DE10208333A1

DE10208333A1 - Analyse von Nukleinsäure-Fragmentmischungen

Info

Publication number: DE10208333A1
Application number: DE10208333A
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2002-02-27
Publication date: 2003-09-04
Also published as: AU2003210377A1; US20060029937A1; EP1492888A2; AU2003210377A8; CA2480320A1; WO2003072819A2; WO2003072819A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurefragmenten, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A a) Bereitstellung mindestens eine Mischung von Nukleinsäurefragmenten, die mindestens eine Erkennungsstelle für eine außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonuklease aufweisen, DOLLAR A b) Inkubation zumindest einer Teilmenge der Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus Schritt (a) mit mindestens einer Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle außerhalb ihrer Erkennungsstelle liegt, DOLLAR A c) Bestimmung einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b), wobei die Bestimmung simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäure-Fragmentmischungen sowie die Anwendung des Verfahrens zur Genexpressionsanalyse.
Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremischungen, wie sie etwa durch das "Umschreiben" (die reverse Transkription) von mRNA-Molekülen in cDNA-Moleküle erhalten werden können, bekannt. Die beim Umschreiben zahlreicher verschiedener, aus einer Zelle oder einem Gewebe gewonnener mRNA-Moleküle erhaltenen cDNA-Moleküle werden kloniert, meist in Plasmid- oder Phagenvektoren, und anschließend "klonweise" sequenziert (Sambrook, Maniatis, Fritsch. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor/NY 1989), wobei die Sequenzierung üblicherweise "strangautbauend" nach dem Kettenabbruchprinzip von Sanger oder "kettenabbauend" bei der Sequenzierung nach Maxam und Gilbert erfolgt. In jedem Fall wird die Separation unterschiedlicher Moleküle also über eine Vereinzelung in Form von in bakterielle Zellen transformierten Plasmiden vorgenommen, gefolgt von einer Vermehrung der vereinzelten Moleküle zu identischen Kopien, so daß bei der Sequenzierung "reine" (also von identischen Molekülen stammende) Signale erhalten werden. Besagte Vorgehensweise eignet sich beispielsweise zur sogenannten "EST-Sequenzierung" (EST = expressed sequence tag), bei der zahlreiche auf beschriebene Weise erhaltene Klone partiell sequenziert ("ansequenziert") werden und die erhaltenen Sequenzergebnisse aufgelistet werden. Je nachdem ob die sequenzierte Bank zuvor normalisiert wurde oder nicht, spiegelt die relative Häufigkeit, mit der eine bestimmte cDNA bzw. ein bestimmter EST sequenziert wurde, die Abundanz des zugehörigen Transkripts wieder. Somit kann die EST-Sequenzierung nicht nur zur Detektion exprimierter Gene, sondern auch zum Vergleich von Expressionsstärken zwischen verschiedenen biologischen Proben eingesetzt werden (vgl. etwa Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 8303-8307). Das Verfahren der EST-Sequenzierung ist jedoch gerade aufgrund dieses Zusammenhangs zwischen der relativen Transkript- und der relativen Klonabundanz sehr aufwendig, da einige Transkripte (beispielsweise sog. housekeeping-Gene) eine sehr viel größere Häufigkeit haben als andere Transkripte und somit Klone solcher häufiger Transkripte unter Umständen einige hundert bis einige tausend Mal sequenziert werden.
