동일한 온도(65-75℃)에서 수행하면 RNA를 효율적으로 선형증폭할 수 있다.

본 발명의 하이힐 시스템은 다음과 같은 편의성을 가진다.

첫째, T7-폴리머라제 기반 증폭방법과는 달리 마이크로어레이 실험의 타겟을 합성하는 전단계가 DNA 레벨을 기본으로 한다는 것이다. 또한 본 시스템은, 기존 시스템이 분해(degradation) 가능성을 지니는 불안정한 RNA 산물을 생성하는 것과는 달리, 안정적인 단일가닥(single strand) cDNA를 최종산물로 생성하게 된다. RNA 산물의 경우 샘플준비나 보관과정에서 레이블된(labeled) RNA의 비특이적 손상으로 인해 샘플간 유전자 발현의 차이를 유발할 수 있는 위험을 항상 안고 있으나, 안정적인 DNA 타겟의 경우는 이런 불안감을 최소화할 수 있다.

둘째, 본 발명의 하이힐 시스템은 다른 샘플간 전사체의 발현차이를 가장 정확히 대변해 줄 뿐 아니라, 동일 샘플간 다른 total RNA 조건과 RNA 양에 따른 유전자 발현의 오차를 최소화해 주어 실험의 신뢰도 및 충실도를 유지시켜준다.

셋째, 본 발명의 시스템은 기존의 어떤 시스템보다 소요 비용이 적다(cost-effective). 특별한 시스템의 구축 없이 적은 비용으로 루틴한 마이크로어레이용 샘플준비 시스템을 셋팅할 수 있다.

넷째, 본 발명의 시스템은 시간 효율성이 우수하다. 전체 시스템의 간편성으로 인해 많은 시간을 요하지 않고, 나노그램 단위의 샘플로부터 한번의 증폭과정만으로 마이크로어레이 실험에 충분한 양을 확보할 수 있기 때문에 실험과정 중의 테크닉컬 에러율을 최소화 할 수 있게 한다. 앞에서 언급한 바와 같이 서로 다른 방법에 의한 타겟 준비는 마이크로어레이 실험의 분석과정에서 통계적인 에러를 유발할 수 있는 위험이 있다. 그러므로 소량의 시료뿐 아니라, 충분한 양의 시료에도 같은 방법을 적용하여 실험하는 것이 좋다. 게다가 효소의 활성 및 레이블링 효율(labeling efficiency), 그리고 민감도의 차이 등 각 방법간에는 많은 차이를 가지고 있다. 결론적으로, 상기 언급한 근거로 인하여, 모든 실험적 편차를 제거하기 위해, 루틴하고 표준화된 샘플준비방법이 필수적이라 할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 소량의 RNA 샘플로부터 cDNA를 선형증폭하는 방법에 대하여 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따라 소량의 RNA 샘플로부터 DNA를 선형 증폭하는 예를 도시한 것이다. 즉, 폴리-dT-하이힐 프라이머를 샘플 mRNA의 폴리-A 부분에 어닐링시킨 다음, 역전사 효소를 사용하여 단일나선 cDNA를 합성한다.

상기 폴리-dT-하이힐 프라이머는 선형증폭시에 사용되는 하이힐 프라이머의 5'말단 및 3'말단에 각각 CTG 염기 및 폴리-dT를 결합시킨 프라이머로, 폴리-dT 부분은 (3n+1)개의 염기서열로 구성된 것으로(n=5, 6, 7, 8, 9 또는 10), 3n번째 염기는 A, G 또는 C로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 염기이고, (3n+1)번째 염기는 A, T, G 또는 C로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 염기이다. 상기 폴리- dT-하이힐 프라이머는 65~75℃에서, 가장 바람직하게는 72℃에서 어닐링된 다음, RNA/cDNA 하이브리드가 형성될 때, 상기 폴리-dT-하이힐 프라이머에서 폴리-dT를 제외한 하이힐 프라이머 부분은 RNA와 하이브리드를 형성하지 않는다.

상기 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNase H, E. coli DNA Ligase, 그리고, DNA 중합효소를 첨가하여 이중나선 dDNA가 합성되게 된다. 이때, RNase H는 DNA와 하이브리다이제이션되어 있는 RNA만을 특이적으로 인식하여 잘라주게 되는데, 그 결과로 생기는 RNA조각들이 랜덤 프라이머로 작용하여 이중나선 DNA를 완성하게 되는 것이다.

