JPH08308598A - 遺伝子発現分析方法 - Google Patents
遺伝子発現分析方法Info
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- JPH08308598A JPH08308598A JP8125144A JP12514496A JPH08308598A JP H08308598 A JPH08308598 A JP H08308598A JP 8125144 A JP8125144 A JP 8125144A JP 12514496 A JP12514496 A JP 12514496A JP H08308598 A JPH08308598 A JP H08308598A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 再現性ある結果が得られる遺伝子発現分析方
法であって、希薄な転写産物を検出するのに十分な感度
を有しかつ追加のクローニング段階なしに増幅産物の同
定が可能になる方法を提供する。 【解決手段】 下記段階を特徴とする遺伝子ファミリー
のメンバーの遺伝子発現の応差的分析方法。 (ａ) 分析すべき組織サンプルからのｍＲＮＡ分子の単
離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の
合成、(ｃ) 遺伝子ファミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ
第１鎖分子の選択的増幅であって、該遺伝子ファミリー
内の保存ドメインとハイブリダイズすることができる配
列を有するオリゴヌクレオチドである該遺伝子ファミリ
ーに特異的な少なくとも１のプライマーが用いられる選
択的増幅、及び該増幅産物の標識、(ｄ) 制限エンドヌ
クレアーゼでの開裂による該増幅産物の転写産物特異的
短縮化、(ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分
離、及び(ｈ) 該分離増幅産物の分析。
法であって、希薄な転写産物を検出するのに十分な感度
を有しかつ追加のクローニング段階なしに増幅産物の同
定が可能になる方法を提供する。 【解決手段】 下記段階を特徴とする遺伝子ファミリー
のメンバーの遺伝子発現の応差的分析方法。 (ａ) 分析すべき組織サンプルからのｍＲＮＡ分子の単
離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の
合成、(ｃ) 遺伝子ファミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ
第１鎖分子の選択的増幅であって、該遺伝子ファミリー
内の保存ドメインとハイブリダイズすることができる配
列を有するオリゴヌクレオチドである該遺伝子ファミリ
ーに特異的な少なくとも１のプライマーが用いられる選
択的増幅、及び該増幅産物の標識、(ｄ) 制限エンドヌ
クレアーゼでの開裂による該増幅産物の転写産物特異的
短縮化、(ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分
離、及び(ｈ) 該分離増幅産物の分析。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的遺伝子発現
分析方法並びに遺伝子ファミリーのメンバーの発現の示
差的分析方法に関する。
分析方法並びに遺伝子ファミリーのメンバーの発現の示
差的分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】膨大な数の生物学的プロセスについての
分子的基礎は、細胞、器官又は生物内の特定の遺伝子又
は遺伝子グループの協調された活性化又は不活性化であ
る。このプロセスでは、細胞、器官又は生物は、特有の
発現状況により特徴付けられる特定の生理的状態、分化
の度合い及び一定の外的影響の状態にある。この発現状
況、即ち全ての遺伝子又は特定の遺伝子グループの活性
化の度合いの知見は、多くの生物学的疑問に答えるのに
鍵となる重要なものである。従って、発現状況について
の情報を得るために意図される方法の狙いとするところ
は、一方では全ての遺伝子の活性並びに遺伝子の特定の
サブセットの活性を測定することである。特に、遺伝子
ファミリーがサブセットとして考慮される。遺伝子ファ
ミリーは、細胞内で遺伝子産物が請け負う特定のタイプ
の働きによりしばしば機能的に特徴付けられ、そして１
又は幾つかの共通の保存領域 (ドメイン) を構造的に有
するところの遺伝子のグループである。遺伝子ファミリ
ーの例は、ＭＡＤＳ−ボックス及びホメオボックス遺伝
子ファミリー並びに更なる転写因子ファミリーである。
サイクリン、サイトカイン及びグロビン遺伝子ファミリ
ーは、医学的に興味あるものの例である。
分子的基礎は、細胞、器官又は生物内の特定の遺伝子又
は遺伝子グループの協調された活性化又は不活性化であ
る。このプロセスでは、細胞、器官又は生物は、特有の
発現状況により特徴付けられる特定の生理的状態、分化
の度合い及び一定の外的影響の状態にある。この発現状
況、即ち全ての遺伝子又は特定の遺伝子グループの活性
化の度合いの知見は、多くの生物学的疑問に答えるのに
鍵となる重要なものである。従って、発現状況について
の情報を得るために意図される方法の狙いとするところ
は、一方では全ての遺伝子の活性並びに遺伝子の特定の
サブセットの活性を測定することである。特に、遺伝子
ファミリーがサブセットとして考慮される。遺伝子ファ
ミリーは、細胞内で遺伝子産物が請け負う特定のタイプ
の働きによりしばしば機能的に特徴付けられ、そして１
又は幾つかの共通の保存領域 (ドメイン) を構造的に有
するところの遺伝子のグループである。遺伝子ファミリ
ーの例は、ＭＡＤＳ−ボックス及びホメオボックス遺伝
子ファミリー並びに更なる転写因子ファミリーである。
サイクリン、サイトカイン及びグロビン遺伝子ファミリ
ーは、医学的に興味あるものの例である。
【０００３】遺伝子の発現状況の分析は先行技術から既
知である。示差的表示ＲＴ−ＰＣＲ(differential disp
lay RT-PCR) (ＤＤＲＴ) が示差的遺伝子発現の分析方
法の例であって、その方法では、組織からのｍＲＮＡが
３’延長部分 (好ましくは２塩基) を有するｃＤＮＡプ
ライマーを用いることにより、ｃＤＮＡの (好ましくは
１２の) 下位集団への逆転写 (ＲＴ) によって転写され
る。ランダム配列を有する短いプライマー、好ましくは
１０ヌクレオチドの長さのプライマーを用いることによ
り、シーケンシングゲル (sequencing gel) 上で分離す
ることができる転写産物特異長を有するＰＣＲ産物がこ
のｃＤＮＡから生成する。用いられるプライマーの組み
合わせの数が十分に大きいなら、その組織内に存在する
殆ど全ての転写産物を検出することが統計的に可能であ
る。２又は３以上の組織から得られるＰＣＲ産物を１つ
のゲル上に互いに隣り合うように適用するなら、このよ
うにして発現差を直接に表示することが可能である。示
差バンドをゲルから切り取って、再増幅して更なる分析
用にクローン化することができる。
知である。示差的表示ＲＴ−ＰＣＲ(differential disp
lay RT-PCR) (ＤＤＲＴ) が示差的遺伝子発現の分析方
法の例であって、その方法では、組織からのｍＲＮＡが
３’延長部分 (好ましくは２塩基) を有するｃＤＮＡプ
ライマーを用いることにより、ｃＤＮＡの (好ましくは
１２の) 下位集団への逆転写 (ＲＴ) によって転写され
る。ランダム配列を有する短いプライマー、好ましくは
１０ヌクレオチドの長さのプライマーを用いることによ
り、シーケンシングゲル (sequencing gel) 上で分離す
ることができる転写産物特異長を有するＰＣＲ産物がこ
のｃＤＮＡから生成する。用いられるプライマーの組み
合わせの数が十分に大きいなら、その組織内に存在する
殆ど全ての転写産物を検出することが統計的に可能であ
る。２又は３以上の組織から得られるＰＣＲ産物を１つ
のゲル上に互いに隣り合うように適用するなら、このよ
うにして発現差を直接に表示することが可能である。示
差バンドをゲルから切り取って、再増幅して更なる分析
用にクローン化することができる。
【０００４】更に、全てのｍＲＮＡ分子の特定の下位グ
ループ、例えば、特定の遺伝子ファミリーのメンバーの
増幅産物を豊富化するには、遺伝子ファミリーに特異的
な配列を有するプライマーをランダムプライマーと組み
合わせることが可能である。ＤＤＲＴのこの手法は、例
えば、Liang と Pardee (1992) Science 257, 967-971
；Liang ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 3269-327
5；Bauer ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-428
0；Stone と Wharton (1994), Nucleic Acids Res. 22,
2612-2618 ； Wang と Feuerstein (1995) Biotechniq
ues 18, 448-452；WO 93/18176 及び DE 4317414 に記
載されている。
ループ、例えば、特定の遺伝子ファミリーのメンバーの
増幅産物を豊富化するには、遺伝子ファミリーに特異的
な配列を有するプライマーをランダムプライマーと組み
合わせることが可能である。ＤＤＲＴのこの手法は、例
えば、Liang と Pardee (1992) Science 257, 967-971
；Liang ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 3269-327
5；Bauer ら (1993) Nucleic Acids Res. 21, 4272-428
0；Stone と Wharton (1994), Nucleic Acids Res. 22,
2612-2618 ； Wang と Feuerstein (1995) Biotechniq
ues 18, 448-452；WO 93/18176 及び DE 4317414 に記
載されている。
【０００５】しかしながら、ＤＤＲＴのこの実験デザイ
ンには幾つかの欠点がある。例えば、バンドパターンが
しばしば再現性に乏しい。例えば２０塩基の長いランダ
ムプライマーを用いても、この再現性の問題を満足ゆく
まで解決することができない(Ito ら (1994), FEBS Let
t. 351, 231-236) 。加えて、必要なプライマーの組み
合わせの数が大きいため及び反復による再現性を増さな
ければならないという必要性のために、極端に多くの作
業量が必要である。加えて、しばしば高い割合の誤陽性
結果が得られる。更には、多くのＤＤＲＴ実験では希薄
な転写産物を検出できないことも分かっている (Bertio
liら (1995) Nucleic Acids Res. 23, 4520-4523) 。
ンには幾つかの欠点がある。例えば、バンドパターンが
しばしば再現性に乏しい。例えば２０塩基の長いランダ
ムプライマーを用いても、この再現性の問題を満足ゆく
まで解決することができない(Ito ら (1994), FEBS Let
t. 351, 231-236) 。加えて、必要なプライマーの組み
合わせの数が大きいため及び反復による再現性を増さな
ければならないという必要性のために、極端に多くの作
業量が必要である。加えて、しばしば高い割合の誤陽性
結果が得られる。更には、多くのＤＤＲＴ実験では希薄
な転写産物を検出できないことも分かっている (Bertio
liら (1995) Nucleic Acids Res. 23, 4520-4523) 。
【０００６】先行技術に記載された選択されたバンドの
配列分析も、ＤＤＲＴ産物の両末端に同じプライマーが
しばしば傍にある結果、直接に配列分析することが可能
ではなく追加のクローニング段階が必要になるので問題
がある。短いプライマーを用いることに起因して、たと
え２つの異なるプライマーがその産物の傍にあっても、
ＤＤＲＴプライマーに比較して５’側に延びたプライマ
ー分子での更なる再増幅段階が必要である。最後に、ラ
ンダムプライマーを用いることに起因して、細胞の全て
の転写産物が用いたプライマーの組み合わせにより確実
に認識されるようにすることは決して可能ではない。こ
のことは、たとえ多数のプライマーを用いた場合でも、
全ての転写産物をそっくりそのまま検出しようとする実
験並びに遺伝子ファミリーの如き転写産物の下位集団の
分析に向けられた実験に当てはまる。
配列分析も、ＤＤＲＴ産物の両末端に同じプライマーが
しばしば傍にある結果、直接に配列分析することが可能
ではなく追加のクローニング段階が必要になるので問題
がある。短いプライマーを用いることに起因して、たと
え２つの異なるプライマーがその産物の傍にあっても、
ＤＤＲＴプライマーに比較して５’側に延びたプライマ
ー分子での更なる再増幅段階が必要である。最後に、ラ
ンダムプライマーを用いることに起因して、細胞の全て
の転写産物が用いたプライマーの組み合わせにより確実
に認識されるようにすることは決して可能ではない。こ
のことは、たとえ多数のプライマーを用いた場合でも、
全ての転写産物をそっくりそのまま検出しようとする実
験並びに遺伝子ファミリーの如き転写産物の下位集団の
分析に向けられた実験に当てはまる。
【０００７】Songと Osborn は、Plant Molecular Biol
ogy 26 (1994) 1065-1071 に、ＲＴ−ＰＣＲとＲＦＬＰ
(制限断片長多形現象) 分析の技術をお互いに組み合わ
せた植物多倍数体中で同種遺伝子の発現を検査する方法
を記載している。この方法では、ｃＤＮＡをＲＮＡから
逆転写により生成させ、２つの遺伝子特異的プライマー
を用いることにより増幅する。それら増幅産物をエンド
ヌクレアーゼ開裂により転写産物特異的に(transcript-
specifically) 短くし、それらをそれらの長さに応じて
分離し、そして続いてクローニング及び配列分析により
分析する。この方法も、発現産物を同定するには追加の
クローニング段階が必要なことから、低感度であるとい
う欠点を有している。この方法の更なる欠点は、適する
プライマーをデザインするには、分析される遺伝子内の
少なくとも２つの領域上で遺伝子特異的配列情報が利用
可能でなければならない点である。
ogy 26 (1994) 1065-1071 に、ＲＴ−ＰＣＲとＲＦＬＰ
(制限断片長多形現象) 分析の技術をお互いに組み合わ
せた植物多倍数体中で同種遺伝子の発現を検査する方法
を記載している。この方法では、ｃＤＮＡをＲＮＡから
逆転写により生成させ、２つの遺伝子特異的プライマー
を用いることにより増幅する。それら増幅産物をエンド
ヌクレアーゼ開裂により転写産物特異的に(transcript-
specifically) 短くし、それらをそれらの長さに応じて
分離し、そして続いてクローニング及び配列分析により
分析する。この方法も、発現産物を同定するには追加の
クローニング段階が必要なことから、低感度であるとい
う欠点を有している。この方法の更なる欠点は、適する
プライマーをデザインするには、分析される遺伝子内の
少なくとも２つの領域上で遺伝子特異的配列情報が利用
可能でなければならない点である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避すること
ができる遺伝子発現分析方法、特に再現性ある結果が得
られる遺伝子発現分析方法であって、希薄な転写産物を
検出するのに十分な感度を有しかつ追加のクローニング
段階なしに増幅産物の同定が可能になる方法を提供する
ことである。
は、先行技術の欠点を少なくとも部分的に回避すること
ができる遺伝子発現分析方法、特に再現性ある結果が得
られる遺伝子発現分析方法であって、希薄な転写産物を
検出するのに十分な感度を有しかつ追加のクローニング
段階なしに増幅産物の同定が可能になる方法を提供する
ことである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この目的は、下記段階を
特徴とする遺伝子ファミリーのメンバーの遺伝子発現の
示差的分析方法を提供することによる本発明の第１態様
により達成される。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮ
Ａ第１鎖分子の合成、(ｃ) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも１
のプライマーが用いられる選択的増幅、及び該増幅産物
の標識、(ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
での開裂による該増幅産物の転写産物特異的短縮化 (tr
anscript-specific shortening) 、(ｇ) 該増幅産物の
それらの長さに応じた分離、及び(ｈ) 該分離増幅産物
の分析。
特徴とする遺伝子ファミリーのメンバーの遺伝子発現の
示差的分析方法を提供することによる本発明の第１態様
により達成される。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮ
Ａ第１鎖分子の合成、(ｃ) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも１
のプライマーが用いられる選択的増幅、及び該増幅産物
の標識、(ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
での開裂による該増幅産物の転写産物特異的短縮化 (tr
anscript-specific shortening) 、(ｇ) 該増幅産物の
それらの長さに応じた分離、及び(ｈ) 該分離増幅産物
の分析。
【００１０】本発明の第２態様では、下記段階を特徴と
する遺伝子ファミリーのメンバーの発現を分析する更な
る方法が提供される。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮ
Ａ第１鎖分子の合成、(ｃ) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも１
のプライマーが用いられる選択的増幅、(ｄ) １又は幾
つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂による該増幅産
物の転写産物特異的短縮化、(ｅ) 該制限断片の末端へ
のリンカー分子の付加、(ｆ) 該リンカー分子に対して
向けられたプライマー及び遺伝子ファミリー特異的プラ
イマーを用いる、該制限断片の再増幅及び標識、(ｇ)
該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び(ｈ)
該分離再増幅産物の分析。
する遺伝子ファミリーのメンバーの発現を分析する更な
る方法が提供される。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、(ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮ
Ａ第１鎖分子の合成、(ｃ) 興味の対象である遺伝子フ
ァミリーのメンバーの該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増
幅であって、興味の対象である該遺伝子ファミリー内の