In der Vergangenheit wurden mehrere alternative Verfahren beschrieben, bei welchen nicht vollständige cDNA-Moleküle analysiert werden, sondern lediglich Fragmente hiervon. Insbesondere sind zu nennen die Verfahren des RAP (RNA arbitrarily primed PCR; Welsh et al., Nucleic Acids Res. 20: 4965-70) und des Differential Display (Liang und Pardee, Science 257: 967-971), bei denen mittels PCR mit kurzen Primern zufällig ausgewählter Sequenz Transkriptfragmente amplifiziert werden. Diese Fragmente, deren Länge wiederum von Transkript zu Transkript stark variieren kann, werden mittels Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt und nachgewiesen. Hierbei wird, zumindest theoretisch, die Abundanz eines Transkripts nicht mehr durch die Häufigkeit eines Ereignisses, etwa der Häufigkeit, mit der eine dieses Transkript repräsentierende Bande auftritt, sondern durch die Intensität der jeweiligen Bande repräsentiert. Hierdurch wird die Redundanz, durch die sich die EST-Sequenzierung des Standes der Technik auszeichnet, weitgehend eliminiert, was mit einer Kostensenkung verbunden ist. Um eine Sequenzierung einzelner Fragmente zu ermöglichen, werden die jeweiligen Banden aus dem Gel isoliert, mittels PCR reamplifiziert und kloniert. Modernere Varianten dieses Verfahrens, wie sie etwa in der EP 0 743 367 beschrieben sind, basieren auf einer Fragmenterzeugung mittels Restriktionsverdau doppelsträngiger cDNA, wodurch die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Fragmentmuster deutlich erhöht wird. Dennoch weisen Verfahren dieser Art noch den Nachteil auf, daß bei der Isolation von Banden aus einem Gel häufig verunreinigte Produkte erhalten werden. Weiterhin ist die Isolation und Klonierung einzelner Banden sehr arbeitsaufwendig, so daß eine Identifikation von Fragmenten ohne eine vorherige Isolation sehr wünschenswert wäre. Sutcliffe et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 1976-1981) beschreiben ein "TOGA" genanntes Verfahren, mRNA-Moleküle in cDNA-Restriktionsfragmente zu überführen, welche mittels Kapillargelelektrophorese aufgetrennt werden. Für Fragmente von Interesse (welche im Vergleich verschiedener Präparationen differentiell exprimierte Gene anzeigen) wird eine Signatur (also eine Sammlung fragmentspezifischer Informationen) definiert, bestehend aus einer 8 bp langen Sequenz, welche für jedes Fragment bekannt ist, sowie die Distanz dieser Sequenz vom 3'-Ende des Fragments. Mittels dieser Signatur lassen sich durch Durchsuchen von Sequenzdatenbanken Gene mit der gleichen Signatur identifizieren. Ist die erzeugte Signatur fehlerfrei, so können cDNA-Fragmenten die zugehörigen Gene zugeordnet werden, ohne daß die Fragmente isoliert werden müssen. Das beschriebene Verfahren ist allerdings mit Nachteilen behaftet, die zur Unzuverlässigkeit besagter Signaturen führen: (I) ist die Identifikation von 4 Nukleotiden der 8 bp langen Sequenz, welche durch "invasive" oder "selektive" Amplifikationsprimer erfolgt, ungenau, da oft auch Primer inkorporiert werden, deren selektiver Anteil, nämlich die am 3'-Ende gelegenen Nukleotide, nicht perfekt komplementär zum Template sind, und (2) ist die Ermittlung der Fragmentlänge über die elektrophoretische Mobilität ungenau, da die Mobilität eines Fragments neben der Länge auch noch von G/C-Gehalt und der genauen Sequenz des Fragments abhängt. Daher wird oft eine falsche Länge angenommen. Eine falsche Länge und/oder eine falsche Sequenz führen jedoch dazu, daß eine für ein gegebenes Fragment ermittelte Signatur nicht auf das zu identifizierende Gen hinweist, sondern die entsprechende Datenbanksuche entweder kein oder ein falsches Ergebnis zutage fördert.
Daher war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, in einer Mischung vorliegenden Nukleinsäurefragmenten Signaturen zuzuordnen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurefragmenten, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten, die mindestens eine Erkennungsstelle für eine außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonuklease aufweisen,
b) Inkubation zumindest einer Teilmenge der Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus Schritt (a) mit mindestens einer Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle außerhalb ihrer Erkennungsstelle liegt,
c) Identifikation eines oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b), wobei die Identifikation simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt.