상기 수득된 이중나선 cDNA에 하이힐 프라이머 및 DNA 중합효소를 첨가한 후, 선형 증폭과정을 수행함으로써, 소량의 샘플로부터 다량의 증폭산물을 수득할 수 있게 되는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 역전사 반응을 통한 cDNA의 합성

1㎍이하의 전체 RNA와 하기의 서열번호 1로 표시되는 하이힐 프라이머의 3' 말단에 폴리-dT를 결합시킨 서열번호 2의 폴리-dT-하이힐 프라이머(2㎍)를 혼합하 여 65℃에서 10분동안 반응시켜 어닐링시킨 다음, 역전사 효소(400unit, Finzyme, Finland), dNTP 혼합물(10mM, Solgent, Korea), RNAsin(5unit, Promega, USA) 등을 포함하는 효소 반응물을 첨가하여 42℃에서 2시간동안 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 이 과정에서 RNA/cDNA 하이브리드가 형성되게 된다.

서열번호 2의 프라이머는 본 실시예에서 사용된 폴리-dT-하이힐 프라이머로 V는 A, G 또는 C로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 염기이고, N은 A, T, G 또는 C로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나의 염기이다.

서열번호 1: 5'- CGC TGG GCC GAC CGG GCG CGG GAC-3'

서열번호 2: 5'- CTA CGC TGG GCC GAC CGG GCG CGG GAC TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N-3'

실시예 2: 이중나선 cDNA 합성

상기 실시예 1에서 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNase H(2unit, Invitrogen, USA), DNA 중합효소(40unit, Invitrogen, USA), DNA 리가아제(6unit, Invirtogen, USA), dNTP 혼합물(10mM, Invitrogen, USA) 등을 포함하는 효소반응물을 첨가하고 16℃에서 2시간동안 반응시켜 이중나선 cDNA를 합성한 다음, 1M NaOH/2mM EDTA 7.5㎕를 첨가하고 65℃에서 10분간 처리하여 반응을 종결시켰다.

합성된 이중나선 cDNA만을 추출하기 위하여 상기 합성된 샘플과 뉴클레아제가 없는 물 (nuclease-free water) 100㎕와 PCI (25:24:1, Sigma, USA) 200㎕를 Phase-Lock Gel튜브 (Eppendorf, Germany)에 첨가하고 혼합한 후 13,000rpm에서 5 분동안 원심분리하였다. 수층(aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮기고, 7.5M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 0.5part, 리니어 아크릴아마이드 1㎕ 및 EtOH 2.5part를 첨가하여 -70℃에서 5분 동안 침전시킨 다음, 13,000rpm에서 15분동안 원심분리를 수행하였다. EtOH 500㎕로 수세한 후, EtOH을 제거하고 건조시킨 다음, 뉴클레아제가 없는 물 10㎕에 녹였다.

실시예 3: 선형증폭

상기 실시예 2에서 추출된 이중나선 cDNA에 서열번호 1의 하이힐 프라이머(2㎍, Bioneer, Korea), Taq 중합효소(5unit, Solgent, Korea), dNTP(dATP, dCTP 및 dGTP: 10mM; dTTP: 2mM; 및 aminoallyl-dUTP: 8mM) 등을 포함하는 효소 반응물을 첨가하고, PCR을 통해 선형증폭을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 먼저 94℃에서 10분간 denaturation한 후, (94℃에서 45초, 72℃에서 2분)을 35사이클 수행한 다음, 72℃에서 5분간 extension 과정을 수행하였다. 상기 PCR에 의해 선형증폭된 산물은 PCR 정제키트(Intron, Inc., Korea)를 사용하여 분리 · 정제하였다.

상기 하이힐 프라이머는 본 발명에서 정의된 바와 같이 65-75℃에서, 바람직하게는 72℃에서 어닐링이 되도록 고안된 프라이머이다. 또한, 72℃에서는 Taq 중합효소의 효율이 최대화되는 온도이므로 선형 증폭과정을 최적화시킬 수 있고, 높은 온도에서 어닐링이 수행되기 때문에 지수적으로 증폭(exponential amplification)되는 위험을 제거할 수 있으며 또한, 하이힐 프라이머의 어닐링과 합성될 cDNA의 신장(extension)이 동시에 일어날 수 있으므로 시간의 효율성을 높 일 수 있는 것이다.