保存ドメインとハイブリダイズすることができる配列を
有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混
合物である該遺伝子ファミリーに特異的な少なくとも１
のプライマーが用いられる選択的増幅、(ｄ) １又は幾
つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂による該増幅産
物の転写産物特異的短縮化、(ｅ) 該制限断片の末端へ
のリンカー分子の付加、(ｆ) 該リンカー分子に対して
向けられたプライマー及び遺伝子ファミリー特異的プラ
イマーを用いる、該制限断片の再増幅及び標識、(ｇ)
該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び(ｈ)
該分離再増幅産物の分析。
【００１１】本発明による方法の第１及び第２態様に手
を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーについて
の試験だけでなく、あらゆる任意の転写産物についての
試験を可能にするために、遺伝子ファミリーに特異的な
プライマーを一組のランダムプライマーと置き換える態
様である (ＤＤ法に相当する) 。この態様では、例えば
約１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する縮退ランダム
プライマーが好ましく用いられる。これら縮退ランダム
プライマーは、８〜１２ヌクレオチドの長い非縮退プラ
イマーと統計的に同じほど頻繁にＤＮＡ鋳型に結合する
には、特に好ましくは、十分に高い度合いの縮退を有す
る。このランダムプライマーの縮退の度合いは、オリゴ
ヌクレオチド混合物を用いることにより及び／又はイノ
シンの如きヌクレオチドとハイブリダイズする縮退を取
り込むことにより達成することができる。
を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーについて
の試験だけでなく、あらゆる任意の転写産物についての
試験を可能にするために、遺伝子ファミリーに特異的な
プライマーを一組のランダムプライマーと置き換える態
様である (ＤＤ法に相当する) 。この態様では、例えば
約１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する縮退ランダム
プライマーが好ましく用いられる。これら縮退ランダム
プライマーは、８〜１２ヌクレオチドの長い非縮退プラ
イマーと統計的に同じほど頻繁にＤＮＡ鋳型に結合する
には、特に好ましくは、十分に高い度合いの縮退を有す
る。このランダムプライマーの縮退の度合いは、オリゴ
ヌクレオチド混合物を用いることにより及び／又はイノ
シンの如きヌクレオチドとハイブリダイズする縮退を取
り込むことにより達成することができる。
【００１２】本発明の方法の第１および第２の態様にさ
らに手を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーの
みならず可能性のある転写産物を検出するために、増幅
の第１ラウンドの間に、遺伝子ファミリーに特異的なプ
ライマーを、前記ｍＲＮＡの５’末端又は前記ｃＤＮＡ
の３’末端にそれぞれ付加された特定の配列に対して向
けられたプライマーで置き換えることである。この態様
においては、ｍＲＮＡからキャップ構造を除去するのに
続いて、一本鎖連結でｍＲＮＡの５’末端にＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドを連結することが好ましい。該ＲＮＡオ
リゴヌクレオチドは、例えば、２０〜３０塩基の長さを
有してもよく、好ましくは、二本鎖ｃＤＮＡを開裂する
ために使用される制限酵素のための制限部位を持ってい
る。制限段階が完了し、二本鎖リンカー分子の連結が完
了した後、リンカープライマー及び、遺伝子ファミリー
特異的ドメインに対して向けられたプライマーの代わり
に、ｃＤＮＡプライマーの配列から、あるいは、前記Ｒ
ＮＡオリゴヌクレオチドの配列から誘導されるプライマ
ーを再増幅に用いる。
らに手を加えた態様は、遺伝子ファミリーのメンバーの
みならず可能性のある転写産物を検出するために、増幅
の第１ラウンドの間に、遺伝子ファミリーに特異的なプ
ライマーを、前記ｍＲＮＡの５’末端又は前記ｃＤＮＡ
の３’末端にそれぞれ付加された特定の配列に対して向
けられたプライマーで置き換えることである。この態様
においては、ｍＲＮＡからキャップ構造を除去するのに
続いて、一本鎖連結でｍＲＮＡの５’末端にＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドを連結することが好ましい。該ＲＮＡオ
リゴヌクレオチドは、例えば、２０〜３０塩基の長さを
有してもよく、好ましくは、二本鎖ｃＤＮＡを開裂する
ために使用される制限酵素のための制限部位を持ってい
る。制限段階が完了し、二本鎖リンカー分子の連結が完
了した後、リンカープライマー及び、遺伝子ファミリー
特異的ドメインに対して向けられたプライマーの代わり
に、ｃＤＮＡプライマーの配列から、あるいは、前記Ｒ
ＮＡオリゴヌクレオチドの配列から誘導されるプライマ
ーを再増幅に用いる。
【００１３】遺伝子発現のそのような一般的分析方法
は、下記段階を含む。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかのサンプルからのｍＲＮ
Ａ分子の単離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅及び該増幅産物の標
識、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (ｈ) 該分離増幅産物の分析。
は、下記段階を含む。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかのサンプルからのｍＲＮ
Ａ分子の単離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅及び該増幅産物の標
識、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (ｈ) 該分離増幅産物の分析。
【００１４】また、遺伝子発現の更に好ましい一般的分
析方法であって、下記段階を特徴とする方法が提供され
る。 (ａ) １又は幾つかのサンプルからのｍＲＮＡ分子の単
離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｅ) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (ｆ) 段階 (ｅ) において付加された該リンカー分子に
対して向けられたプライマー及び (ｉ) 段階 (aa) にお
いて付加された該アンカー配列に対して向けられたプラ
イマー又は (ii) 段階 (ｂ) において用いられたｃＤＮ
Ａプライマー配列に対して向けられたプライマーを用い
る、該制限断片の再増幅及び標識、 (ff) 場合によっては、“繰り込まれた (nested) ”プ
ライマーを用いる第２回目の再増幅及び標識、(fff) 場
合によっては、互いに比較されるべき２つの増幅産物の
プールのサブトラクティブハイブリダイゼーション (su
btractive hybridization)、 (ｇ) 該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (ｈ) 該分離再増幅産物の分析。
析方法であって、下記段階を特徴とする方法が提供され
る。 (ａ) １又は幾つかのサンプルからのｍＲＮＡ分子の単
離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｅ) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (ｆ) 段階 (ｅ) において付加された該リンカー分子に
対して向けられたプライマー及び (ｉ) 段階 (aa) にお
いて付加された該アンカー配列に対して向けられたプラ
イマー又は (ii) 段階 (ｂ) において用いられたｃＤＮ
Ａプライマー配列に対して向けられたプライマーを用い
る、該制限断片の再増幅及び標識、 (ff) 場合によっては、“繰り込まれた (nested) ”プ
ライマーを用いる第２回目の再増幅及び標識、(fff) 場
合によっては、互いに比較されるべき２つの増幅産物の
プールのサブトラクティブハイブリダイゼーション (su
btractive hybridization)、 (ｇ) 該再増幅産物のそれらの長さに応じた分離、 (ｈ) 該分離再増幅産物の分析。
【００１５】本発明による段階 (ａ) は、分析すべきサ
ンプル、例えば、動物、植物又は微生物から誘導するこ
とができる組織サンプルからのｍＲＮＡ分子の単離を含
む。好ましくは、幾つかの、即ち少なくとも２の組織サ
ンプルで出発して、それら異なる組織サンプルからの遺
伝子発現の示差的分析を行う。ｍＲＮＡの単離は、既知
の方法に従って行うことができる (例えば、Sambrook
ら, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２編
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, の特
に第７章を参照のこと) 。
ンプル、例えば、動物、植物又は微生物から誘導するこ
とができる組織サンプルからのｍＲＮＡ分子の単離を含
む。好ましくは、幾つかの、即ち少なくとも２の組織サ
ンプルで出発して、それら異なる組織サンプルからの遺
伝子発現の示差的分析を行う。ｍＲＮＡの単離は、既知
の方法に従って行うことができる (例えば、Sambrook
ら, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２編
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, の特
に第７章を参照のこと) 。
【００１６】段階 (aa) は、そのｍＲＮＡ分子の５’末
端への選択されたアンカー配列の付加を含む。このアン
カー配列は、好ましくはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含
み、ｍＲＮＡを脱キャップした後にＴ４ＲＮＡリガーゼ
によって一本鎖連結することにより、そのｍＲＮＡ分子
に付加させることができる。この方法では、そのキャッ
プ構造に特異的にハイブリダイズしかつ逆転写段階にお
いてそれ自身の配列に相補的な配列を取り込ませる適当
に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることも可能で
ある。好ましくは、このアンカー配列は、たとえ内部開
裂部位が存在しない場合でも各転写産物の検出を確実に
できるように、後で用いることになる制限酵素のための
開裂部位を含有する。
端への選択されたアンカー配列の付加を含む。このアン
カー配列は、好ましくはＲＮＡオリゴヌクレオチドを含
み、ｍＲＮＡを脱キャップした後にＴ４ＲＮＡリガーゼ
によって一本鎖連結することにより、そのｍＲＮＡ分子
に付加させることができる。この方法では、そのキャッ
プ構造に特異的にハイブリダイズしかつ逆転写段階にお
いてそれ自身の配列に相補的な配列を取り込ませる適当
に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いることも可能で
ある。好ましくは、このアンカー配列は、たとえ内部開
裂部位が存在しない場合でも各転写産物の検出を確実に
できるように、後で用いることになる制限酵素のための
開裂部位を含有する。
【００１７】本発明による方法の段階 (ｂ) は、ｍＲＮ
Ａからの一本鎖ｃＤＮＡ分子の合成を含む。このために
は、好ましくは、オリゴｄＴプライマーをそのｍＲＮＡ
のポリ (Ａ) テールにハイブリダイズさせ、そして逆転
写酵素又はＴｔｈポリメラーゼの如き適当な酵素によっ
て延長させる。このオリゴｄＴプライマーは、５’末端
及び／又は３’末端において延長部分を有することがで
きる。５’末端における延長部分は、例えば、好ましく
は２０〜３０ヌクレオチド、例えば２４ヌクレオチドを
有する任意の配列であってもよい。３’末端における延
長部分は、１又は幾つかのヌクレオチド、好ましくは１
〜３ヌクレオチド、例えば１又は２ヌクレオチドの配列
であってもよい。オリゴｄＴプライマーの代わりに、ｃ
ＤＮＡ合成用のランダムプライマーであって、好ましく
は非常に短く、例えば、長さが６〜１０ヌクレオチドで
あるランダムプライマー、又はそのｍＲＮＡ又は既知の
配列、例えば遺伝子ファミリー特異的ドメインに向けら
れたオリゴヌクレオチドに統計的に十分頻繁に結合する
ために高い度合いの縮重を有するランダムプライマーを
用いることも可能である。
Ａからの一本鎖ｃＤＮＡ分子の合成を含む。このために
は、好ましくは、オリゴｄＴプライマーをそのｍＲＮＡ
のポリ (Ａ) テールにハイブリダイズさせ、そして逆転
写酵素又はＴｔｈポリメラーゼの如き適当な酵素によっ
て延長させる。このオリゴｄＴプライマーは、５’末端
及び／又は３’末端において延長部分を有することがで
きる。５’末端における延長部分は、例えば、好ましく
は２０〜３０ヌクレオチド、例えば２４ヌクレオチドを
有する任意の配列であってもよい。３’末端における延
長部分は、１又は幾つかのヌクレオチド、好ましくは１
〜３ヌクレオチド、例えば１又は２ヌクレオチドの配列
であってもよい。オリゴｄＴプライマーの代わりに、ｃ
ＤＮＡ合成用のランダムプライマーであって、好ましく
は非常に短く、例えば、長さが６〜１０ヌクレオチドで
あるランダムプライマー、又はそのｍＲＮＡ又は既知の
配列、例えば遺伝子ファミリー特異的ドメインに向けら
れたオリゴヌクレオチドに統計的に十分頻繁に結合する
ために高い度合いの縮重を有するランダムプライマーを
用いることも可能である。
【００１８】本発明による方法の段階 (ｃ) はｃＤＮＡ
第２鎖の合成を含む。遺伝子ファミリーのメンバーの発
現を分析するためのこの変法においては、選択された遺
伝子ファミリーのメンバーのｃＤＮＡ分子の選択的増幅
を行う。この増幅は、好ましくは、それぞれの遺伝子フ
ァミリー内に保存された“ファミリー特異的”ドメイン
とハイブリダイズすることができる遺伝子ファミリー特
異的プライマーを用いるＰＣＲ又は他の等温若しくは非
等温増幅方法によって行われる。この遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、縮重塩基であってもよく、イノシ
ンの如き非特異的にハイブリダイズする塩基を含有して
もよく、少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも１５ヌクレオチドの長さを有する。ｃＤＮＡプライ
マーの配列から誘導されるオリゴヌクレオチドを第２プ
ライマー又はリバースプライマーとして用いることがで
きる。このリバースプライマーは、好ましくは、オリゴ
ｄＴプライマーの５’延長部分の配列から誘導される
(Frohman ら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 (1988),
8998-9002 を参照のこと) 。一方、既知のＲＮＡ配列、
例えば、更なる遺伝子ファミリー特異的プライマーに結
合するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして
用いることもできる。
第２鎖の合成を含む。遺伝子ファミリーのメンバーの発
現を分析するためのこの変法においては、選択された遺
伝子ファミリーのメンバーのｃＤＮＡ分子の選択的増幅
を行う。この増幅は、好ましくは、それぞれの遺伝子フ
ァミリー内に保存された“ファミリー特異的”ドメイン
とハイブリダイズすることができる遺伝子ファミリー特
異的プライマーを用いるＰＣＲ又は他の等温若しくは非
等温増幅方法によって行われる。この遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、縮重塩基であってもよく、イノシ
ンの如き非特異的にハイブリダイズする塩基を含有して
もよく、少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも１５ヌクレオチドの長さを有する。ｃＤＮＡプライ
マーの配列から誘導されるオリゴヌクレオチドを第２プ
ライマー又はリバースプライマーとして用いることがで
きる。このリバースプライマーは、好ましくは、オリゴ
ｄＴプライマーの５’延長部分の配列から誘導される
(Frohman ら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 (1988),
8998-9002 を参照のこと) 。一方、既知のＲＮＡ配列、
例えば、更なる遺伝子ファミリー特異的プライマーに結
合するオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして
用いることもできる。
【００１９】段階 (ｃ) と組み合わせて、増幅産物の標
識を行うことも可能である。このためには、用いられる
プライマーの一方又は両方を標識することも、標識した
オリゴヌクレオチドを用いることによって標識を行うこ
ともできる。32Ｐ、33Ｐ又は 35Ｓの如き放射性マーカー
基、並びに蛍光色素、ビオチン又は抗原、例えばジゴキ
シゲニンが標識に適している。この標識は、増幅又は再
増幅産物を鋳型として用いる別のプライマー延長段階
(リニアＰＣＲ (linear PCR)) においても行うことが
できる。一般的遺伝子発現分析のためのこの変法には、
選択的増幅はないが存在する全てのｃＤＮＡ第１鎖分子
の増幅はある。このためには、段階 (aa) において付加
されたアンカー配列に対して向けられたプライマーが好
ましく用いられる。段階(ｂ) において用いられたｃＤ
ＮＡプライマーの配列から誘導されるプライマー、例え
ばそのｃＤＮＡプライマーの５’延長部分に対して向け
られたプライマーが、リバースプライマーとして好まし
く用いられる。最初の増幅ラウンドがこのプライマーの
組み合わせを用いて行われ、数増幅サイクル、例えば１
０増幅サイクルが好ましくは "ロングレンジＰＣＲ (lo
ng range PCR) " 条件下で行われる。
識を行うことも可能である。このためには、用いられる
プライマーの一方又は両方を標識することも、標識した
オリゴヌクレオチドを用いることによって標識を行うこ
ともできる。32Ｐ、33Ｐ又は 35Ｓの如き放射性マーカー
基、並びに蛍光色素、ビオチン又は抗原、例えばジゴキ
シゲニンが標識に適している。この標識は、増幅又は再
増幅産物を鋳型として用いる別のプライマー延長段階
(リニアＰＣＲ (linear PCR)) においても行うことが
できる。一般的遺伝子発現分析のためのこの変法には、
選択的増幅はないが存在する全てのｃＤＮＡ第１鎖分子
の増幅はある。このためには、段階 (aa) において付加
されたアンカー配列に対して向けられたプライマーが好
ましく用いられる。段階(ｂ) において用いられたｃＤ
ＮＡプライマーの配列から誘導されるプライマー、例え
ばそのｃＤＮＡプライマーの５’延長部分に対して向け
られたプライマーが、リバースプライマーとして好まし
く用いられる。最初の増幅ラウンドがこのプライマーの
組み合わせを用いて行われ、数増幅サイクル、例えば１
０増幅サイクルが好ましくは "ロングレンジＰＣＲ (lo
ng range PCR) " 条件下で行われる。
【００２０】本発明による方法の段階 (ｄ) は、１又は
幾つかの制限酵素での開裂による増幅産物の転写産物特
異的短縮化を含む。統計的に高い確率で増幅産物を開裂
する制限酵素又は制限酵素の組み合わせが好ましく用い
られ、ＭｓｅＩ、ＨｉｎｆＩ又はＳａｕ３ＡＩの如き４
塩基認識配列を有する制限酵素が好ましく用いられる。
ＰＣＲ産物を回収することが意図される場合には、段階
(ｅ) として、段階 (ｄ) において生成した制限断片の
末端に二本鎖リンカー又はアダプター分子を連結する。
リンカーの一方の末端は制限酵素により生成した制限断
片の末端とマッチするのに対し、他方の末端は例えば適
当な一本鎖張り出し末端により連結 (自己連結だけでな
く異種連結も) することができないようにデザインされ
た、異なる末端を有するリンカー分子が好ましく用いら
れる。更に、その後の修飾により、例えばその張り出し
末端を充填することにより、これら制限断片末端をそれ
ぞれに用いるリンカー分子の末端に合わせることができ
る。
幾つかの制限酵素での開裂による増幅産物の転写産物特
異的短縮化を含む。統計的に高い確率で増幅産物を開裂
する制限酵素又は制限酵素の組み合わせが好ましく用い
られ、ＭｓｅＩ、ＨｉｎｆＩ又はＳａｕ３ＡＩの如き４
塩基認識配列を有する制限酵素が好ましく用いられる。
ＰＣＲ産物を回収することが意図される場合には、段階
(ｅ) として、段階 (ｄ) において生成した制限断片の
末端に二本鎖リンカー又はアダプター分子を連結する。
リンカーの一方の末端は制限酵素により生成した制限断
片の末端とマッチするのに対し、他方の末端は例えば適
当な一本鎖張り出し末端により連結 (自己連結だけでな
く異種連結も) することができないようにデザインされ
た、異なる末端を有するリンカー分子が好ましく用いら
れる。更に、その後の修飾により、例えばその張り出し
末端を充填することにより、これら制限断片末端をそれ
ぞれに用いるリンカー分子の末端に合わせることができ
る。
【００２１】本発明による方法の段階 (ｆ) は、制限断
片を再増幅すること、及びそれが未だ起こらないことを
条件としてその制限断片を標識することを含む。このた
めには、 (ｉ) リンカーに対して向けられたプライマ
ー、及び (ii) 段階 (aa) においてｍＲＮＡの５’末端
に付加されたアンカーオリゴヌクレオチドの配列に対し
て向けられたプライマー又は段階 (ｂ) において用いら
れたｃＤＮＡプライマーの配列に対して向けられたプラ
イマーを含むプライマーの組み合わせが好ましく用いら
れる。遺伝子ファミリー特異的発現分析の場合には、
(ｉ) 遺伝子ファミリー特異的プライマー、及び (ii)
リンカー分子に対して、アンカーオリゴヌクレオチドに
対して、又はｃＤＮＡプライマーの配列に対して向けら
れたプライマー、を含むプライマーの組み合わせが好ま
しく用いられる。用いられる全てのプライマーは、段階
(ｃ) において先に用いられたプライマーと同一であっ
てもよく、それらの３’末端で１又は幾つかの追加の塩
基の延長部分を有してもよい。更に、遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、そのファミリー特異的ドメイン内
のそれぞれの増幅産物内に位置する部位に対して向けら
れてもよい。再増幅産物の標識は、段階 (ｃ) に記載し
た通りに行われる。
片を再増幅すること、及びそれが未だ起こらないことを
条件としてその制限断片を標識することを含む。このた
めには、 (ｉ) リンカーに対して向けられたプライマ
ー、及び (ii) 段階 (aa) においてｍＲＮＡの５’末端
に付加されたアンカーオリゴヌクレオチドの配列に対し
て向けられたプライマー又は段階 (ｂ) において用いら
れたｃＤＮＡプライマーの配列に対して向けられたプラ
イマーを含むプライマーの組み合わせが好ましく用いら
れる。遺伝子ファミリー特異的発現分析の場合には、
(ｉ) 遺伝子ファミリー特異的プライマー、及び (ii)
リンカー分子に対して、アンカーオリゴヌクレオチドに
対して、又はｃＤＮＡプライマーの配列に対して向けら
れたプライマー、を含むプライマーの組み合わせが好ま
しく用いられる。用いられる全てのプライマーは、段階
(ｃ) において先に用いられたプライマーと同一であっ
てもよく、それらの３’末端で１又は幾つかの追加の塩
基の延長部分を有してもよい。更に、遺伝子ファミリー
特異的プライマーは、そのファミリー特異的ドメイン内
のそれぞれの増幅産物内に位置する部位に対して向けら
れてもよい。再増幅産物の標識は、段階 (ｃ) に記載し
た通りに行われる。
【００２２】蛍光標識プライマーを用いる場合には、蛍
光色を用いてそれぞれのプライマーをコードすることが
できる。例えば、その３’末端において１塩基だけ延長
したプライマーの最端の塩基を幾つかの色、例えば４色
のうちの１色により標識することができる。段階 (ｃ)
においてビオチン標識プライマーを用いる場合には、増
幅産物を再増幅の前にストレプトアビジンでコートした
磁気粒子又はストレプトアビジンでコートした反応容器
に結合させることにより精製することができる。この段
階で得られる約１５０００の異なるＰＣＲ産物を細分割
できるようにするには、 (ファミリー非特異的プライマ
ーを用いるときは) それらＰＣＲプライマーは、好まし
くは、それらの３’末端において延長部分を保持する。
リンカープライマー上の２塩基延長部分は、例えば、リ
バースプライマー上で１６の異なる組み合わせと１塩基
延長 (Ａ、Ｃ又はＧの３種の異なる組み合わせが可能で
ある) を可能にするのに適しているので、異なるプライ
マーの組み合わせで３×１６＝４８の増幅反応を検査す
るべき各サンプルについて行わなければならない。加え
て、この“３’調製物”の代わりとして、リンカープラ
イマーとアンカー配列に対して向けられたプライマーと
を組み合わせることにより、５’において増幅を行うこ
とができる。この変法は、オリゴｄＴ配列を含有するプ
ライマーが必要でないという利点を有する。
光色を用いてそれぞれのプライマーをコードすることが
できる。例えば、その３’末端において１塩基だけ延長
したプライマーの最端の塩基を幾つかの色、例えば４色
のうちの１色により標識することができる。段階 (ｃ)
においてビオチン標識プライマーを用いる場合には、増
幅産物を再増幅の前にストレプトアビジンでコートした
磁気粒子又はストレプトアビジンでコートした反応容器
に結合させることにより精製することができる。この段
階で得られる約１５０００の異なるＰＣＲ産物を細分割
できるようにするには、 (ファミリー非特異的プライマ
ーを用いるときは) それらＰＣＲプライマーは、好まし
くは、それらの３’末端において延長部分を保持する。
リンカープライマー上の２塩基延長部分は、例えば、リ
バースプライマー上で１６の異なる組み合わせと１塩基
延長 (Ａ、Ｃ又はＧの３種の異なる組み合わせが可能で
ある) を可能にするのに適しているので、異なるプライ
マーの組み合わせで３×１６＝４８の増幅反応を検査す
るべき各サンプルについて行わなければならない。加え
て、この“３’調製物”の代わりとして、リンカープラ
イマーとアンカー配列に対して向けられたプライマーと
を組み合わせることにより、５’において増幅を行うこ
とができる。この変法は、オリゴｄＴ配列を含有するプ
ライマーが必要でないという利点を有する。
【００２３】本発明による方法の任意的段階 (ff) は、
“繰り込まれた”プライマー、即ち段階 (ｆ) において
用いたプライマーに比較して１又は２以上の塩基だけそ
れらの３’末端が延長されたプライマーを用いる、段階
(ｆ) において得られた増幅産物の再増幅を含む。この
新たな再増幅は、低濃度で存在する希薄な増幅産物が検
出可能な濃度に増幅され、及びその後に検出されるのを
可能にする (McClellandと Welsh (1994), PCR Methods
Appl. 4, 66-81 ；Ralph ら (1993), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 90, 10710-10714)。
“繰り込まれた”プライマー、即ち段階 (ｆ) において
用いたプライマーに比較して１又は２以上の塩基だけそ
れらの３’末端が延長されたプライマーを用いる、段階
(ｆ) において得られた増幅産物の再増幅を含む。この
新たな再増幅は、低濃度で存在する希薄な増幅産物が検
出可能な濃度に増幅され、及びその後に検出されるのを
可能にする (McClellandと Welsh (1994), PCR Methods
Appl. 4, 66-81 ；Ralph ら (1993), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 90, 10710-10714)。
【００２４】本発明による方法の任意的段階(fff) は、
比較されるべき２つの増幅産物プールのサブトラクティ
ブハイブリダイゼーションを含み、それは周波数がそれ
ら２つのプール間で相違するゲル電気泳動により後で検
査するためだけに行われる。これら産物は初期サンプル
中で示差的(differentially)に発現した遺伝子に相当す
るので特に興味深いものであるが、多くの場合、非示差
的に発現した遺伝子についての情報を有する必要はな
い。サブトラクティブハイブリダイゼーションの方法
は、例えば Bautzと Reilly (1966), Science 151, 328
-330及び Zimmermann ら (1980), Cell 21, 709-715 に
記載されている。そのようなサブトラクティブハイブリ
ダイゼーションを行うには、比較されるべき増幅産物の
プールの一方(ドライバー) を標識し、例えばビオチニ
ル化されたプライマーを用いて例えばビオチニル化を行
ってから、他方のプール (テスター) の欠失とハイブリ
ダイズさせることができる。続いて、その標識されたハ
イブリダイゼーション産物を、例えばビオチン標識の場
合にはストレプトアビジンでコートした磁気粒子に結合
させることによって、分離することができる (例えば、
Wangと Brown (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8, 11505-11509 を参照のこと) 。必要なら、この減数
段階 (subtraction step) を連続して数回行ってもよ
い。次いで、後の検出に利用できる十分な量のＤＮＡを
有するように、溶液中に残っている増幅産物を再度増幅
に付することができる。そのような増幅が減数の後に行
われる場合には、好ましくは検出に適するマーカー基を
この段階までは導入しない。このようにして、例えば、
減数後のハイブリッドを分離するためのビオチン標識
と、断片を可視化するための標識とを区別することが可
能である。
比較されるべき２つの増幅産物プールのサブトラクティ
ブハイブリダイゼーションを含み、それは周波数がそれ
ら２つのプール間で相違するゲル電気泳動により後で検
査するためだけに行われる。これら産物は初期サンプル
中で示差的(differentially)に発現した遺伝子に相当す
るので特に興味深いものであるが、多くの場合、非示差
的に発現した遺伝子についての情報を有する必要はな
い。サブトラクティブハイブリダイゼーションの方法
は、例えば Bautzと Reilly (1966), Science 151, 328
-330及び Zimmermann ら (1980), Cell 21, 709-715 に
記載されている。そのようなサブトラクティブハイブリ
ダイゼーションを行うには、比較されるべき増幅産物の
プールの一方(ドライバー) を標識し、例えばビオチニ
ル化されたプライマーを用いて例えばビオチニル化を行
ってから、他方のプール (テスター) の欠失とハイブリ
ダイズさせることができる。続いて、その標識されたハ
イブリダイゼーション産物を、例えばビオチン標識の場
合にはストレプトアビジンでコートした磁気粒子に結合
させることによって、分離することができる (例えば、
Wangと Brown (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
8, 11505-11509 を参照のこと) 。必要なら、この減数
段階 (subtraction step) を連続して数回行ってもよ
い。次いで、後の検出に利用できる十分な量のＤＮＡを
有するように、溶液中に残っている増幅産物を再度増幅
に付することができる。そのような増幅が減数の後に行
われる場合には、好ましくは検出に適するマーカー基を
この段階までは導入しない。このようにして、例えば、
減数後のハイブリッドを分離するためのビオチン標識
と、断片を可視化するための標識とを区別することが可
能である。
【００２５】本発明による方法のこの変法は“あり”又
は“なし”の発現状態の検出に (より多い過剰の標識Ｄ
ＮＡ，より少ないハイブリダイゼーションサイクル) 並
びに遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュ
レーションの検出に (より少ない過剰の標識ＤＮＡ，よ
り多いハイブリダイゼーションサイクル) 適用すること
ができる (Fargnoliら (1990), Analyt. Biochem. 187,
364-373) 。場合によっては、この減数を行った後に基
準化 (normalization)、即ち種々の濃度の個々の増幅産
物の標識を行うこともできる。この基準化は、後の段階
(ｈ) において、分離した増幅産物の分析、つまり低濃
度で存在する希薄転写産物に該当する増幅産物の検出も
確実にできるようにする。そのような基準化は、減数の
後の増幅の前後又は増幅中に行うことができる。適する
基準化方法は、例えば、Ko (1990) Nucleic Acids Res.
19, 5705-5711に記載されている。
は“なし”の発現状態の検出に (より多い過剰の標識Ｄ
ＮＡ，より少ないハイブリダイゼーションサイクル) 並
びに遺伝子のアップレギュレーション又はダウンレギュ
レーションの検出に (より少ない過剰の標識ＤＮＡ，よ
り多いハイブリダイゼーションサイクル) 適用すること
ができる (Fargnoliら (1990), Analyt. Biochem. 187,
364-373) 。場合によっては、この減数を行った後に基
準化 (normalization)、即ち種々の濃度の個々の増幅産
物の標識を行うこともできる。この基準化は、後の段階
(ｈ) において、分離した増幅産物の分析、つまり低濃
度で存在する希薄転写産物に該当する増幅産物の検出も
確実にできるようにする。そのような基準化は、減数の
後の増幅の前後又は増幅中に行うことができる。適する
基準化方法は、例えば、Ko (1990) Nucleic Acids Res.
19, 5705-5711に記載されている。
【００２６】本発明による方法の段階 (ｇ) は、適当な
システム、例えば電気泳動又はＨＰＬＣによる増幅産物
及び再増幅産物のそれらの長さに応じた分離を含む。変
性又は未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動が特
に好ましい。この分離は、単一の反応混合液で行って
も、互いに比較されるべき幾つかの反応混合液で同時に
行ってもよい。分離した産物の可視化は、導入されるマ
ーカー基に応じて、例えばオートラジオグラフィー、化
学発光、又は染色若しくはＵＶ光での照射による標識分
子の特異的検出により行われる。それら産物は、そのゲ
ル (未処理ゲル又は固定ゲル又は乾燥ゲル) 内で又は適
当な支持体、好ましくはハイブリダイゼーション膜に転
写した後で検出することができる。そのような転写には
直接ブロット電気泳動法が特に適している。検出は、銀
化合物又は適当な染料 (例えば、SYBR Green I) を用い
る非特異的ＤＮＡ染色によっても、又はそれら産物を保
有するハイブリダイゼーション膜を、適するプローブと
ハイブリダイズさせることにより行ってもよい。標識に
蛍光標識を用いるなら、分離と検出を自動配列分析装置
によって行うことも、検出を蛍光ゲルスキャナー又は蛍
光イメージャーによって行うこともできる。
システム、例えば電気泳動又はＨＰＬＣによる増幅産物
及び再増幅産物のそれらの長さに応じた分離を含む。変
性又は未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動が特
に好ましい。この分離は、単一の反応混合液で行って
も、互いに比較されるべき幾つかの反応混合液で同時に
行ってもよい。分離した産物の可視化は、導入されるマ
ーカー基に応じて、例えばオートラジオグラフィー、化
学発光、又は染色若しくはＵＶ光での照射による標識分
子の特異的検出により行われる。それら産物は、そのゲ
ル (未処理ゲル又は固定ゲル又は乾燥ゲル) 内で又は適
当な支持体、好ましくはハイブリダイゼーション膜に転
写した後で検出することができる。そのような転写には
直接ブロット電気泳動法が特に適している。検出は、銀
化合物又は適当な染料 (例えば、SYBR Green I) を用い
る非特異的ＤＮＡ染色によっても、又はそれら産物を保
有するハイブリダイゼーション膜を、適するプローブと
ハイブリダイズさせることにより行ってもよい。標識に
蛍光標識を用いるなら、分離と検出を自動配列分析装置
によって行うことも、検出を蛍光ゲルスキャナー又は蛍
光イメージャーによって行うこともできる。
【００２７】段階 (ｈ) は、分離した増幅産物及び再増
幅産物の分析を含む。この操作では、興味の対象である
バンドを単離することも再度増幅することもできる。新
たに増幅する場合には、段階 (ｆ) による再増幅と同じ
プライマーを用いることができる。バンドは、例えば、
ポリアクリルアミドゲルから、又は分離した産物を転写
した支持体からそれらを切り取るためのメスを用いるこ
とにより分離することができる。続いて、切り取ったバ
ンドをＰＣＲ混合液中でインキュベートして再増幅する
ことができる。この操作で得られた産物は、クローニン
グ段階なしで直接配列決定に用いることができる。サイ
クル配列決定法がこれに特に適している。これまでに用
いたＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして用い
ることができる。また、他の増幅産物により生じるバン
ドの不純物の可能性を排除するために、３’末端を延長
したプライマーを再増幅及び／又は配列決定に用いるこ
とができる。この目的のために用いられるプライマーの
この必要な３’延長は、それらバンドが蛍光標識プライ
マーによって検出される場合、及びその最端の塩基がそ
れらそれぞれの標識によりコードされる異なる蛍光標識
プライマーの混合物が段階 (ｆ) 又は (ff) において用
いられた場合に達成することができる。
幅産物の分析を含む。この操作では、興味の対象である
バンドを単離することも再度増幅することもできる。新
たに増幅する場合には、段階 (ｆ) による再増幅と同じ
プライマーを用いることができる。バンドは、例えば、
ポリアクリルアミドゲルから、又は分離した産物を転写
した支持体からそれらを切り取るためのメスを用いるこ
とにより分離することができる。続いて、切り取ったバ
ンドをＰＣＲ混合液中でインキュベートして再増幅する
ことができる。この操作で得られた産物は、クローニン
グ段階なしで直接配列決定に用いることができる。サイ