실시예 4: 마이크로어레이에 적용

상기 실시예 3에서 선형증폭된 cDNA 샘플을 그 부피가 10㎕이 될 때까지 Microcon-300(Millipore, USA)을 사용하여 농축한 다음, 형광물질(Cyanine-3 및/또는 Cyanine-5)과 혼합하고, 1M NaHCO₃(pH 9.0) 0.5㎕를 첨가하여 어두운 곳에서 1시간동안 반응시킨 다음, 4M 하이드록실아민(hydroxylamine) 4.5㎕을 첨가하여 어두운 곳에서 15분간 퀀칭(quenching)반응을 시켰다. 형광물질이 표지된 cDNA는 PCR 정제키트(Intron, Inc., Korea) 로 다시 분리 · 정제하였다.

상기 분리ㆍ정제된 cDNA에 인간 cot-1(2㎍/㎕, Invitrogen, USA) 20㎕, 폴리A(20㎍/㎕, Sigma, USA) 2㎕ 및 이스트 tRNA(20㎍/㎕, Invitrogen, USA) 2㎕을 첨가한 다음, 적정 부피에 도달할 때까지 마이크로콘-300(Millipore, Inc., USA)을 사용하여 농축하였다. 농축된 샘플을 새로운 튜브로 옮기고, 최종 하이브리다이제이션 부피로 적정한 후, 5X SSC, 0.1% SDS, 30-50% formamide와 섞어 100℃에서 2분간 denaturation시킨 후, 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

마이크로어레이 실험은 선형증폭 과정에서 단일 기능성 형광물질을 삽입하는 것으로 수행할 수도 있다. 즉, 이중나선 cDNA를 수득한 다음, 선형증폭 과정중에 Cy-3-dUTP/Cy-5-dUTP를 첨가하여 합성되는 cDNA의 중간 중간에 삽입시켜서 각각의 형광색깔로 표지함으로써, 여러 가지 플랫폼(platform)의 마이크로어레이에 적용시 킬 수도 있다.

실시예 5: 소량 RNA의 선형증폭

대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)]의 전체 RNA 각각 1㎍을 본 발명의 방법에 의해 선형증폭하였다 (도 2). 도 2에서, (A)는 전체최종산물의 양중 0.1 part에 해당하는 양을 1% 아가로스 겔로 확인한 것으로, 도시된 바와 같이, 주 산물의 사이즈는 500bp 정도로 나타났고, 약300bp~약1.3kb의 다양한 크기로 증폭된 산물을 확인할 수 있었다. (B)는 최종산물을 정제하고, 형광염료와 결합시켜 인간 17K 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 적용한 결과를 나타낸 것이다. 즉, 대조군의 샘플은 초록색의 염료(Cy-3, Amersham, England)와 결합시키고, 실험군 샘플은 적색의 염료(Cy-5, Amersham, England)와 각각 결합시킨 다음, 인간 17K 마이크로어레이에 적용한 후 스캔한 이미지를 나탄 것으로, 도시된 바와 같이, 마이크로어레이 상의 거의 모든 유전자가 커버되는 것으로 나타났다.

이 결과로부터 샘플내 존재하는 거의 모든 전사체가 고르게 증폭된다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 극소량의 복제수를 가지는 전사체의 경우, 종래의 방법으로는 발현여부를 확인할 수 없는 반면, 본 발명의 선형 증폭방법으로는 효율적인 증폭 및 검출이 가능하다는 것을 의미한다.

실시예 6: 재현성

소량(1㎍)의 전체 RNA를 본 발명에 따른 선형 증폭방법으로 증폭하여 재현 성을 확인하였다 (도 3). 실험은 같은 기원의 RNA를 이용하여 독립적으로 2회 수행하였으며, yellow test의 경우 293(ATCC CRL1573) RNA만을 사용하여 독립적으로 증폭한 결과이다.