クル配列決定法がこれに特に適している。これまでに用
いたＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして用い
ることができる。また、他の増幅産物により生じるバン
ドの不純物の可能性を排除するために、３’末端を延長
したプライマーを再増幅及び／又は配列決定に用いるこ
とができる。この目的のために用いられるプライマーの
この必要な３’延長は、それらバンドが蛍光標識プライ
マーによって検出される場合、及びその最端の塩基がそ
れらそれぞれの標識によりコードされる異なる蛍光標識
プライマーの混合物が段階 (ｆ) 又は (ff) において用
いられた場合に達成することができる。
【００２８】配列決定に用いる前に、それら再増幅産物
の純度を、好ましくは他の変性ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動により点検することができる。所望の増幅
産物とは異なる大きさの増幅産物が存在する場合には、
所望のバンドを再度切り取った後で再増幅することによ
り更なる精製を行うことが可能である。これら再増幅産
物を更にサザン、ノーザン又は in situハイブリダイゼ
ーション実験に用いることもできる。更に、それらが依
然として未知の核酸配列を有することを前提として、そ
れらを用いて適切なライブラリーからマッチングゲノミ
ック又はｃＤＮＡクローンを単離することができる。
の純度を、好ましくは他の変性ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動により点検することができる。所望の増幅
産物とは異なる大きさの増幅産物が存在する場合には、
所望のバンドを再度切り取った後で再増幅することによ
り更なる精製を行うことが可能である。これら再増幅産
物を更にサザン、ノーザン又は in situハイブリダイゼ
ーション実験に用いることもできる。更に、それらが依
然として未知の核酸配列を有することを前提として、そ
れらを用いて適切なライブラリーからマッチングゲノミ
ック又はｃＤＮＡクローンを単離することができる。
【００２９】増幅反応で得られる異なる産物の数がずっ
と少ない場合は、例えば前に用いたプライマーに比較し
て少なくとも１塩基の延長部分をそれらの３’末端にお
いて有する適当な選択プライマーを用いることにより、
個々の産物を全反応液から直接再増幅することができ
る。そのような状況は、特に、段階 (fff)に従って減数
を幾つかの並列混合液中で行った場合に発生するであろ
う。各減数反応液は、僅かな異なる増幅産物、例えば５
〜１０の異なる増幅産物しか含有しないであろう。これ
らそれぞれを減数反応液からの増幅により選択的に個別
に単離するには、前に用いた増幅プライマーに隣接する
幾つかの塩基についての知見が助けとなる。この情報
は、例えば、それぞれが減数の後に行われる増幅用の４
つのプライマーの混合物を用いることにより得ることが
できる。これらプライマーはそれらの３’末端において
４つの可能な塩基のうちの１つにより延長され、そして
その色がプライマーのそれぞれの最端の塩基を明確にコ
ードする蛍光標識を保有している。増幅産物を分離して
ＵＶ光で検査すると、バンドの蛍光色で、対応する産物
中に取り込まれたプライマーであって続いて選択的増幅
に用いることができるプライマーについて演繹を行うの
が可能になる。十分な数のコード可能性 (例えば、
４1 、４2 ＝１６、４3 ＝６４等) を得るためには、適
当な蛍光でコードされたプライマーをそれぞれの場合に
おいて未標識リバースプライマーと幾つかの並行した混
合物に混合して増幅に用いることができる。
と少ない場合は、例えば前に用いたプライマーに比較し
て少なくとも１塩基の延長部分をそれらの３’末端にお
いて有する適当な選択プライマーを用いることにより、
個々の産物を全反応液から直接再増幅することができ
る。そのような状況は、特に、段階 (fff)に従って減数
を幾つかの並列混合液中で行った場合に発生するであろ
う。各減数反応液は、僅かな異なる増幅産物、例えば５
〜１０の異なる増幅産物しか含有しないであろう。これ
らそれぞれを減数反応液からの増幅により選択的に個別
に単離するには、前に用いた増幅プライマーに隣接する
幾つかの塩基についての知見が助けとなる。この情報
は、例えば、それぞれが減数の後に行われる増幅用の４
つのプライマーの混合物を用いることにより得ることが
できる。これらプライマーはそれらの３’末端において
４つの可能な塩基のうちの１つにより延長され、そして
その色がプライマーのそれぞれの最端の塩基を明確にコ
ードする蛍光標識を保有している。増幅産物を分離して
ＵＶ光で検査すると、バンドの蛍光色で、対応する産物
中に取り込まれたプライマーであって続いて選択的増幅
に用いることができるプライマーについて演繹を行うの
が可能になる。十分な数のコード可能性 (例えば、
４1 、４2 ＝１６、４3 ＝６４等) を得るためには、適
当な蛍光でコードされたプライマーをそれぞれの場合に
おいて未標識リバースプライマーと幾つかの並行した混
合物に混合して増幅に用いることができる。
【００３０】更に、本発明による方法に対して多くの変
法が考えられる。例えば、段階 (ｂ) において、第１鎖
ｃＤＮＡの３’末端に特定の核酸配列を供することがで
き、そして遺伝子ファミリー特異的プライマーに加え
て、この特定核酸配列に対して向けられるオリゴヌクレ
オチドをその後の段階 (ｃ) における増幅にリバースプ
ライマーとして用いることができる。この特定核酸配列
は、例えば、好ましくは２０〜３０ヌクレオチドの長さ
を有するホモポリマー又は任意の配列を含む。本発明に
よる方法の更なる変法は、例えば、第１鎖ｃＤＮＡを自
己連結により、例えばＲＮＡリガーゼでの連結反応で、
オリゴマー分子及び／又は環状分子に変換すること、及
び場合によりその３’末端において好ましくは１〜３ヌ
クレオチドの延長部分を有しかつ該ｃＤＮＡプライマー
に少なくとも部分的に相補的である下流方向オリゴヌク
レオチドを、段階 (ｃ) における後の増幅用に、遺伝子
ファミリー特異的プライマーに加えてリバースプライマ
ーとして用いること、を含む。
法が考えられる。例えば、段階 (ｂ) において、第１鎖
ｃＤＮＡの３’末端に特定の核酸配列を供することがで
き、そして遺伝子ファミリー特異的プライマーに加え
て、この特定核酸配列に対して向けられるオリゴヌクレ
オチドをその後の段階 (ｃ) における増幅にリバースプ
ライマーとして用いることができる。この特定核酸配列
は、例えば、好ましくは２０〜３０ヌクレオチドの長さ
を有するホモポリマー又は任意の配列を含む。本発明に
よる方法の更なる変法は、例えば、第１鎖ｃＤＮＡを自
己連結により、例えばＲＮＡリガーゼでの連結反応で、
オリゴマー分子及び／又は環状分子に変換すること、及
び場合によりその３’末端において好ましくは１〜３ヌ
クレオチドの延長部分を有しかつ該ｃＤＮＡプライマー
に少なくとも部分的に相補的である下流方向オリゴヌク
レオチドを、段階 (ｃ) における後の増幅用に、遺伝子
ファミリー特異的プライマーに加えてリバースプライマ
ーとして用いること、を含む。
【００３１】本発明による方法のなお更なる変法は、前
もって増幅することなく、二本鎖ｃＤＮＡ上で段階
(ｄ) における制限開裂を行ってしまう方法である。こ
の操作で、完全な第１鎖ｃＤＮＡの増幅の間に失われる
かも知れない数ｋｂの長さの非常に長い転写産物を失う
のを回避できる。更に、本発明による方法及び以下で更
に説明するこの方法の変法においては、得られるバンド
パターンの再現性を高めるために、用いられるオリゴヌ
クレオチドプライマーが好ましくは少なくとも１５ヌク
レオチド、特に好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド
の長さを有することである。更に、このオリゴヌクレオ
チドプライマーは、合成核酸類似体又は誘導体により、
例えばペプチド性核酸 (ＰＮＡ) により置換することも
できる。但し、それらがそれらの３’末端においてポリ
メラーゼにより受け入れられる３’−ＯＨ基を有するこ
とを条件とする。
もって増幅することなく、二本鎖ｃＤＮＡ上で段階
(ｄ) における制限開裂を行ってしまう方法である。こ
の操作で、完全な第１鎖ｃＤＮＡの増幅の間に失われる
かも知れない数ｋｂの長さの非常に長い転写産物を失う
のを回避できる。更に、本発明による方法及び以下で更
に説明するこの方法の変法においては、得られるバンド
パターンの再現性を高めるために、用いられるオリゴヌ
クレオチドプライマーが好ましくは少なくとも１５ヌク
レオチド、特に好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド
の長さを有することである。更に、このオリゴヌクレオ
チドプライマーは、合成核酸類似体又は誘導体により、
例えばペプチド性核酸 (ＰＮＡ) により置換することも
できる。但し、それらがそれらの３’末端においてポリ
メラーゼにより受け入れられる３’−ＯＨ基を有するこ
とを条件とする。
【００３２】更には、本発明による方法及びその変法に
おいて用いられるオリゴヌクレオチド、即ちアンカーオ
リゴヌクレオチド、ｃＤＮＡプライマー、増幅プライマ
ー等は、制限酵素のための１又は幾つかの認識部位又は
開裂部位を含有することができる。このようにして、末
端の充填をリンカー連結の前に行わなくても、制限酵素
によって開裂されない増幅産物の損失を回避することが
できる。本発明による方法は、既知の示差的表示法に比
較して驚くほどの利点を有する。というのは、この場合
には、増幅反応にとって最適な長さを有する完璧なマッ
チングプライマーが用いられるからである。これにより
この方法の高い再現性がもたらされる。対照的に、しば
しば非常に短いプライマーが用いられかつ結合プライマ
ーのミス対合が認容される先行技術のＤＤ実験では、そ
の方法が一定の方法パラメーター、例えばＰＣＲの間の
アニーリング温度に極端に依存しているので、不十分な
再現性しか達成されない (Bertioliら, 前記文献) 。Ｄ
ＤＲＴ実験で見られるこの乏しい再現性の結果、人工物
それ自体を検出するのに、１回の反応当たり少なくとも
１回又は２回の反復実験が行われなければならない。一
定の確率を有する全ての転写産物の少なくとも大半を検
出するのに多数の異なるプライマーの組み合わせが必要
であること (Bauer ら, 前記文献) と相まって、先行技
術のＤＤＲＴの操作は極端に面倒である。それにもかか
わらず、この方法には、任意のプライマーの統計的結合
特性に起因して、全ての転写産物の検出を請け合うこと
ができる決まった数のプライマーの組み合わせはない。
対照的に、本発明による方法では、反復実験は不必要で
あり、そして完全な検査に要求されるプライマーの組み
合わせの数を検査組織中の転写産物の期待数 (例えば、
１５０００) 及び１増幅反応で見込まれる産物の数 (例
えば、１００) から簡単に計算することができる。この
方法では、各転写産物の検出は、ｃＤＮＡプライマーと
して又はアンカーとして用いられるオリゴヌクレオチド
が段階 (ｄ) において用いられる制限酵素のための開裂
部位を含有するという事実により保証され得る。更に
は、反復反応の省略で、３０又はそれ以上の異なるＲＮ
Ａサンプルを単一ゲル上で検査することが可能となる。
おいて用いられるオリゴヌクレオチド、即ちアンカーオ
リゴヌクレオチド、ｃＤＮＡプライマー、増幅プライマ
ー等は、制限酵素のための１又は幾つかの認識部位又は
開裂部位を含有することができる。このようにして、末
端の充填をリンカー連結の前に行わなくても、制限酵素
によって開裂されない増幅産物の損失を回避することが
できる。本発明による方法は、既知の示差的表示法に比
較して驚くほどの利点を有する。というのは、この場合
には、増幅反応にとって最適な長さを有する完璧なマッ
チングプライマーが用いられるからである。これにより
この方法の高い再現性がもたらされる。対照的に、しば
しば非常に短いプライマーが用いられかつ結合プライマ
ーのミス対合が認容される先行技術のＤＤ実験では、そ
の方法が一定の方法パラメーター、例えばＰＣＲの間の
アニーリング温度に極端に依存しているので、不十分な
再現性しか達成されない (Bertioliら, 前記文献) 。Ｄ
ＤＲＴ実験で見られるこの乏しい再現性の結果、人工物
それ自体を検出するのに、１回の反応当たり少なくとも
１回又は２回の反復実験が行われなければならない。一
定の確率を有する全ての転写産物の少なくとも大半を検
出するのに多数の異なるプライマーの組み合わせが必要
であること (Bauer ら, 前記文献) と相まって、先行技
術のＤＤＲＴの操作は極端に面倒である。それにもかか
わらず、この方法には、任意のプライマーの統計的結合
特性に起因して、全ての転写産物の検出を請け合うこと
ができる決まった数のプライマーの組み合わせはない。
対照的に、本発明による方法では、反復実験は不必要で
あり、そして完全な検査に要求されるプライマーの組み
合わせの数を検査組織中の転写産物の期待数 (例えば、
１５０００) 及び１増幅反応で見込まれる産物の数 (例
えば、１００) から簡単に計算することができる。この
方法では、各転写産物の検出は、ｃＤＮＡプライマーと
して又はアンカーとして用いられるオリゴヌクレオチド
が段階 (ｄ) において用いられる制限酵素のための開裂
部位を含有するという事実により保証され得る。更に
は、反復反応の省略で、３０又はそれ以上の異なるＲＮ
Ａサンプルを単一ゲル上で検査することが可能となる。
【００３３】本発明による方法のＤＤ法に比べた更なる
利点は、全ての検査バンドの示差的発現がノーザン実験
により確認できるという点である。対照的に、先行技術
のＤＤ実験の場合には、得られた全部で１５バンドのう
ちの５バンドしか示差的に発現されることが確認でき
ず、４は誤陽性シグナルを示し、他の６バンドはノーザ
ンブロットで全くシグナルを示さなかった (Liang ら,
前記文献) 。更に、本発明による方法は、１転写産物の
多検出を排除する。これは、非リン酸化オリゴヌクレオ
チドをリンカー調製に用いると、増幅は転写産物の決ま
った領域 (その３’末端、５’末端又はファミリー特異
的ドメイン) とリンカーの間で起こることができるに過
ぎず、２つの連結されたリンカー間では決して起こらな
いという事実の結果である。対照的に、先行技術のＤＤ
ＲＴ実験では、所与の転写産物は異なるプライマーの組
み合わせにより認識され得るので多検出される。かくし
て、例えば１種かつ同一の転写産物が異なる５’プライ
マーと異なる３’プライマーとの組み合わせによって生
じる１５の異なるＤＤＲＴバンドにより表されることに
なる (Linskensら (1995), Nucleic Acids Res. 23, 32
44-3251)。
利点は、全ての検査バンドの示差的発現がノーザン実験
により確認できるという点である。対照的に、先行技術
のＤＤ実験の場合には、得られた全部で１５バンドのう
ちの５バンドしか示差的に発現されることが確認でき
ず、４は誤陽性シグナルを示し、他の６バンドはノーザ
ンブロットで全くシグナルを示さなかった (Liang ら,
前記文献) 。更に、本発明による方法は、１転写産物の
多検出を排除する。これは、非リン酸化オリゴヌクレオ
チドをリンカー調製に用いると、増幅は転写産物の決ま
った領域 (その３’末端、５’末端又はファミリー特異
的ドメイン) とリンカーの間で起こることができるに過
ぎず、２つの連結されたリンカー間では決して起こらな
いという事実の結果である。対照的に、先行技術のＤＤ
ＲＴ実験では、所与の転写産物は異なるプライマーの組
み合わせにより認識され得るので多検出される。かくし
て、例えば１種かつ同一の転写産物が異なる５’プライ
マーと異なる３’プライマーとの組み合わせによって生
じる１５の異なるＤＤＲＴバンドにより表されることに
なる (Linskensら (1995), Nucleic Acids Res. 23, 32
44-3251)。
【００３４】更には、本発明による方法で得られる産物
は、クローニング段階を必要とすることなく、再増幅後
に直接に簡単なやり方で配列決定され得る。この配列決
定は、好ましくは、サイクルシークエンス法 (cycle se
quencing technique) により行われる。この方法は、約
１０ヌクレオチドの長さを有するＤＤ実験で用いられる
プライマーには適していない。更には、先行技術のＤＤ
ＲＴ産物にはしばしば２分子の同じプライマーが傍らに
あり、配列決定用プライマーとしてそれぞれの増幅プラ
イマーを用いることを排除する (Guimaraes ら (1995),
Nucleic AcidsRes. 23, 1832-1833)。
は、クローニング段階を必要とすることなく、再増幅後
に直接に簡単なやり方で配列決定され得る。この配列決
定は、好ましくは、サイクルシークエンス法 (cycle se
quencing technique) により行われる。この方法は、約
１０ヌクレオチドの長さを有するＤＤ実験で用いられる
プライマーには適していない。更には、先行技術のＤＤ
ＲＴ産物にはしばしば２分子の同じプライマーが傍らに
あり、配列決定用プライマーとしてそれぞれの増幅プラ
イマーを用いることを排除する (Guimaraes ら (1995),
Nucleic AcidsRes. 23, 1832-1833)。
【００３５】本発明による方法の更なる利点は、サブト
ラクティブハイブリダイゼーションが段階(fff) におい
て行われることを前提する場合、行わなければならない
個々の反応の数並びに検査しなければならない増幅産物
を大きく減少する点である。先行技術のＤＤ実験を行う
には数百のＰＣＲ調製物が必要で、それらは後で数百の
ポリアクリルアミドゲルのレーンに分離される (Liang
と Pardee,前記文献；Bauer ら, 前記文献) のに対し
て、本発明による方法では、プライマーの共通の結合部
位の配列と比較して、各場合においてプライマーの３’
末端が１又は２塩基だけ延長されたものを段階 (ｆ) で
用いることにより、段階 (ｂ) において生成したｃＤＮ
Ａプールを幾つかの（例えば８又は１２の）サブプール
に細分割することが可能である。次いで、互いに一致す
るサブプールを並列的に減数し、そして各減数産物をそ
れ自体のゲルのレーン内で分析するのである。
ラクティブハイブリダイゼーションが段階(fff) におい
て行われることを前提する場合、行わなければならない
個々の反応の数並びに検査しなければならない増幅産物
を大きく減少する点である。先行技術のＤＤ実験を行う
には数百のＰＣＲ調製物が必要で、それらは後で数百の
ポリアクリルアミドゲルのレーンに分離される (Liang
と Pardee,前記文献；Bauer ら, 前記文献) のに対し
て、本発明による方法では、プライマーの共通の結合部
位の配列と比較して、各場合においてプライマーの３’
末端が１又は２塩基だけ延長されたものを段階 (ｆ) で
用いることにより、段階 (ｂ) において生成したｃＤＮ
Ａプールを幾つかの（例えば８又は１２の）サブプール
に細分割することが可能である。次いで、互いに一致す
るサブプールを並列的に減数し、そして各減数産物をそ
れ自体のゲルのレーン内で分析するのである。
【００３６】“ｃＤＮＡ−ＲＤＡ”(Representational
Difference Analysis of cDNA ；Hubankと Schatz (199
4), Nucleic Acids Res. 22, 5640-5648) の既知方法に
比べると、本発明による方法は幾つかの利点を有する。
第１に、各転写産物は厳密に１の増幅産物により表され
るので、幾つかの転写産物の望ましくない損失並びに１
種かつ同じ転写産物の多検出が回避される。第２に、ｃ
ＤＮＡ−ＲＤＡと比較するだけでなく完全ｃＤＮＡ分子
のサブトラクティブハイブリダイゼーションと比較して
もハイブリダイゼーション反応の複雑さが少ないこと
が、より完全かつより迅速な反応経過をもたらす (Sarg
ent (1987), Methods in Enzymol. 152, 423-432) 。第
３に、本発明による方法の範囲内で与えられる段階が、
希薄な転写産物の検出を可能にする。
Difference Analysis of cDNA ；Hubankと Schatz (199
4), Nucleic Acids Res. 22, 5640-5648) の既知方法に
比べると、本発明による方法は幾つかの利点を有する。
第１に、各転写産物は厳密に１の増幅産物により表され
るので、幾つかの転写産物の望ましくない損失並びに１
種かつ同じ転写産物の多検出が回避される。第２に、ｃ
ＤＮＡ−ＲＤＡと比較するだけでなく完全ｃＤＮＡ分子
のサブトラクティブハイブリダイゼーションと比較して
もハイブリダイゼーション反応の複雑さが少ないこと
が、より完全かつより迅速な反応経過をもたらす (Sarg
ent (1987), Methods in Enzymol. 152, 423-432) 。第
３に、本発明による方法の範囲内で与えられる段階が、
希薄な転写産物の検出を可能にする。
【００３７】更に、ＤＤ産物の配列決定は、同じ大きさ
の汚染性ｃＤＮＡ分子の共存によりしばしば妨害され
る。この理由故に、更なる分析のためにＤＤ産物の複雑
な精製操作が必要となる (Liang と Pardee,前記文献；
Bauer ら, 前記文献；Liら (1994), Nucleic Acids Re
s. 22, 1764-1765)。先行技術のＤＤ法とは対照的に、
本発明による方法は、更に、所与の転写産物のシグナル
強度に関する結果の少なくとも半定量的な分析を可能に
する。このことは、本発明による方法を対照として行わ
れるノーザンハイブリダイゼーションと比較することに
より証明される。
の汚染性ｃＤＮＡ分子の共存によりしばしば妨害され
る。この理由故に、更なる分析のためにＤＤ産物の複雑
な精製操作が必要となる (Liang と Pardee,前記文献；
Bauer ら, 前記文献；Liら (1994), Nucleic Acids Re
s. 22, 1764-1765)。先行技術のＤＤ法とは対照的に、
本発明による方法は、更に、所与の転写産物のシグナル
強度に関する結果の少なくとも半定量的な分析を可能に
する。このことは、本発明による方法を対照として行わ
れるノーザンハイブリダイゼーションと比較することに
より証明される。
【００３８】遺伝子ファミリーの発現分析に本発明によ
る方法を用いる更なる利点は、生成する産物が概してフ
ァミリー特異的ドメイン並びに得られるｃＤＮＡ分子の
分類と同定を可能にするフランキング配列を含有する点
である。対照的に、ＤＤ法の場合には、非常に限られた
値の配列情報しかもたらさない３’非翻訳領域が通常好
ましく得られる。その感度から、本発明による方法は、
興味の対象である転写産物を２，３の又は同数の個々の
細胞から分析するのにも用いることができる。かくし
て、この方法を例えば発生生物学に用いて、新規な遺伝
子を単離すること、興味の対象である遺伝子ファミリー
の新規なメンバーを同定すること、生物の異なるライフ
ステージを厳密に規定すること、及び細胞のライフサイ
クルを検査することができるので、例えば、癌の研究に
おいて正常なライフサイクルからの逸脱を検査すること
ができる。
る方法を用いる更なる利点は、生成する産物が概してフ
ァミリー特異的ドメイン並びに得られるｃＤＮＡ分子の
分類と同定を可能にするフランキング配列を含有する点
である。対照的に、ＤＤ法の場合には、非常に限られた
値の配列情報しかもたらさない３’非翻訳領域が通常好
ましく得られる。その感度から、本発明による方法は、
興味の対象である転写産物を２，３の又は同数の個々の
細胞から分析するのにも用いることができる。かくし
て、この方法を例えば発生生物学に用いて、新規な遺伝
子を単離すること、興味の対象である遺伝子ファミリー
の新規なメンバーを同定すること、生物の異なるライフ
ステージを厳密に規定すること、及び細胞のライフサイ
クルを検査することができるので、例えば、癌の研究に
おいて正常なライフサイクルからの逸脱を検査すること
ができる。
【００３９】更に、本発明は上記の方法の変法に関す
る。これら変法のうちの１つは、一般的発現分析のため
の態様において、ｃＤＮＡ第２鎖合成を他の簡便なやり
方で行うものである。例えば、第２鎖合成用のプライマ
ー結合部位を得るために、一本鎖ｃＤＮＡが末端ヘアピ
ンループを形成する傾向を利用することも、特定核酸配
列、例えばホモポリマー又は一本鎖オリゴヌクレオチド
を第１鎖ｃＤＮＡに付加することもできる (例えば、Sa
mbrookら, 前記文献, 特に第８章；Trouttら (1992), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9823-9825 を参照のこ
と) 。本発明の方法のなお更なる変法は、上記の通り第
１鎖ｃＤＮＡに特定核酸配列が供され、そして段階
(ｃ) の増幅においてその付加された特定核酸配列に対
して向けられたオリゴヌクレオチドが遺伝子ファミリー
プライマーの代わりに第１プライマーとして用いられ、
そしてそのｃＤＮＡプライマーの配列から誘導されたオ
リゴヌクレオチドがリバースプライマーとして用いられ
るものである。このリバースプライマーは、場合により
３’延長部分を有することができる。特定核酸配列は、
ホモポリマー又は任意の配列を含むことができる。この
特定核酸配列は、好ましくは第１鎖ｃＤＮＡに、好まし
くは連結により、例えばＲＮＡリガーゼにより連結され
る。１を越えるオリゴヌクレオチド分子がそのｃＤＮＡ
に連結するのを阻止するために、それをその３’末端に
おいて (例えば、アミノ基の導入により) 修飾すること
ができる。
る。これら変法のうちの１つは、一般的発現分析のため
の態様において、ｃＤＮＡ第２鎖合成を他の簡便なやり
方で行うものである。例えば、第２鎖合成用のプライマ
ー結合部位を得るために、一本鎖ｃＤＮＡが末端ヘアピ
ンループを形成する傾向を利用することも、特定核酸配
列、例えばホモポリマー又は一本鎖オリゴヌクレオチド
を第１鎖ｃＤＮＡに付加することもできる (例えば、Sa
mbrookら, 前記文献, 特に第８章；Trouttら (1992), P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9823-9825 を参照のこ
と) 。本発明の方法のなお更なる変法は、上記の通り第
１鎖ｃＤＮＡに特定核酸配列が供され、そして段階
(ｃ) の増幅においてその付加された特定核酸配列に対
して向けられたオリゴヌクレオチドが遺伝子ファミリー
プライマーの代わりに第１プライマーとして用いられ、
そしてそのｃＤＮＡプライマーの配列から誘導されたオ
リゴヌクレオチドがリバースプライマーとして用いられ
るものである。このリバースプライマーは、場合により
３’延長部分を有することができる。特定核酸配列は、
ホモポリマー又は任意の配列を含むことができる。この
特定核酸配列は、好ましくは第１鎖ｃＤＮＡに、好まし
くは連結により、例えばＲＮＡリガーゼにより連結され
る。１を越えるオリゴヌクレオチド分子がそのｃＤＮＡ
に連結するのを阻止するために、それをその３’末端に
おいて (例えば、アミノ基の導入により) 修飾すること
ができる。
【００４０】本発明による方法のなお更なる変法におい
ては、第１鎖ｃＤＮＡを自己連結により、例えばＲＮＡ
リガーゼで、オリゴマー分子及び／又は環状分子に変換
し、そして段階 (ｃ) における後の増幅において、この
ｃＤＮＡプライマーに対して向けられた２本のオリゴヌ
クレオチドを、その一方は上流に、他方は下流に向けて
いるプライマーとして用いる。制限及び連結段階後の再
増幅は、リンカーに対して向けられたプライマーに加え
て、この上流及び／又は下流プライマーで行うことがで
きる。これら２本のプライマーのそれぞれは、その３’
末端において延長部分を有する。即ち、１又は幾つかの
塩基により延長されている。これら上流及び下流プライ
マーは、増幅の間に両プライマーがハイブリダイゼーシ
ョンするのを回避するために、好ましくは、それらが重
複しないか又は僅かに重複するに過ぎないように選択さ
れる。
ては、第１鎖ｃＤＮＡを自己連結により、例えばＲＮＡ
リガーゼで、オリゴマー分子及び／又は環状分子に変換
し、そして段階 (ｃ) における後の増幅において、この
ｃＤＮＡプライマーに対して向けられた２本のオリゴヌ
クレオチドを、その一方は上流に、他方は下流に向けて
いるプライマーとして用いる。制限及び連結段階後の再
増幅は、リンカーに対して向けられたプライマーに加え
て、この上流及び／又は下流プライマーで行うことがで
きる。これら２本のプライマーのそれぞれは、その３’
末端において延長部分を有する。即ち、１又は幾つかの
塩基により延長されている。これら上流及び下流プライ
マーは、増幅の間に両プライマーがハイブリダイゼーシ
ョンするのを回避するために、好ましくは、それらが重
複しないか又は僅かに重複するに過ぎないように選択さ
れる。
【００４１】サブトラクティブハイブリダイゼーション
に基づく遺伝子の示差的発現分析の公知方法に比較する
と、本発明による方法は向上した再現性により際立って
いるので日常的に用いることができる。この向上した再
現性は、先行技術ではしばしば数千ｂｐまでの長さを有
するｃＤＮＡ分子が用いられ、更には完全なｍＲＮＡ又
はｃＤＮＡが用いられてきたという事実に基づくもので
ある。これら問題は、本発明に従う方法により得られた
増幅産物を分析するためにサブトラクティブハイブリダ
イゼーションを用いる場合には起こらない。これら増幅
産物は先行技術のｃＤＮＡ分子に比較して実質的に短く
されており、またプライマーのデザイン(例えば、他の
点では同一のプライマーについて異なる３’延長部分を
選択すること) のために、増幅産物の１プールを数サブ
プール、例えば８、１２又は１６のサブプールに簡単に
細分割することができる。次いで、互いに一致するサブ
プールを並列的に数することができる。
に基づく遺伝子の示差的発現分析の公知方法に比較する
と、本発明による方法は向上した再現性により際立って
いるので日常的に用いることができる。この向上した再
現性は、先行技術ではしばしば数千ｂｐまでの長さを有
するｃＤＮＡ分子が用いられ、更には完全なｍＲＮＡ又
はｃＤＮＡが用いられてきたという事実に基づくもので
ある。これら問題は、本発明に従う方法により得られた
増幅産物を分析するためにサブトラクティブハイブリダ
イゼーションを用いる場合には起こらない。これら増幅
産物は先行技術のｃＤＮＡ分子に比較して実質的に短く
されており、またプライマーのデザイン(例えば、他の
点では同一のプライマーについて異なる３’延長部分を
選択すること) のために、増幅産物の１プールを数サブ
プール、例えば８、１２又は１６のサブプールに簡単に
細分割することができる。次いで、互いに一致するサブ
プールを並列的に数することができる。
【００４２】本発明のなお更なる主題は、遺伝子の発現
を分析するための、特に本発明による方法に用いるため
の試薬キットである。この試薬キットは、好ましくは空
間的に離れた配置で、下記のものを含む。 (ａ) ｃＤＮＡ第１鎖合成のための酵素、 (ｂ) ｃＤＮＡ第２鎖の合成のための及びＤＮＡ断片の
増幅のための少なくとも１の酵素、 (ｃ) 場合により、少なくとも１の制限酵素、 (ｄ) 場合により、少なくとも１の二本鎖ＤＮＡリンカ
ー分子及び該リンカー分子をＤＮＡ断片に付加するため
の物質、 (ｅ) 場合により、少なくとも１の一本鎖ＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド及び該ＲＮＡオリゴヌクレオチドをｍＲＮ
Ａ分子の５’末端に付加するための物質、 (ｆ) (ｉ) 少なくとも１の遺伝子ファミリー特異的プ
ライマー、 (ii) 少なくとも１のオリゴｄＴヌクレオチ
ド、(iii) 該ＤＮＡリンカー分子の配列から誘導される
少なくとも１のプライマー、 (iv) 該ＲＮＡオリゴヌク
レオチドの配列から誘導されるプライマー、 (ｖ) 一組
のランダムプライマー、 (vi) ３’延長部分及び／又は
５’延長部分を有する (ｉ) 〜 (ｖ) のプライマー、(v
ii) マーカー基を保有する (ｉ) 〜 (vi) のプライマ
ー、及び (viii) 標識のタイプ、例えば、蛍光標識の色
によりコードされる３’延長部分を含有する (vii)のプ
ライマー、を含む群から選ばれる一本鎖核酸プライマー
分子、 (ｇ) 核酸を標識及び検出するための物質、 (ｈ) 場合により、ＲＮアーゼ阻害物質、ヌクレオチ
ド、緩衝液、ストレプトアビジンでコートした反応容器
又は磁気粒子の如き更なる試薬。 このキットの個々の試薬は、必要に応じて別々に得るこ
とができる。これら試薬に加えて、このキットは、それ
ぞれの場合に用いられる酵素に適する緩衝液も含有する
ことができる。
を分析するための、特に本発明による方法に用いるため
の試薬キットである。この試薬キットは、好ましくは空
間的に離れた配置で、下記のものを含む。 (ａ) ｃＤＮＡ第１鎖合成のための酵素、 (ｂ) ｃＤＮＡ第２鎖の合成のための及びＤＮＡ断片の
増幅のための少なくとも１の酵素、 (ｃ) 場合により、少なくとも１の制限酵素、 (ｄ) 場合により、少なくとも１の二本鎖ＤＮＡリンカ
ー分子及び該リンカー分子をＤＮＡ断片に付加するため
の物質、 (ｅ) 場合により、少なくとも１の一本鎖ＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド及び該ＲＮＡオリゴヌクレオチドをｍＲＮ
Ａ分子の５’末端に付加するための物質、 (ｆ) (ｉ) 少なくとも１の遺伝子ファミリー特異的プ
ライマー、 (ii) 少なくとも１のオリゴｄＴヌクレオチ
ド、(iii) 該ＤＮＡリンカー分子の配列から誘導される
少なくとも１のプライマー、 (iv) 該ＲＮＡオリゴヌク
レオチドの配列から誘導されるプライマー、 (ｖ) 一組
のランダムプライマー、 (vi) ３’延長部分及び／又は
５’延長部分を有する (ｉ) 〜 (ｖ) のプライマー、(v
ii) マーカー基を保有する (ｉ) 〜 (vi) のプライマ
ー、及び (viii) 標識のタイプ、例えば、蛍光標識の色
によりコードされる３’延長部分を含有する (vii)のプ
ライマー、を含む群から選ばれる一本鎖核酸プライマー
分子、 (ｇ) 核酸を標識及び検出するための物質、 (ｈ) 場合により、ＲＮアーゼ阻害物質、ヌクレオチ
ド、緩衝液、ストレプトアビジンでコートした反応容器
又は磁気粒子の如き更なる試薬。 このキットの個々の試薬は、必要に応じて別々に得るこ
とができる。これら試薬に加えて、このキットは、それ
ぞれの場合に用いられる酵素に適する緩衝液も含有する
ことができる。
【００４３】更に、以下の図面、配列の説明及び実施例
により本発明を説明する。図１は、遺伝子の一般的発現
分析のための本発明による方法の１つの態様を図示した
ものであり；図２は、遺伝子の一般的発現分析のための
本発明による方法の更なる態様であって、減数段階及び
蛍光でコードされる再増幅用のプライマーの使用を含む
態様を図示したものであり；図３は、遺伝子ファミリー
の発現分析のための本発明による方法の更なる態様を図
示したものであり；図４は、１０の独立した実験により
証明された本発明の方法の再現性を示し；図５は、本発
明による方法を用いて示差的に発現されたＭＡＤＳボッ
クス遺伝子の単離結果を示し；図６は、本発明による方
法により同定された遺伝子をＭＡＤＳボックス遺伝子フ
ァミリーに割り当てた図である。
により本発明を説明する。図１は、遺伝子の一般的発現
分析のための本発明による方法の１つの態様を図示した
ものであり；図２は、遺伝子の一般的発現分析のための
本発明による方法の更なる態様であって、減数段階及び
蛍光でコードされる再増幅用のプライマーの使用を含む
態様を図示したものであり；図３は、遺伝子ファミリー
の発現分析のための本発明による方法の更なる態様を図
示したものであり；図４は、１０の独立した実験により
証明された本発明の方法の再現性を示し；図５は、本発
明による方法を用いて示差的に発現されたＭＡＤＳボッ
クス遺伝子の単離結果を示し；図６は、本発明による方
法により同定された遺伝子をＭＡＤＳボックス遺伝子フ
ァミリーに割り当てた図である。
【００４４】配列番号１は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド
の配列を示し、配列番号２は、プライマーＣＴ２９Ｖの
配列を示し、配列番号３は、プライマーＡＰ２３の配列
を示し、配列番号４は、プライマーＬＴ２０の配列を示
し、配列番号５は、プライマーＬＴ２４の配列を示し、
配列番号６は、プライマーＰＯ３８の配列を示し、配列
番号７は、プライマーＰＯ４１の配列を示し、配列番号
８は、プライマーＰＯ４２の配列を示し、配列番号９
は、プライマーＰＯ４３の配列を示し、配列番号１０
は、プライマーＬＲ３２の配列を示し、配列番号１１
は、プライマーＢＬＴ１８の配列を示し、配列番号１２
は、プライマーＰＯ４６の配列を示し、配列番号１３
は、プライマーＰＯ０９の配列を示し、そして配列番号
１４は、ＭＡＤＳドメインコンセンサス配列を示す。
の配列を示し、配列番号２は、プライマーＣＴ２９Ｖの
配列を示し、配列番号３は、プライマーＡＰ２３の配列
を示し、配列番号４は、プライマーＬＴ２０の配列を示
し、配列番号５は、プライマーＬＴ２４の配列を示し、
配列番号６は、プライマーＰＯ３８の配列を示し、配列
番号７は、プライマーＰＯ４１の配列を示し、配列番号
８は、プライマーＰＯ４２の配列を示し、配列番号９
は、プライマーＰＯ４３の配列を示し、配列番号１０
は、プライマーＬＲ３２の配列を示し、配列番号１１
は、プライマーＢＬＴ１８の配列を示し、配列番号１２
は、プライマーＰＯ４６の配列を示し、配列番号１３
は、プライマーＰＯ０９の配列を示し、そして配列番号
１４は、ＭＡＤＳドメインコンセンサス配列を示す。
【００４５】
【実施例】実施例１： ＲＮＡの単離 インドトウモロコシ (トウモロコシ亜種 mays)、近交系
Ｔ２３２及びブタモトコシ (トウモロコシ亜種 parvigl
umis) Central Balsas品種を温室内で７〜８週間栽培し
た。この時点で、これら植物は Chengら (Am. J. Bot.
70 (1983), 450-462) により定義された発育段階Ｉ及び
Ｊを示した。雄花及び雌花を採取し、液体窒素中で凍結
し、そして Sambrook ら (Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 第２編 (1989), Cold Spring Harbor La
boratory Press) の塩化グアニジニウム単離法に従って
全ＲＮＡを単離するのに用いた。
Ｔ２３２及びブタモトコシ (トウモロコシ亜種 parvigl
umis) Central Balsas品種を温室内で７〜８週間栽培し
た。この時点で、これら植物は Chengら (Am. J. Bot.