도 3에서, (A)는 독립적으로 2회 선형증폭한 타겟을 17K 인간 cDNA 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 적용한 실험결과(1st & 2nd)와 대조군인 293(ATCC CRL1573) RNA만을 사용하여 동일한 마이크로어레이에 적용한 결과(yellow test)를 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 두 번의 독립적 실험 이미지가 매우 일치하는 것을 확인할 수 있었으며, yellow test의 결과 또한 염료의 차이(Cy-3와 Cy-5)와 관계없이 거의 동일하게 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 염료의 차이에 의해 레이블링 효율(labeling efficiency)이 다양성을 지닌다는 것은 이미 알려져 있으며, 이 다양성에서 오는 에러를 극복하기 위한 몇몇 시도 또한 있었다.

도 3에서, (B)의 왼쪽 그래프는 (A)의 결과를 수치화 한 것으로, 두 실험(1st and 2nd amplification)에서 시그널 세기(signal intensity)가 일정치 이상인 유전자 6928개를 선정하여 독립적으로 수행된 두 실험끼리의 상관도를 조사한 결과, 0.99정도의 높은 재현도를 보였다. 결국, 본 발명의 방법은 기존의 다른 방법에 비해 매우 우수한 재현도를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 오른쪽 그래프는 같은 293(ATCC CRL1573) RNA샘플을 Cy3와 Cy5 염료로 실험한 결과의 상관도를 나타낸 것으로, yellow test 결과, 각기 다른 염료를 사용했음에도 불구하고, Cy3[293(ATCC CRL1573) sample]과 Cy5[293(ATCC CRL1573) sample]의 상관도가 0.987을 나타내어 염료의 변화와는 거의 무관하다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 선형 증폭방법은 우수한 재현도를 나타낼 뿐 아니라, 염료의 차이, 효소의 효율 등 실험상에서 발생할 수 있는 다양성을 최소화 한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 선형도(linearity)

본 발명에 따른 선형 증폭방법의 선형도를 검증하기 위하여, 다른 방법으로 labeling된 대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)]의 샘플을 하이브리다이제이션한 결과를 조사하였다 (도 4). 이미 언급한 바와 같이, 대용량 유전자 발현패턴 연구를 위한 샘플준비 방법의 가장 중요한 측면 중 하나는 사용되는 total RNA에 상관없이 샘플내에 존재하는 모든 전사체(transcripts)를 효율적이며 재현적으로 대변(relative representation)해 줄 수 있어야하며, 이 점에서 증폭방법의 선형도(linearity)는 매우 중요하다.

도 4에서, (A)의 왼쪽 이미지는 전체 RNA 100㎍을 사용하여 직접 표지된 cDNA와 하이브리다이제이션시킨 어레이를 나타낸 것이고, 오른쪽 이미지는 1㎍의 전체 RNA를 본 발명으로 선형증폭한 다음, cDNA와 하이브리다이제이션시킨 어레이의 동일한 섹션을 나타낸 것이다. (B)는 전체 RNA 100㎍으로 실험한 결과와 선형증폭한 결과의 상관도를 비교하고 이를 수치화하여 그래프로 나타낸 것으로, 이때 선형도는 0.938이었다.

도 4의 (A) 및 (B)를 통해, 전체 RNA 100㎍을 직접 표지하여 하이브리다이제이션시킨 경우와 전체 RNA 1㎍을 선형증폭하여 하이브리다이제이션시킨 경우의 결 과가 거의 일치한다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 표 1의 결과에 나타난 바와 같이, 전체 RNA 100㎍으로 실험한 결과와 독립적으로 수행된 선형증폭 결과물로 실험한 결과를 비교하였다. 각 실험에서 의미있는 유전자 2542개를 선별하고, 각각의 실험간 상관관계(correlation) 값을 비교한 결과, 본 발명에 따른 선형 증폭방법이 높은 선형도(linearity)를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 선형 증폭방법은 다른 샘플간 전사체의 발현차이를 아주 정확하게 대변해 준다는 것을 확인할 수 있었다.