70 (1983), 450-462) により定義された発育段階Ｉ及び
Ｊを示した。雄花及び雌花を採取し、液体窒素中で凍結
し、そして Sambrook ら (Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 第２編 (1989), Cold Spring Harbor La
boratory Press) の塩化グアニジニウム単離法に従って
全ＲＮＡを単離するのに用いた。
【００４６】このＲＮＡ調製物の品質をトウモロコシグ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
(ＧＡＰＤＨ) プローブを用いるノーザンハイブリダイ
ゼーション (Sambrookら, 前記文献) によって試験し
た。ゲノミックＤＮＡを除去するために、５０μｇの全
ＲＮＡを１μl のＲＮアーゼ阻害物質ＲＮアシン (RNas
in) (Promega, ４０Ｕ／μl ) 及び５μl のＲＱ１ＲＮ
アーゼ不含ＤＮアーゼ (Promega,１Ｕ／μl ) と共に１
００μl の逆転写酵素 (ＲＴ) 緩衝液 (Frohmanら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 8998-9002) 中
で３７℃で１５分間インキュベートした。それらサンプ
ルをトリス／ＥＤＴＡ (ＴＥ) で飽和したフェノールで
及びクロロホルム／イソアミルアルコール (２４：１)
で抽出してエタノールで析出させた。２００００×ｇで
０℃で３０分間遠心分離した後、その全ＲＮＡを１ mM
ＥＤＴＡ (ｐＨ７．５) 中に溶かした。ポリ (Ａ) + ｍ
ＲＮＡをオリゴ (ｄＴ) ダイナビーズ(Dynal, Oslo) を
用いて単離した。
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
(ＧＡＰＤＨ) プローブを用いるノーザンハイブリダイ
ゼーション (Sambrookら, 前記文献) によって試験し
た。ゲノミックＤＮＡを除去するために、５０μｇの全
ＲＮＡを１μl のＲＮアーゼ阻害物質ＲＮアシン (RNas
in) (Promega, ４０Ｕ／μl ) 及び５μl のＲＱ１ＲＮ
アーゼ不含ＤＮアーゼ (Promega,１Ｕ／μl ) と共に１
００μl の逆転写酵素 (ＲＴ) 緩衝液 (Frohmanら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 8998-9002) 中
で３７℃で１５分間インキュベートした。それらサンプ
ルをトリス／ＥＤＴＡ (ＴＥ) で飽和したフェノールで
及びクロロホルム／イソアミルアルコール (２４：１)
で抽出してエタノールで析出させた。２００００×ｇで
０℃で３０分間遠心分離した後、その全ＲＮＡを１ mM
ＥＤＴＡ (ｐＨ７．５) 中に溶かした。ポリ (Ａ) + ｍ
ＲＮＡをオリゴ (ｄＴ) ダイナビーズ(Dynal, Oslo) を
用いて単離した。
【００４７】実施例２：性依存的遺伝子発現の分析 まずトウモロコシ雄花及び雌花から単離した全ＲＮＡを
脱リン酸化した。このために、５０μｇの析出ＲＮＡ
を、ピロ炭酸ジエチルで処理した４０μl の水 (ＤＥＰ
Ｃ水) 、５μl の１０×ＡＰ緩衝液 (Boehringer Mannh
eim)、１μl の５０ mM ジチオスレイトール及び１．５
μl のＲＮアシン(Promega) の混合物中に溶かした。４
μl のアルカリ性ホスファターゼ (ＡＰ；１Ｕ／μL; B
oehringerMannheim) を加えた後、３７℃で１時間イン
キュベートした。アルカリ性ホスファターゼを不活性化
するため、１μｇのプロテイナーゼＫ(Boehringer Mann
heim) を加えて３７℃で１時間インキュベートした。こ
れらサンプルをＴＥ飽和フェノールで及びクロロホルム
／イソアミルアルコールで上記の通り抽出してエタノー
ルで析出させた。それら析出物を各々４０μl のＤＥＰ
Ｃ水中に溶かした。
脱リン酸化した。このために、５０μｇの析出ＲＮＡ
を、ピロ炭酸ジエチルで処理した４０μl の水 (ＤＥＰ
Ｃ水) 、５μl の１０×ＡＰ緩衝液 (Boehringer Mannh
eim)、１μl の５０ mM ジチオスレイトール及び１．５
μl のＲＮアシン(Promega) の混合物中に溶かした。４
μl のアルカリ性ホスファターゼ (ＡＰ；１Ｕ／μL; B
oehringerMannheim) を加えた後、３７℃で１時間イン
キュベートした。アルカリ性ホスファターゼを不活性化
するため、１μｇのプロテイナーゼＫ(Boehringer Mann
heim) を加えて３７℃で１時間インキュベートした。こ
れらサンプルをＴＥ飽和フェノールで及びクロロホルム
／イソアミルアルコールで上記の通り抽出してエタノー
ルで析出させた。それら析出物を各々４０μl のＤＥＰ
Ｃ水中に溶かした。
【００４８】５μl の１０×ＴＡＰ緩衝液、１．２５μ
l のＲＮアシン、１μl の１００ mM ＡＴＰ及びタバコ
由来の３μl の酸性ピロホスファターゼ (ＴＡＰ；５Ｕ
／μL; Epicentre) を加えた後、脱キャップさせるため
に３７℃で１時間インキュベートした。この反応混合液
をまずフェノールで抽出してから、クロロホルム／イソ
アミルアルコールで抽出してエタノールで析出させた。
続いて、そのＲＮＡを１００μl の溶離緩衝液(Dynal)
中に溶かして、ポリ (Ａ) + ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)
ダイナビーズ(Dynal) を用いて単離した。
l のＲＮアシン、１μl の１００ mM ＡＴＰ及びタバコ
由来の３μl の酸性ピロホスファターゼ (ＴＡＰ；５Ｕ
／μL; Epicentre) を加えた後、脱キャップさせるため
に３７℃で１時間インキュベートした。この反応混合液
をまずフェノールで抽出してから、クロロホルム／イソ
アミルアルコールで抽出してエタノールで析出させた。
続いて、そのＲＮＡを１００μl の溶離緩衝液(Dynal)
中に溶かして、ポリ (Ａ) + ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)
ダイナビーズ(Dynal) を用いて単離した。
【００４９】４．２μl の水で溶離させた後、それを
１．８μl の連結ミックス (３μl の１０×ＲＮＡリガ
ーゼ緩衝液 [Boehringer Mannheim]、０．７５μl のＲ
Ｎアシン、１．５μl の２ mM ＡＴＰ、１．５μl のＴ
４−ＲＮＡリガーゼ [１０Ｕ／μL; Boehringer Mannhe
im] 及び１μl の水中の１μg のアンカーＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド 5'-CAC GAU CUG AGG CCG AUC GAU UCA-3'
から調製したもの) と混合して１６℃で２０時間連結し
た。その連結調製物をエタノールで析出させて、その析
出物を２．８μl のＤＥＰＣ水中に吸収させた。４．３
μl の５×ＲＴ緩衝液 (Boehringer Mannheim)；ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの１μl の２０ m
M 溶液；１μl のｃＤＮＡプライマーＣＴ２９Ｖ (３０
pmol／μl ；5'-ACC TAC GTG CAG AT15V-3', V=G、A 又
は C) ；及び１μl のＭ−ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素 (２０
Ｕ／μL; Boehringer Mannheim)の１．５μl の混合液
を逆転写用に加えて３７℃で１時間続いて４２℃で３０
分間インキュベートした。それら反応液をＴＥ緩衝液で
２０μl にした。
１．８μl の連結ミックス (３μl の１０×ＲＮＡリガ
ーゼ緩衝液 [Boehringer Mannheim]、０．７５μl のＲ
Ｎアシン、１．５μl の２ mM ＡＴＰ、１．５μl のＴ
４−ＲＮＡリガーゼ [１０Ｕ／μL; Boehringer Mannhe
im] 及び１μl の水中の１μg のアンカーＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド 5'-CAC GAU CUG AGG CCG AUC GAU UCA-3'
から調製したもの) と混合して１６℃で２０時間連結し
た。その連結調製物をエタノールで析出させて、その析
出物を２．８μl のＤＥＰＣ水中に吸収させた。４．３
μl の５×ＲＴ緩衝液 (Boehringer Mannheim)；ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの１μl の２０ m
M 溶液；１μl のｃＤＮＡプライマーＣＴ２９Ｖ (３０
pmol／μl ；5'-ACC TAC GTG CAG AT15V-3', V=G、A 又
は C) ；及び１μl のＭ−ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素 (２０
Ｕ／μL; Boehringer Mannheim)の１．５μl の混合液
を逆転写用に加えて３７℃で１時間続いて４２℃で３０
分間インキュベートした。それら反応液をＴＥ緩衝液で
２０μl にした。
【００５０】このようにして得られた各２μl のアンカ
ーｃＤＮＡプールを氷上で２８．５μl の水；５μl の
１０×ＰＣＲ緩衝液 (６７０ mM トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
８．８；１７０ mM (NH4)2SO4 ；１％ツィーン２０) ；
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの１ mM 溶
液を５μl ；８μl の１０ mM MgCl2 ；１μl の水中の
各々０．１pmolのプライマーＣＴ２９Ｖ及びＡＰ２３
(5'-CAC GAT CTG AGG CCG ATC GAT TC-3') ；及び０．
５μl のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ (５Ｕ／μL;Boehri
nger Mannheim) とｃＤＮＡ第２鎖合成及び増幅用に混
合した。これら反応液をパラフィンオイルの層で覆って
９５℃に予熱した Trioblockサーモサイクラー (Biomet
ra) に入れた。始めに９５℃で５分間変性した後、９５
℃で３０秒間の変性、７２℃で２分間のアニーリング及
び延長からなる増幅プログラムを２０サイクル行った。
反応液を QiaQuick カラム(Quiagen) で精製し、２０μ
l のＴＥで溶離を行った。２．３μl の１０×緩衝液Ａ
(Boehringer Mannheim) 及び１μl のＳａｕ３ＡＩ (４
Ｕ／μl ； Boehringer Mannheim) を加えた後、３７℃
で１．５時間開裂させ、それら反応物をエタノールで析
出させた。
ーｃＤＮＡプールを氷上で２８．５μl の水；５μl の
１０×ＰＣＲ緩衝液 (６７０ mM トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
８．８；１７０ mM (NH4)2SO4 ；１％ツィーン２０) ；
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの１ mM 溶
液を５μl ；８μl の１０ mM MgCl2 ；１μl の水中の
各々０．１pmolのプライマーＣＴ２９Ｖ及びＡＰ２３
(5'-CAC GAT CTG AGG CCG ATC GAT TC-3') ；及び０．
５μl のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ (５Ｕ／μL;Boehri
nger Mannheim) とｃＤＮＡ第２鎖合成及び増幅用に混
合した。これら反応液をパラフィンオイルの層で覆って
９５℃に予熱した Trioblockサーモサイクラー (Biomet
ra) に入れた。始めに９５℃で５分間変性した後、９５
℃で３０秒間の変性、７２℃で２分間のアニーリング及
び延長からなる増幅プログラムを２０サイクル行った。
反応液を QiaQuick カラム(Quiagen) で精製し、２０μ
l のＴＥで溶離を行った。２．３μl の１０×緩衝液Ａ
(Boehringer Mannheim) 及び１μl のＳａｕ３ＡＩ (４
Ｕ／μl ； Boehringer Mannheim) を加えた後、３７℃
で１．５時間開裂させ、それら反応物をエタノールで析
出させた。
【００５１】オリゴクレオチドＬＴ２０ (5'-TCA CAT G
CT AAG TCT CGC GA-3') 及びＬＴ２４(5'-GAT CTC GCG
AGA CTT AGC ATG TGA C-3') 各々を１．５nmolずつ５０
μl容量の水中に一緒に混合して９０℃に３分間加熱し
た。二本鎖リンカーを生成させるために、この反応混合
液を５０ mM トリス／ＨＣｌ (ｐＨ７．５) 及び１０mM
MgCl2 に調節して４℃にゆっくり冷却した。析出した
制限断片を Cobianchiと Wilson (Methods Enzymol. 15
2 (1987), 94-110) に従う総容量が４μl の連結混合液
中に吸収させて記載された通りに作った０．５μl のリ
ンカーを加え、そして１６℃で１６時間連結した。未連
結リンカーを QiaQuick カラムで除去した。
CT AAG TCT CGC GA-3') 及びＬＴ２４(5'-GAT CTC GCG
AGA CTT AGC ATG TGA C-3') 各々を１．５nmolずつ５０
μl容量の水中に一緒に混合して９０℃に３分間加熱し
た。二本鎖リンカーを生成させるために、この反応混合
液を５０ mM トリス／ＨＣｌ (ｐＨ７．５) 及び１０mM
MgCl2 に調節して４℃にゆっくり冷却した。析出した
制限断片を Cobianchiと Wilson (Methods Enzymol. 15
2 (1987), 94-110) に従う総容量が４μl の連結混合液
中に吸収させて記載された通りに作った０．５μl のリ
ンカーを加え、そして１６℃で１６時間連結した。未連
結リンカーを QiaQuick カラムで除去した。
【００５２】この精製連結反応液の５分の１を１０μl
の１０×ＰＣＲ緩衝液；１６μl の１０ mM MgCl2 ；５
μl の１ mM ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴ
Ｐ；各々２０pmolずつのＣＴ２９Ｖ及びＬＴ２４と混合
して続く増幅用に１００μlの総容量にした。サーモサ
イクラー中で９５℃に５分間加熱した後、５ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを加えて、９５℃で３０秒間の変
性、７２℃で９０秒間のアニーリング及び延長の条件下
で２０サイクルの増幅を行った。
の１０×ＰＣＲ緩衝液；１６μl の１０ mM MgCl2 ；５
μl の１ mM ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴ
Ｐ；各々２０pmolずつのＣＴ２９Ｖ及びＬＴ２４と混合
して続く増幅用に１００μlの総容量にした。サーモサ
イクラー中で９５℃に５分間加熱した後、５ＵのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを加えて、９５℃で３０秒間の変
性、７２℃で９０秒間のアニーリング及び延長の条件下
で２０サイクルの増幅を行った。
【００５３】各場合において１μl の増幅産物を第２ラ
ウンド増幅に用いた。これを３０μl の総容量で３０サ
イクル行い、かつ各場合においてジゴキシゲニン標識プ
ライマーＤＩＧ−ＣＴ２９Ａ (配列はＣＴ２９Ｖと同一
であるが縮退最端塩基“Ｖ”の代わりに絶対最端塩基
“Ａ”が付いている) 、ＤＩＧ−ＣＴ２９Ｃ又はＤＩＧ
−ＣＴ２９Ｇのうちの１つとＬＴ２４に比較して２塩基
だけ延長された１６の可能なプライマーＬＴ２４ＮＮの
うちの１つとの組み合わせを用いた以外は、上記の条件
に従った。各場合において、３μl の反応液を Promega
からの１．５μlのサイクル続発停止溶液 (cycle seque
ncing stop solution) と混合した。
ウンド増幅に用いた。これを３０μl の総容量で３０サ
イクル行い、かつ各場合においてジゴキシゲニン標識プ
ライマーＤＩＧ−ＣＴ２９Ａ (配列はＣＴ２９Ｖと同一
であるが縮退最端塩基“Ｖ”の代わりに絶対最端塩基
“Ａ”が付いている) 、ＤＩＧ−ＣＴ２９Ｃ又はＤＩＧ
−ＣＴ２９Ｇのうちの１つとＬＴ２４に比較して２塩基
だけ延長された１６の可能なプライマーＬＴ２４ＮＮの
うちの１つとの組み合わせを用いた以外は、上記の条件
に従った。各場合において、３μl の反応液を Promega
からの１．５μlのサイクル続発停止溶液 (cycle seque
ncing stop solution) と混合した。
【００５４】次いで、比較されるべき互いの組織に対応
する調製物を変性３．５％ポリアクリルアミドゲルの２
つのレーン上に互いに隣り合わせて載せた。ＤＩＧ標識
ＤＮＡ分子量マーカー VIII (Boehringer Mannheim) を
長さスタンダードとして空いているレーン上に載せた。
この電気泳動分離及びナイロン膜への転写は、ＧＡＴＣ
１５００配列分析装置(MWG Biotech) によってメーカー
の使用説明書に従って行った。ナイロン膜をメーカーの
使用説明書に従って核酸の化学発光検出用に非固定状態
で処理した。Ｘ線フィルム (Kodak X-Omat) を露光した
後、これら膜とフィルムを合わせ、そして示差バンドを
メスで膜から切り取った。それぞれの膜片を５０μl の
再増幅反応液中で上記の条件下でインキュベートし、３
０〜４０サイクルを用いた。この増幅がうまくいったこ
と及びその増幅産物の純度をアガロースゲル電気泳動に
よって点検した。
する調製物を変性３．５％ポリアクリルアミドゲルの２
つのレーン上に互いに隣り合わせて載せた。ＤＩＧ標識
ＤＮＡ分子量マーカー VIII (Boehringer Mannheim) を
長さスタンダードとして空いているレーン上に載せた。
この電気泳動分離及びナイロン膜への転写は、ＧＡＴＣ
１５００配列分析装置(MWG Biotech) によってメーカー
の使用説明書に従って行った。ナイロン膜をメーカーの
使用説明書に従って核酸の化学発光検出用に非固定状態
で処理した。Ｘ線フィルム (Kodak X-Omat) を露光した
後、これら膜とフィルムを合わせ、そして示差バンドを
メスで膜から切り取った。それぞれの膜片を５０μl の
再増幅反応液中で上記の条件下でインキュベートし、３
０〜４０サイクルを用いた。この増幅がうまくいったこ
と及びその増幅産物の純度をアガロースゲル電気泳動に
よって点検した。
【００５５】実施例３：性依存的ＭＡＤＳボックス遺伝
子発現の分析 実施例１で雄花及び雌花から単離したｍＲＮＡをＲＡＣ
Ｅ手順 (Frohman ら,前記文献) に従って一本鎖ｃＤＮ
Ａに変換してｃＤＮＡプールを得た。Frohmanらの前記
文献に記載されたＲＡＣＥアダプタープライマー及び遺
伝子ファミリー特異的ＭＡＤＳボックスプライマーの混
合物を用いて、このｃＤＮＡプールでＰＣＲを行った。
全てのＭＡＤＳボックスプライマーは、高度に保存され
たアミノ酸モチーフの誘導体をコードしかつ植物から知
られている全ての変異を含む遺伝子ファミリー特異的配
列に対して向けられたものであった。最高の特異性を達
成するために、縮退の度合いをできるだけ低く抑えた。
この明細書で用いたプライマーは次の通りである。ＰＯ