	직접 vs 증폭(1st)	직접 vs 증폭 (2nd)
상관계수 (Correlation coefficient)	0.938	0.94
의미있는 전사체 수 (Number of Significant Transcripts)	2,542	2,542

실시예 8: RNA 양에 따른 발현패턴과 시그널 세기

RNA 양에 따른 발현패턴과 시그널 세기의 변화여부를 확인하기 위하여, 대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)]의 샘플 RNA 양을 1㎍, 5㎍, 10㎍ 및 20㎍으로 변화시켜 각각 본 발명의 방법에 의해 선형증폭하고, 이를 17K 인간 cDNA 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 혼성화시킨 다음, 이미지를 조사하였다 (도 5). 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 실험에 사용된 초기 샘플 RNA 양에 관계없이 일정한 시그널 세기(signal intensity)를 나타내고, 발현패턴 또한 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 표 2에 나타난 바와 같이, 각 실험간에서 의미있는 유전자 3,153개를 선별하여 1㎍ RNA를 사용한 경우를 기준으로 각각 5㎍, 10㎍ 및 20㎍ RNA를 사용한 경우의 상관관계를 비교한 결과, 높은 상관도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 선형 증폭방법은, RNA 양과 정제방법에 상관없이 같은 기원의 RNA끼리는 높은 상관도를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

RNA는 DNA와는 달리 전체적으로 매우 불안정하므로, 샘플 정제 및 labeling process나 보관 과정 등에서 샘플 RNA의 비특이적 손상이 유발될 가능성이 크고, 이로 인해 대조군과 비교군 샘플의 실험초기 RNA양이 정확히 일치한다고 장담할 수 없으며, 측정 또한 거의 불가능하다. 더구나, 마이크로다이섹션 등과 같은 방법에 의한 임상샘플의 경우 실험을 시작하기 위해 샘플 RNA양의 측정조차 어려운 경우가 많다. 그러므로, 실험결과의 다양성으로 작용할 이러한 여러 요인들의 영향을 최소화하는 것이 매우 중요하다. 본 발명의 방법에 의하면, 도 5 및 표 2에 나타난 바와 같이, 그 결과가 우수하고, 샘플외 다른 요인으로 유발되는 다양성을 최소화할 수 있다.

	1㎍ vs 5㎍	1㎍ vs 10㎍	1㎍ vs 20㎍
상관계수 (Correlation Coefficient)	0.963	0.969	0.945
의미있는 유전자 수 (Number of Significant Transcripts)	3,153	3,153	3,153

실시예 9: 민감도

본 발명에 따른 선형 증폭방법의 민감도(sensitivity)를 조사하기 위하여, 대조군[293(ATCC CRL1573)]과 실험군[헬라(ATCC CCL2)]의 샘플 RNA양을 각각 희석하여 각 200ng, 20ng의 양을 선형증폭한 다음, 증폭된 타겟을 17K 인간 cDNA 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 혼성화시킨 다음, 이미지를 조사하였다 (도 6).

그 결과, 도 6(A)에 나타난 바와 같이, 20ng의 RNA도 성공적으로 증폭 및 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있으며, 200ng과 20ng의 실험결과를 상관계수로 비교한 결과 또한 대체로 높은 상관도(correlation = 0.88)를 나타내었다 (도 6(B)의 오른쪽). 더구나, 20ng의 RNA에 의한 실험결과와 앞서 언급한 1㎍의 같은 기원인 RNA의 실험결과를 비교했을 때, 0.89의 높은 상관도를 나타내어 선형도(linearity)가 우수하다는 것을 다시 확인할 수 있었다 (도 6(B)의 왼쪽).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA의 선형 증폭방법은 하나의 하이힐 프라이머만을 사용하여 나노그램 수준의 전체(total) RNA로부터 한번의 선형 증폭과정을 통해 마이크로어레이 실험에 충분한 양의 타겟을 확보할 수 있을 뿐만 아니라, 충분한 민감도(sensitivity)를 지니고 있고, 종래의 선형 증폭방법에 비해 저렴한 비용으로도 단시간에 효율이 높은 선형증폭을 달성할 수 있다. 또한 RNA 프라이머를 사용하지 않고 DNA 프라이머를 사용하므로 선형증폭 과정이 안정적이라는 장점이 있고, RNA 양과 염료의 차이에서 오는 다양성에 상관없이 같은 기원의 RNA끼리는 높은 상관도를 나타내므로 적은 양의 샘플로 진단하는 경우에 매우 유용하다. 아울러 증폭결과가 안정적이어서 마이크로다이섹션에 의한 샘플이나 파라핀 블록 샘플로부터 극소량의 RNA를 증폭 및 검출하는데도 유용하다.