３８ (アミノ酸配列 "IKRIEN" に対して向けられたも
の) ，5'-GAT CAA G(A/C)G (G/C)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ
４１ ("MKRIEN"に対するもの) ，5'-GAT GAAG(A/C)G (G
/C)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ４２ ("IKHIEN"に対するもの)
，5'-GAT CAA GCA (C/T)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ４３
("IKKIEN"に対するもの) ，5'-GAT CAAGAA GAT CGA GAA
-3' 。
子発現の分析 実施例１で雄花及び雌花から単離したｍＲＮＡをＲＡＣ
Ｅ手順 (Frohman ら,前記文献) に従って一本鎖ｃＤＮ
Ａに変換してｃＤＮＡプールを得た。Frohmanらの前記
文献に記載されたＲＡＣＥアダプタープライマー及び遺
伝子ファミリー特異的ＭＡＤＳボックスプライマーの混
合物を用いて、このｃＤＮＡプールでＰＣＲを行った。
全てのＭＡＤＳボックスプライマーは、高度に保存され
たアミノ酸モチーフの誘導体をコードしかつ植物から知
られている全ての変異を含む遺伝子ファミリー特異的配
列に対して向けられたものであった。最高の特異性を達
成するために、縮退の度合いをできるだけ低く抑えた。
この明細書で用いたプライマーは次の通りである。ＰＯ
３８ (アミノ酸配列 "IKRIEN" に対して向けられたも
の) ，5'-GAT CAA G(A/C)G (G/C)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ
４１ ("MKRIEN"に対するもの) ，5'-GAT GAAG(A/C)G (G
/C)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ４２ ("IKHIEN"に対するもの)
，5'-GAT CAA GCA (C/T)AT CGA GAA-3' ；ＰＯ４３
("IKKIEN"に対するもの) ，5'-GAT CAAGAA GAT CGA GAA
-3' 。
【００５６】プライマーＰＯ３８を用いて次の通りに増
幅を行った。まず最初に６７ mM トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
８．８；１７ mM (NH4)2SO4 ；０．１％ツィーン２０；
０．８ mM MgCl2 ；各々２０μl ずつのｄＮＴＰ；１．
５pmolのプライマーＰＯ３８；及び１μl のそれぞれの
ｃＤＮＡプールを含有する５０μl の反応混合液を一緒
に氷の上にピペッティングした。パラフィンオイルの層
で覆った後、これら反応混合液を Trioblockサーモサイ
クラー(Biometra, Gottingen) 中で９５℃に５分間加熱
した。６５℃に冷やした後、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ(Boehringer Mannheim) を加えた。９５℃で
３０秒間の変性、５４℃で１００秒間のアニーリング、
７２℃で２分間の延長からなるパラメーターを用いて３
０サイクルのリニア増幅 (linear amplification) を行
った。続いてこれら反応混合液を６５℃に冷やした。
幅を行った。まず最初に６７ mM トリス／ＨＣｌ，ｐＨ
８．８；１７ mM (NH4)2SO4 ；０．１％ツィーン２０；
０．８ mM MgCl2 ；各々２０μl ずつのｄＮＴＰ；１．
５pmolのプライマーＰＯ３８；及び１μl のそれぞれの
ｃＤＮＡプールを含有する５０μl の反応混合液を一緒
に氷の上にピペッティングした。パラフィンオイルの層
で覆った後、これら反応混合液を Trioblockサーモサイ
クラー(Biometra, Gottingen) 中で９５℃に５分間加熱
した。６５℃に冷やした後、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ(Boehringer Mannheim) を加えた。９５℃で
３０秒間の変性、５４℃で１００秒間のアニーリング、
７２℃で２分間の延長からなるパラメーターを用いて３
０サイクルのリニア増幅 (linear amplification) を行
った。続いてこれら反応混合液を６５℃に冷やした。
【００５７】指数関数的増幅のために、１００μM の諸
ｄＮＴＰ、１５pmolのＲＡＣＥアダプタープライマー及
びプライマーＰＯ３８と２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを含有する６５℃に予熱した５０μl の反応混合
液をこのリニア増幅反応液に加えた。次いで、上記のパ
ラメーターを用いてＰＣＲを２４サイクル行った後、続
いて７２℃で１０分間延長を行った。それらＰＣＲ産物
を QiaQuick カラム(Quiagen, Hilden) で精製した。１
／５ (１０μl ) の溶離液を１５Ｕの制限酵素ＭｓｅＩ
(New England Biolads)、ＨｉｎｆＩ又はＳａｕ３ＡＩ
(Boehringer Mannheim) と共にそれぞれの制限緩衝液中
で３７℃で３時間インキュベートした。続いて６５℃で
１０分間インキュベートした後、核酸をエタノールで析
出させ、遠心分離 (３０分間、４℃で２００００×ｇ)
により単離した。その残渣を５μl のＴＥ中に再懸濁さ
せた。
ｄＮＴＰ、１５pmolのＲＡＣＥアダプタープライマー及
びプライマーＰＯ３８と２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを含有する６５℃に予熱した５０μl の反応混合
液をこのリニア増幅反応液に加えた。次いで、上記のパ
ラメーターを用いてＰＣＲを２４サイクル行った後、続
いて７２℃で１０分間延長を行った。それらＰＣＲ産物
を QiaQuick カラム(Quiagen, Hilden) で精製した。１
／５ (１０μl ) の溶離液を１５Ｕの制限酵素ＭｓｅＩ
(New England Biolads)、ＨｉｎｆＩ又はＳａｕ３ＡＩ
(Boehringer Mannheim) と共にそれぞれの制限緩衝液中
で３７℃で３時間インキュベートした。続いて６５℃で
１０分間インキュベートした後、核酸をエタノールで析
出させ、遠心分離 (３０分間、４℃で２００００×ｇ)
により単離した。その残渣を５μl のＴＥ中に再懸濁さ
せた。
【００５８】所望により、以下に記載する通りに放射性
プライマー延長反応をこの段階で行ってもよい。一方、
以下に記載する通りに再増幅用にリンカー連結を行って
もよい。このためには、１／２μl の再懸濁制限断片を
１０μl の充填用混合液 (５０ mM トリス／ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０；６ mM MgCl2 ；１０ mM ジチオスレイトー
ル；各々１００μＭずつのｄＮＴＰ；１ｍＬ当たり４０
μｇのウシ胎児血清アルブミン；０．５Ｕ Ｔ４−ＤＮ
Ａポリメラーゼ (Boehringer Mannheim)) 中で３７℃で
１時間インキュベートした。次いで、それら断片をエタ
ノールで析出させて上記の通りに単離した。そのペレッ
トを２μl のＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。各々１．２
５nmolずつのオリゴヌクレオチドＬＲ３２ (5'-ACT CGA
TTC TCA ACC CGA AAG TAT AGA TCC CA-3') 及びＢＴＬ
１８(5'-TGG GAT CTA TAC TTT CAA-3') から実施例２の
通りに二本鎖リンカーを調製した。実施例２に記載した
通りにこれらリンカーを末端を充填したこれら制限断片
に連結した。この操作では、各場合において、０．５μ
l のリンカーと２μl の再懸濁末端充填反応液を４μl
の連結緩衝液中でインキュベートした。未連結リンカー
は QiaQuick カラムで除去した。
プライマー延長反応をこの段階で行ってもよい。一方、
以下に記載する通りに再増幅用にリンカー連結を行って
もよい。このためには、１／２μl の再懸濁制限断片を
１０μl の充填用混合液 (５０ mM トリス／ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０；６ mM MgCl2 ；１０ mM ジチオスレイトー
ル；各々１００μＭずつのｄＮＴＰ；１ｍＬ当たり４０
μｇのウシ胎児血清アルブミン；０．５Ｕ Ｔ４−ＤＮ
Ａポリメラーゼ (Boehringer Mannheim)) 中で３７℃で
１時間インキュベートした。次いで、それら断片をエタ
ノールで析出させて上記の通りに単離した。そのペレッ
トを２μl のＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。各々１．２
５nmolずつのオリゴヌクレオチドＬＲ３２ (5'-ACT CGA
TTC TCA ACC CGA AAG TAT AGA TCC CA-3') 及びＢＴＬ
１８(5'-TGG GAT CTA TAC TTT CAA-3') から実施例２の
通りに二本鎖リンカーを調製した。実施例２に記載した
通りにこれらリンカーを末端を充填したこれら制限断片
に連結した。この操作では、各場合において、０．５μ
l のリンカーと２μl の再懸濁末端充填反応液を４μl
の連結緩衝液中でインキュベートした。未連結リンカー
は QiaQuick カラムで除去した。
【００５９】次いで、５μl の精製連結混合液を鋳型と
して用いて上記のＰＣＲ条件下で再増幅を全部で１５サ
イクル行った。それぞれのＭＡＤＳボックスプライマー
(例えば、ＰＯ３８) を "fmolＤＮＡ配列分析システ
ム" (Promega) に同封されている使用説明書に従って32
Ｐで標識した。次いで、１／２μl のその再増幅産物を
用いて、５０μＭの諸ｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ及び０．４μl の標識ＭＡＤＳボックスプラ
イマーを含有する１０μl のプライマー延長混合液を調
製した。これら反応混合液を予熱 (９５℃) サーモサイ
クラーのウェルに入れて始めに９５℃で３分間変性した
後、９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間及び７２℃で
１分間からなるプログラムを３０サイクル行った。最終
延長後、Promega からの５μl のサイクル続発停止溶液
を加えた。"Sequamark" １０ｂｐラダー (10 bp ladde
r) (Research Genetics, Huntsville, AL) を長さスタ
ンダードとして調製した。ゲル電気泳動分析用に、この
延長混合液を７０℃に２分間加熱して２μl を変性５％
アクリルアミドゲルに適用した。これらゲルを４５Ｗで
３時間流し、５％酢酸／１０％エタノール中に固定し、
そして風乾した。次いで、これらゲルを Kodak X-Omat
Ｘ線フィルム上で４〜１２時間Ｘ線に曝した。実施例３
で行った反応手順を図３に図示した。
して用いて上記のＰＣＲ条件下で再増幅を全部で１５サ
イクル行った。それぞれのＭＡＤＳボックスプライマー
(例えば、ＰＯ３８) を "fmolＤＮＡ配列分析システ
ム" (Promega) に同封されている使用説明書に従って32
Ｐで標識した。次いで、１／２μl のその再増幅産物を
用いて、５０μＭの諸ｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ及び０．４μl の標識ＭＡＤＳボックスプラ
イマーを含有する１０μl のプライマー延長混合液を調
製した。これら反応混合液を予熱 (９５℃) サーモサイ
クラーのウェルに入れて始めに９５℃で３分間変性した
後、９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間及び７２℃で
１分間からなるプログラムを３０サイクル行った。最終
延長後、Promega からの５μl のサイクル続発停止溶液
を加えた。"Sequamark" １０ｂｐラダー (10 bp ladde
r) (Research Genetics, Huntsville, AL) を長さスタ
ンダードとして調製した。ゲル電気泳動分析用に、この
延長混合液を７０℃に２分間加熱して２μl を変性５％
アクリルアミドゲルに適用した。これらゲルを４５Ｗで
３時間流し、５％酢酸／１０％エタノール中に固定し、
そして風乾した。次いで、これらゲルを Kodak X-Omat
Ｘ線フィルム上で４〜１２時間Ｘ線に曝した。実施例３
で行った反応手順を図３に図示した。
【００６０】実施例４：ブタモトコシとトウモロコシ間
のＭＡＤＳボックス遺伝子発現の比較 実施例１でトウモロコシとブタモトコシの雌花から単離
したＤＮＡを実施例３に記載した通りに第１鎖ｃＤＮＡ
に変換して転写産物特異長の増幅産物の合成に用いた。
この操作では、この場合にはそれらの５’末端にビオチ
ン基を保有するオリゴヌクレオチドＰＯ３８、ＰＯ４
１、ＰＯ４２及びＰＯ４３の混合物を、ＭＡＤＳボック
ス遺伝子ファミリーのメンバーに相当するｃＤＮＡ分子
の選択的増幅に用いた。制限酵素としてのＭｓｅＩと共
にインキュベートした後、これらビオチン標識延長産物
をストレプトアビジン被覆磁気粒子(Dynal) によって分
離して、実施例２及び３に記載した通りにリンカーの連
結に用いた。オリゴヌクレオチドＰＯ４６ 5'-(A/C)G(G
/C)CAG GT(G/C) AC(C/G) T(A/T)C-3' ("RQVT(F/Y)"に対
して向けられたもの) を再増幅に用いた。こうして得ら
れた増幅産物を記載された通りに放射性標識して６％配
列分析ゲル上で分離した。
のＭＡＤＳボックス遺伝子発現の比較 実施例１でトウモロコシとブタモトコシの雌花から単離
したＤＮＡを実施例３に記載した通りに第１鎖ｃＤＮＡ
に変換して転写産物特異長の増幅産物の合成に用いた。
この操作では、この場合にはそれらの５’末端にビオチ
ン基を保有するオリゴヌクレオチドＰＯ３８、ＰＯ４
１、ＰＯ４２及びＰＯ４３の混合物を、ＭＡＤＳボック
ス遺伝子ファミリーのメンバーに相当するｃＤＮＡ分子
の選択的増幅に用いた。制限酵素としてのＭｓｅＩと共
にインキュベートした後、これらビオチン標識延長産物
をストレプトアビジン被覆磁気粒子(Dynal) によって分
離して、実施例２及び３に記載した通りにリンカーの連
結に用いた。オリゴヌクレオチドＰＯ４６ 5'-(A/C)G(G
/C)CAG GT(G/C) AC(C/G) T(A/T)C-3' ("RQVT(F/Y)"に対
して向けられたもの) を再増幅に用いた。こうして得ら
れた増幅産物を記載された通りに放射性標識して６％配
列分析ゲル上で分離した。
【００６１】実施例５：増幅産物の分析と同定 興味の対象であるバンドを実施例３及び４で得られたゲ
ルから切り取った。そこに含有される核酸を２５μl の
ＴＥ緩衝液中に溶離した。各場合において、５μl の溶
離液を上記のＰＣＲ条件を用いて５０μl の容量で３０
サイクル再増幅した。それぞれのＭＡＤＳボックスプラ
イマー及びＬＲ３２の塩基１〜２１と同一であるオリゴ
ヌクレオチドＬＲ２１をプライマーとして用いた。０．
５μl の再増幅バンドを Promegaからの pmol サイクル
配列分析キットの使用説明書に従って配列分析した。こ
の際、ＬＲ３２、各場合に用いたそれぞれのＭＡＤＳボ
ックスＰＣＲプライマー又は内部ＭＡＤＳボックスプラ
イマーＰＯ０９(5'-GAA GGC GTA CGA GCT CTC GGT GCT-
3') のいずれかをプライマーとして用いた。アニーリン
グ温度はＬＲ３２及びＰＯ０９については７０℃で、他
のＭＡＤＳボックスプライマーについては５０℃であっ
た。次いで、切り取ったバンドからの配列情報を用いて
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリー中の対応
するクローンを同定した。
ルから切り取った。そこに含有される核酸を２５μl の
ＴＥ緩衝液中に溶離した。各場合において、５μl の溶
離液を上記のＰＣＲ条件を用いて５０μl の容量で３０
サイクル再増幅した。それぞれのＭＡＤＳボックスプラ
イマー及びＬＲ３２の塩基１〜２１と同一であるオリゴ
ヌクレオチドＬＲ２１をプライマーとして用いた。０．
５μl の再増幅バンドを Promegaからの pmol サイクル
配列分析キットの使用説明書に従って配列分析した。こ
の際、ＬＲ３２、各場合に用いたそれぞれのＭＡＤＳボ
ックスＰＣＲプライマー又は内部ＭＡＤＳボックスプラ
イマーＰＯ０９(5'-GAA GGC GTA CGA GCT CTC GGT GCT-
3') のいずれかをプライマーとして用いた。アニーリン
グ温度はＬＲ３２及びＰＯ０９については７０℃で、他
のＭＡＤＳボックスプライマーについては５０℃であっ
た。次いで、切り取ったバンドからの配列情報を用いて
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリー中の対応
するクローンを同定した。
【００６２】性依存的に発現したＭＡＤＳボックス遺伝
子の単離の結果を図５に示す。奇数レーンは雄花からの
転写産物に対応し、偶数レーンは雌花からの転写産物に
対応する。遺伝子ＺＭＭ１をプライマーＰＯ３８及び制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて得た。その配列ラダー(seq
uence ladder) は、ＬＲ３２を配列分析プライマーとし
て用いる、切り取って増幅したバンドの直接配列分析に
より得られたＺＭＭ１配列の一部を示す。ＺＭＭ２を同
定するのにプライマーＰＯ４２及び酵素ＨｉｎｆＩを用
いた。ＺＭＭ３及びＺＡＧ１は、プライマーＰＯ４１及
びＭｓｅＩを用いて得られた。ＺＭＭ７及びＺＡＧ２
は、プライマーＰＯ４３及びＭｓｅＩで得られた。Ｍで
表されるレーンは、核酸長さマーカーに該当する。
子の単離の結果を図５に示す。奇数レーンは雄花からの
転写産物に対応し、偶数レーンは雌花からの転写産物に
対応する。遺伝子ＺＭＭ１をプライマーＰＯ３８及び制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて得た。その配列ラダー(seq
uence ladder) は、ＬＲ３２を配列分析プライマーとし
て用いる、切り取って増幅したバンドの直接配列分析に
より得られたＺＭＭ１配列の一部を示す。ＺＭＭ２を同
定するのにプライマーＰＯ４２及び酵素ＨｉｎｆＩを用
いた。ＺＭＭ３及びＺＡＧ１は、プライマーＰＯ４１及
びＭｓｅＩを用いて得られた。ＺＭＭ７及びＺＡＧ２
は、プライマーＰＯ４３及びＭｓｅＩで得られた。Ｍで
表されるレーンは、核酸長さマーカーに該当する。
【００６３】本発明による方法により同定された遺伝子
の類別を図６に示す。酵母、動物及び植物からのＭＡＤ
Ｓドメインの１０１の既知配列との比較で、レーン１に
示すＭＡＤＳドメインコンセンサス配列が得られた。更
には、全縁遺伝子配列、発現パターン及びそれらの機能
に関して相違する別異なサブファミリーが見出された。
本発明による方法により同定されたトウモロコシからの
ＭＡＤＳ配列は、これら２のサブファミリー、つまりＡ
Ｇ様及びＡＧＬ２様サブファミリーのメンバーである。
比較配列ＡＧＡＭＯＵＳ (Yanofskyら, Nature 346 (19
90), 35-39) 及びＡＧＬ２ (Maら, Genes Dev. 5 (199
1), 484-495) は、シロイスナズナ (Ａｔ) から生じた
ものである。比較配列ＦＢＰ６ (Angenentら, Plant J.