본 발명은 질병의 마커(marker)를 발굴하기 위하여 소량의 시료 RNA를 이용한 DNA 마이크로어레이 실험, 유전자 발현기작 규명 등 고감도를 요하는 실험, DNA 및 RNA 발현을 이용한 분자진단, 독성유전체학 연구와 약물유전체학 연구 등 필연적으로 소량시료의 증폭기술이 필수적으로 요구되는 분야에 매우 유용하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

1. 하기의 단계를 포함하는 RNA의 선형 증폭방법:

   (a) 1㎍이하의 샘플 RNA에 서열번호 1인 하이힐 프라이머의 3' 말단에 폴리-dT를 결합시킨 서열번호 2인 폴리-dT-하이힐 프라이머를 첨가하고, 65~75℃에서 반응시켜 샘플 RNA의 폴리-A 부분에 폴리-dT-하이힐 프라이머를 어닐링시키는 단계;

   (b) 상기 어닐링된 샘플에 역전사 효소, dNTP 혼합물 및 RNAsin을 함유하는 역전사 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 cDNA를 합성하고, RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계;

   (c) 상기 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNaseH, DNA 중합효소 및 DNA 리가제를 포함하는 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 이중나선 cDNA를 합성하는 단계; 및

   (d) 상기 합성된 이중나선 cDNA에 하이힐 프라이머, dNTP 및 DNA 중합효소를 첨가하고 PCR에 의한 선형증폭을 수행하되, 상기 PCR에 의한 선형증폭시 어닐링과 신장을 동일한 온도(65~75℃)에서 수행하는 단계.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 아미노알릴-dUTP를 첨가하여 선형증폭하고, 선형증폭된 cDNA의 아미노알릴-dUTP에 Cy-3 또는 Cy-5를 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 어닐링과 신장은 72℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계는 상기 폴리-dT-하이힐 프라이머에서 폴리-dT를 제외한 하이힐 프라이머 부분은 RNA와 하이브리드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 DNA 중합효소는 Tag 폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 하기의 단계를 포함하는 RNA의 선형 증폭방법:

   (a) 1㎍이하의 샘플 RNA에 서열번호 1인 하이힐 프라이머의 3' 말단에 서열번호 2인 폴리-dT를 결합시킨 폴리-dT-하이힐 프라이머를 첨가하고, 65~75℃에서 반응시켜 샘플 RNA의 폴리-A 부분에 폴리-dT-하이힐 프라이머를 어닐링시키는 단계;

   (b) 상기 어닐링된 샘플에 Finzyme, dNTP 혼합물 및 RNAsin을 함유하는 역전사 효소반응물을 첨가하고 반응시켜 cDNA를 합성하고, RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계;

   (c) 상기 형성된 RNA/cDNA 하이브리드에 RNA/cDNA 하이브리드에서 RNA를 제거하는 효소를 첨가하여 RNA를 절단하는 단계;

   (d) 상기 RNA가 절단된 cDNA에 DNA 중합효소, dNTP 및 DNA 리가제를 첨가하고 반응시켜 이중나선 cDNA를 합성하는 단계; 및

   (e) 상기 합성된 이중나선 cDNA에 하이힐 프라이머 및 DNA 중합효소를 첨가하고 PCR에 의한 선형증폭을 수행하되, 상기 PCR에 의한 선형증폭시 어닐링과 신장을 동일한 온도(65~75℃)에서 수행하는 단계.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제9항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 아미노알릴-dUTP를 첨가하여 선형증폭하고, 선형증폭된 cDNA의 아미노알릴-dUTP에 Cy-3 또는 Cy-5를 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제9항에 있어서, 상기 (e) 단계의 어닐링과 신장은 72℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제9항에 있어서, RNA/cDNA 하이브리드에서 RNA를 제거하는 효소는 RNaseH인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제9항에 있어서, 상기 RNA/cDNA 하이브리드를 형성하는 단계는 상기 폴리-dT-하이힐 프라이머에서 폴리-dT를 제외한 하이힐 프라이머 부분은 RNA와 하이브리드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제9항에 있어서, 상기 (e) 단계의 DNA 중합효소는 Tag 폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.

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