4 (1993),101-112) 及びＦＢＰ２ (Angenentら, Plant
Cell 4 (1992), 983-993) は、ペチュニアハイブリッ
ド (Ｐｈ) から生じたものである。更に、Lycopersicon
esculentum (Ｌｅ) からのＴＡＧ１ (Pnueliら, Plan
t Cell 6 (1994), 163-167)及びＴＭ５ (Pnueliら, Pla
nt J. 1 (1991), 255-266) を比較配列として示す。本
実験で、遺伝子ＺＡＧ１、ＺＡＧ２、ＺＭＭ１及びＺＭ
Ｍ２ (Schmidt ら, Plant Cell 5 (1993), 729-737；Th
eissenら, Gene 156 (1995), 155-166) だけでなく更に
新規な配列ＺＭＭ３及びＺＭＭ７をトウモロコシ (Ｚ
ｍ) から同定した。ＭＡＤＳドメインの個々の配列につ
いては、コンセンサス配列と相違するものだけを図６に
示している。ハイフンはコンセンサス配列と同一である
ことを示す。コンセンサス配列中の下線を引いたアミノ
酸は、遺伝子ファミリー特異的プライマーについての結
合部位を示す。
の類別を図６に示す。酵母、動物及び植物からのＭＡＤ
Ｓドメインの１０１の既知配列との比較で、レーン１に
示すＭＡＤＳドメインコンセンサス配列が得られた。更
には、全縁遺伝子配列、発現パターン及びそれらの機能
に関して相違する別異なサブファミリーが見出された。
本発明による方法により同定されたトウモロコシからの
ＭＡＤＳ配列は、これら２のサブファミリー、つまりＡ
Ｇ様及びＡＧＬ２様サブファミリーのメンバーである。
比較配列ＡＧＡＭＯＵＳ (Yanofskyら, Nature 346 (19
90), 35-39) 及びＡＧＬ２ (Maら, Genes Dev. 5 (199
1), 484-495) は、シロイスナズナ (Ａｔ) から生じた
ものである。比較配列ＦＢＰ６ (Angenentら, Plant J.
4 (1993),101-112) 及びＦＢＰ２ (Angenentら, Plant
Cell 4 (1992), 983-993) は、ペチュニアハイブリッ
ド (Ｐｈ) から生じたものである。更に、Lycopersicon
esculentum (Ｌｅ) からのＴＡＧ１ (Pnueliら, Plan
t Cell 6 (1994), 163-167)及びＴＭ５ (Pnueliら, Pla
nt J. 1 (1991), 255-266) を比較配列として示す。本
実験で、遺伝子ＺＡＧ１、ＺＡＧ２、ＺＭＭ１及びＺＭ
Ｍ２ (Schmidt ら, Plant Cell 5 (1993), 729-737；Th
eissenら, Gene 156 (1995), 155-166) だけでなく更に
新規な配列ＺＭＭ３及びＺＭＭ７をトウモロコシ (Ｚ
ｍ) から同定した。ＭＡＤＳドメインの個々の配列につ
いては、コンセンサス配列と相違するものだけを図６に
示している。ハイフンはコンセンサス配列と同一である
ことを示す。コンセンサス配列中の下線を引いたアミノ
酸は、遺伝子ファミリー特異的プライマーについての結
合部位を示す。
【００６４】トウモロコシから同定された６種全てのＭ
ＡＤＳボックス遺伝子では、本発明による方法により検
出された示差的発現を独立ノーザンブロット又は in si
tuハイブリダイゼーション実験により確認することが可
能である。増幅産物のバンドの強度をノーザンブロット
からのそれぞれのデータと比較すると、本発明による方
法で、異なるサンプル中の遺伝子ファミリーの個々のメ
ンバーの発現の少なくとも半定量的測定が可能になるこ
とが分かる。更に、本発明による方法は、ｃＤＮＡで出
発する１０の独立反復実験が厳密に同一のバンドパター
ンをもたらすので、高い再現性を有する。総じて、その
うちの４種が既に知られている６種の異なるＭＡＤＳボ
ックス遺伝子を本発明による方法により同定することが
可能である。既に知られている遺伝子のうち、ＺＡＧ２
及びＺＭＭ１は、雌性植物について特異的であると同定
された。ＺＡＧ１は雄性植物よりも雌性植物において強
く発現される。対照的に、ＺＭＭ２は雌花よりも雄花に
おいて強く発現される。本発明による方法により単離さ
れた新規な２種のＭＡＤＳボックス遺伝子は、ＡＧＬ様
遺伝子のサブファミリーのメンバーである。これら遺伝
子のうちＺＭＭ３と名付けられた１つの遺伝子は、雌花
よりも雄花において強く発現される。対照的に、新規な
遺伝子ＺＭＭ７の発現は、雌性植物において特異的に起
こるようである。
ＡＤＳボックス遺伝子では、本発明による方法により検
出された示差的発現を独立ノーザンブロット又は in si
tuハイブリダイゼーション実験により確認することが可
能である。増幅産物のバンドの強度をノーザンブロット
からのそれぞれのデータと比較すると、本発明による方
法で、異なるサンプル中の遺伝子ファミリーの個々のメ
ンバーの発現の少なくとも半定量的測定が可能になるこ
とが分かる。更に、本発明による方法は、ｃＤＮＡで出
発する１０の独立反復実験が厳密に同一のバンドパター
ンをもたらすので、高い再現性を有する。総じて、その
うちの４種が既に知られている６種の異なるＭＡＤＳボ
ックス遺伝子を本発明による方法により同定することが
可能である。既に知られている遺伝子のうち、ＺＡＧ２
及びＺＭＭ１は、雌性植物について特異的であると同定
された。ＺＡＧ１は雄性植物よりも雌性植物において強
く発現される。対照的に、ＺＭＭ２は雌花よりも雄花に
おいて強く発現される。本発明による方法により単離さ
れた新規な２種のＭＡＤＳボックス遺伝子は、ＡＧＬ様
遺伝子のサブファミリーのメンバーである。これら遺伝
子のうちＺＭＭ３と名付けられた１つの遺伝子は、雌花
よりも雄花において強く発現される。対照的に、新規な
遺伝子ＺＭＭ７の発現は、雌性植物において特異的に起
こるようである。
【００６５】配列番号：１ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１】
【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化２】
【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化３】
【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化４】
【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化５】
【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化６】
【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化７】
【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化８】
【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化９】
【００７４】配列番号：１０ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１０】
【００７５】配列番号：１１ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１１】
【００７６】配列番号：１２ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１２】
【００７７】配列番号：１３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１３】
【００７８】配列番号：１４ 配列の長さ：60 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列
【化１４】
【図１】遺伝子の一般的発現分析のための本発明による
方法の１つの態様を図示したものである。
方法の１つの態様を図示したものである。
【図２】遺伝子の一般的発現分析のための本発明による
方法の更なる態様であって、減数段階及び蛍光でコード
される再増幅用のプライマーの使用を含む態様を図示し
たものである。
方法の更なる態様であって、減数段階及び蛍光でコード
される再増幅用のプライマーの使用を含む態様を図示し
たものである。
【図３】遺伝子ファミリーの発現分析のための本発明に
よる方法の更なる態様を図示したものである。
よる方法の更なる態様を図示したものである。
【図４】１０の独立実験により証明された本発明による
方法の再現性を示す。
方法の再現性を示す。
【図５】本発明による方法を用いて示差的に発現された
ＭＡＤＳボックス遺伝子の単離結果を示す。
ＭＡＤＳボックス遺伝子の単離結果を示す。
【図６】本発明による方法により同定された遺伝子をＭ
ＡＤＳボックス遺伝子ファミリーに割り当てた図であ
る。
ＡＤＳボックス遺伝子ファミリーに割り当てた図であ
る。
Claims (26)
- 【請求項１】 下記段階を特徴とする遺伝子ファミリー
のメンバーの発現の示差的分析方法。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 興味の対象である遺伝子ファミリーのメンバーの
該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増幅であって、興味の対
象である該遺伝子ファミリー内の保存ドメインとハイブ
リダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオ
チド又はオリゴヌクレオチドの混合物である該遺伝子フ
ァミリーに特異的な少なくとも１のプライマーが用いら
れる選択的増幅、及び該増幅産物の標識、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び (ｈ) 該分離増幅産物の分析。 - 【請求項２】 下記段階を特徴とする遺伝子ファミリー
のメンバーの発現の示差的分析方法。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかの組織サンプルからのｍ
ＲＮＡ分子の単離、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 興味の対象である遺伝子ファミリーのメンバーの
該ｃＤＮＡ第１鎖分子の選択的増幅であって、興味の対
象である該遺伝子ファミリー内の保存ドメインとハイブ
リダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオ
チド又はオリゴヌクレオチドの混合物である該遺伝子フ
ァミリーに特異的な少なくとも１のプライマーが用いら
れる選択的増幅、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｅ) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (ｆ) 該リンカー分子に対して向けられたプライマー及
び遺伝子ファミリー特異的プライマーを用いる、該制限
断片の再増幅及び標識、 (ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び (ｈ) 該分離増幅産物の分析。 - 【請求項３】 段階 (ｂ) におけるｃＤＮＡ第１鎖分子
の合成がオリゴｄＴヌクレオチドをｃＤＮＡプライマー
として用いる逆転写により行われる、請求項１又は２記
載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子ファミリー特異的プライマーと、
ｃＤＮＡプライマーの配列から誘導されるオリゴヌクレ
オチドであってリバースプライマーとして機能するオリ
ゴヌクレオチドが段階 (ｃ) における増幅に用いられ
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 標識の取り込みが増幅又は再増幅産物を
鋳型として用いるプライマー延長の形で行われる、請求
項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 興味の対象である増幅又は再増幅産物が
それぞれ段階 (ｈ)においてクローニング段階なしに直
接配列分析に用いられる、請求項１〜５のいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項７】 第１鎖ｃＤＮＡに特定の核酸配列が特に
その３’末端に供されており、そして段階 (ｃ) におけ
る増幅用のリバースプライマーとして該特定核酸配列に
対して向けられたオリゴヌクレオチドが用いられる、請
求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 特定核酸配列がホモポリマー又はランダ
ム配列を含む、請求項２０記載の方法。 - 【請求項９】 第１鎖ｃＤＮＡが自己連結によりオリゴ
マー分子及び／又は環状分子に変換され、そして該ｃＤ
ＮＡプライマーに少なくとも部分的に相補的であり場合
によりその３’末端において延長部分を有する下流方向
オリゴヌクレオチドが段階 (ｃ) における増幅用のリバ
ースプライマーとして用いられる、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 転写産物特異的短縮化が、前もって増
幅することなく二本鎖ｃＤＮＡ上で行われる、請求項１
〜９のいずれか１項に記載の方法の変法。 - 【請求項１１】 二本鎖ｃＤＮＡが第１鎖ｃＤＮＡの連
結及び後の第２鎖合成により作られる、請求項１０記載
の方法。 - 【請求項１２】 被検ＲＮＡの５’領域を得るためにア
ンカーオリゴヌクレオチドを該ｍＲＮＡの５’末端に付
加しそして後の増幅においてそのｃＤＮＡプライマーか
ら誘導されるプライマーを該アンカーオリゴヌクレオチ
ドの配列から誘導されるプライマーと置き換える、請求
項１〜１１のいずれか１項に記載の方法の変法。 - 【請求項１３】 遺伝子ファミリー特異的プライマーが
任意の転写産物の検出ができるように一組のランダムプ
ライマーにより置き換えられる、請求項１〜１１のいず
れか１項に記載の方法の変法。 - 【請求項１４】 可能性のある転写産物の検出を可能に
するために、アンカーオリゴヌクレオチドを該ｍＲＮＡ
の５’末端に付加し、そして、段階(c) の増幅において
その遺伝子ファミリー特異的プライマーを該アンカーオ
リゴヌクレオチドの配列から誘導されるプライマーと置
き換える、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法
の変法。 - 【請求項１５】 用いられるリンカー分子に対して向け
られたプライマー及びアンカーオリゴヌクレオチドの配
列から誘導されるプライマーを段階 (ｆ) における増幅
で用いる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１６】 第１鎖ｃＤＮＡに特定の核酸配列が供
されており、そして段階 (ｃ) の増幅において該特定核
酸配列に対して向けられたオリゴヌクレオチドが遺伝子
ファミリー特異的プライマーの代わりに用いられ、そし
てｃＤＮＡプライマーの配列から誘導されるオリゴヌク
レオチドがリバースプライマーとして用いられる方法で
あって、両プライマーが場合により３’延長部分を有す
る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法の変
法。 - 【請求項１７】 互いに比較されるべき２の組織サンプ
ルからの増幅又は再増幅産物のサブトラクティブハイブ
リダイゼーションが該増幅又は再増幅産物の分離及び分
析の前に行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記
載の方法の変法。 - 【請求項１８】 アンカー分子、リンカー分子、ｃＤＮ
Ａプライマー及び／又は増幅プライマーとして用いられ
るオリゴヌクレオチドが、制限エンドヌクレアーゼのた
めの１又は幾つかの認識部位又は開裂部位を有する、請
求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１９】 下記段階を特徴とする請求項１４〜１
８のいずれか１項に記載の方法。 (ａ) 分析すべき１又は幾つかのサンプルからのｍＲＮ
Ａ分子の単離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅及び該増幅産物の標
識、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｇ) 該増幅産物のそれらの長さに応じた分離、及び (ｈ) 該分離増幅産物の分析。 - 【請求項２０】 下記段階を特徴とする請求項１４〜１
８のいずれか１項に記載の方法。 (ａ) １又は幾つかのサンプルからのｍＲＮＡ分子の単
離、 (aa) 該ｍＲＮＡ分子の５’末端へのアンカー配列の付
加、 (ｂ) 該ｍＲＮＡ分子からのｃＤＮＡ第１鎖分子の合
成、 (ｃ) 該ｃＤＮＡ第１鎖分子の増幅、 (ｄ) １又は幾つかの制限エンドヌクレアーゼでの開裂
による該増幅産物の転写産物特異的短縮化、 (ｅ) 該制限断片の末端へのリンカー分子の付加、 (ｆ) 段階 (ｅ) において付加された該リンカー分子に
対して向けられたプライマー及び (ｉ) 段階 (aa) にお
いて付加された該アンカー配列に対して向けられたプラ
イマー又は (ii) 段階 (ｂ) において用いられたｃＤＮ
Ａプライマー配列に対して向けられたプライマーを用い
る、該制限断片の再増幅及び標識、 (ff) 場合によっては、“繰り込まれた”プライマーを
用いる新たな再増幅及び標識、(fff) 場合によっては、
互いに比較されるべき２の増幅産物のプールのサブトラ
クティブハイブリダイゼーション、(ｇ) 該増幅産物の
それらの長さに応じた分離、 (ｈ) 該分離増幅産物の分析。 - 【請求項２１】 新規な遺伝子を単離するための請求項
１〜２０のいずれか１項に記載の方法の使用。 - 【請求項２２】 遺伝子ファミリーの新規なメンバーを
同定するための請求項１〜２０のいずれか１項に記載の
方法の使用。 - 【請求項２３】 細胞又は生物のライフステージを決定
するための請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法
の使用。 - 【請求項２４】 細胞又は生物のライフサイクルを検査
するための請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法
の使用。 - 【請求項２５】 癌及び老人医学研究のための請求項２
１〜２４のいずれか１項に記載の使用。 - 【請求項２６】 遺伝子の発現を分析するための、特に
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に用いるた
めの試薬キットであって、下記のものを含む試薬キッ
ト。 (ａ) ｃＤＮＡ第１鎖合成用の酵素、 (ｂ) ｃＤＮＡ第２鎖の合成用の及びＤＮＡ断片の増幅
用の少なくとも１の酵素、 (ｃ) 場合により、少なくとも１の制限酵素、 (ｄ) 場合により、少なくとも１の二本鎖ＤＮＡリンカ
ー分子及び該リンカー分子をＤＮＡ断片の末端に付加す
るための物質、 (ｅ) 場合により、少なくとも１の一本鎖ＲＮＡオリゴ
ヌクレオチド及び該ＲＮＡオリゴヌクレオチドをｍＲＮ
Ａ分子の５’末端に付加するための物質、 (ｆ) (ｉ) 少なくとも１の遺伝子ファミリー特異的プ
ライマー、 (ii) 少なくとも１のオリゴｄＴヌクレオチ
ド、(iii) 該ＤＮＡリンカー分子の配列から誘導される
少なくとも１のプライマー、 (iv) 該ＲＮＡオリゴヌク
レオチドの配列から誘導されるプライマー、 (ｖ) 一組
のランダムプライマー、 (vi) ３’延長部分及び／又は
５’延長部分を有する (ｉ) 〜 (ｖ) のプライマー、(v
ii) マーカー基を保有する (ｉ) 〜 (vi) のプライマ
ー、及び (viii) 標識のタイプ、例えば、蛍光標識の色
によりコードされる３’延長部分を含有する (vii)のプ
ライマー、を含む群から選ばれる一本鎖核酸プライマー
分子、 (ｇ) 核酸を標識及び検出するための物質、 (ｈ) 場合により、ＲＮアーゼ阻害物質、緩衝液、スト
レプトアビジンコーテッド反応容器又は磁気粒子の如き
更なる試薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19518505A DE19518505A1 (de) | 1995-05-19 | 1995-05-19 | Verfahren zur Genexpressionsanalyse |
| DE19518505:6 | 1995-05-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08308598A true JPH08308598A (ja) | 1996-11-26 |
| JP3150061B2 JP3150061B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=7762408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12514496A Expired - Fee Related JP3150061B2 (ja) | 1995-05-19 | 1996-05-20 | 遺伝子発現分析方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5876932A (ja) |
| EP (2) | EP0743367B2 (ja) |
| JP (1) | JP3150061B2 (ja) |
| DE (2) | DE19518505A1 (ja) |
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