Bei der Mischung von Nukleinsäurefragmenten handelt es sich bevorzugt um Restriktionsfragmente von cDNA oder genomischer DNA. Die Fragmente oder ein Teil der Fragmente können von allen oder einigen Fragmenten gemeinsamen Sequenzbereichen flankiert werden. Bei diesen gemeinsamen Sequenzbereichen kann es sich beispielsweise um an die Fragmente angefügte Linker oder Adapter handeln, also doppelsträngige Nukleinsäurefragmente, welche etwa durch Hybridisierung zweier zueinander im wesentlichen komplementärer Oligonukleotide leicht erhältlich sind. Oft zeigen die Fragmente eine charakteristische Größenverteilung mit einer kleinsten vorkommenden Größe, einer größten vorkommenden Größe sowie einer Durchschnittsgröße, wobei die Größe durch die Positionen und/oder die Häufigkeit der Erkennungsstelle oder Erkennungsstellen für die zur Fragmenterzeugung verwendete Restriktionsendonuklease oder Restriktionsendonukleasen beeinflußt oder bestimmt wird, wobei natürlich noch die Länge gegebenenfalls angefügter Linker bzw. Adapter berücksichtigt werden muß. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung aus Nukleinsäurefragmenten, vorzugsweise doppelsträngige cDNA, mit mindestens einer Restriktionsendonuklease geschnitten, welche oft eine vierbasige Erkennungssequenz aufweist. An jeweils einem oder beiden Enden der so erhaltenen Fragmente werden Linkermoleküle befestigt, und gegebenenfalls folgt zur Darstellung einer gewünschten Untergruppe von Fragmenten eine Amplifikation mit einem oder mehreren gegen die angefügten Linker gerichteten PCR- Primer oder mit einem oder mehreren gegen die angefügten Linker gerichteten PCR- Primer und zusätzlich einem PCR-Primer, welcher gegen eine terminale Region der ursprünglichen Nukleinsäurefragmente, also vorzugsweise gegen die Ausgangs-cDNA- Moleküle, gerichtet ist. Hierzu eignet sich beispielsweise diejenige Region, welche durch den zur cDNA-Synthese eingesetzten cDNA-Primer eingeführt wurde, oder eine Region, welche künstlich an das 5'-Ende der zur cDNA-Synthese eingesetzten mRNA oder an das 3'-Ende der cDNA angefügt wurde. Im ersten Fall werden "cDNA-interne" Fragmente amplifiziert, die also vor der Linkerbefestigung beidseitig durch Restriktionsschnitt erzeugte Enden aufwiesen, im zweiten Fall "terminale" Fragmente, die vor der Linkerbefestigung einseitig ein durch Restriktionsschnitt erzeugtes Ende aufwiesen und deren anderes Ende mit dem 3'-Ende oder dem 5'-Ende der ursprünglichen Nukleinsäurefragmente bzw. der Ausgangs-cDNA identisch ist. Als cDNA-Primer kommt bei dieser Ausführungsform vorzugsweise ein Oligo-dT-Primer zur Anwendung, welcher an seinem 3'-Ende oder an seinem 5'-Ende eine Extension um ein oder mehrere Nukleotide aufweist.
Außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonukleasen sind solche Restriktionsendonukleasen, bei denen die die Enzymaktivität auslösende Teilsequenz, bei welcher es sich meist um einen aus 4-8 Basenpaaren bestehenden Bereich doppelsträngiger DNA handelt und an welcher das Enzym an den DNA-Doppelstrang bindet, und die Schnittstelle, also der Bereich des DNA-Doppelstrangs, in dem das Zuckerphosphat-Rückgrat der DNA-Stränge hydrolytisch durchtrennt wird, auf mindestens einem der beiden den Doppelstrang bildenden Stränge gegeneinander versetzt liegen. Beispiele hierfür sind Typ IIs-Restriktionsendonukleasen wie etwa FokI [Schneidecharakteristik GGATG(9/13): der "obere" Strang wird in 9 Basen Entfernung von der Erkennungsstelle GGATG, der "untere" Strang in 13 Basen Entfernung von der Erkennungsstelle geschnitten] oder BtsI [Schneidecharakteristik GCAGTG(2/0)] oder die Restriktionsendonuklease BcgI [Schneidecharakteristik (10/12)CGANNNNNNTGC (12/10): beide Stränge werden jeweils einmal vor und einmal hinter der Erkennungsstelle geschnitten]. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise solche Restriktionsendonukleasen eingesetzt, die einzelsträngige Überhänge erzeugen, wobei es sich sowohl um 3'-Überhänge als auch um 5'-Überhänge handeln kann.
Die in den Nukleinsäurefragmenten aus der Fragmentmischung in (a) auftretende Erkennungsstelle für eine außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonuklease befindet sich vorzugsweise innerhalb der vielen oder allen Fragmenten der Mischung gemeinsamen endständigen Sequenzbereiche, so beispielsweise häufig in den Sequenzbereichen der an die Fragmente angefügten Adaptoren oder Linkem. Hierbei sind die Auswahl des Enzyms und die Position der Erkennungsstelle derart zu wählen, daß bei Einwirkung der Restriktionsendonuklease oder Restriktionsendonukleasen ein "proximaler" Schnitt erfolgt und das jeweilige Nukleinsäurefragment im fragmentspezifischen Bereich geschnitten wird, welcher sich außerhalb der allen oder vielen Fragmenten gemeinsamen, flankierenden Linker-Bereiche befindet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind gegebenenfalls bei einzelnen Fragmenten vorhandene Erkennungsstellen für die einzusetzenden Restriktionsendonukleasen, welche außerhalb der allen oder vielen Fragmenten gemeinsamen, flankierenden Linker-Bereiche liegen, gegen eine Erkennung durch die entsprechende Restriktionsendonuklease geschützt. Ein solcher Schutz von bestimmten Erkennungsstellen für bestimmte Restriktionsendonukleasen kann nach dem Stand der Technik beispielsweise durch Einbau methylierter Nukleotide wie etwa Methyl-dCTP erreicht werden. Diese Maßnahme stellt sicher, daß jedes in der Mischung vorhandene Nukleinsäurefragment im Zuge eines Restriktionsdaus lediglich an genau einer vorbestimmten Position geschnitten wird.
Die Identifikation einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente kann auf mehrere verschiedene Weisen erfolgen. Insbesondere eignen sich hierfür drei bevorzugte Vorgehensweisen, wodurch weitere Vorgehensweisen jedoch nicht ausgeschlossen werden sollen:

1. Verlängerung zurückversetzter 3'-Enden mit zur heute üblichen Sequenzierung nach Sanger verwendeten Didesoxynukleotid-Triphosphaten oder auch mit acyclischen Nukleotiden (sogenannten "Abbruchnukleotiden" oder "Kettenterminatoren"), wobei jeder auffüllbare Strang um genau ein Nukleotid verlängert wird und die Kettenverlängerung hiernach abbricht, da keine freie 3'- OH-Gruppe mehr vorliegt. Da der Einbau sequenzspezifisch erfolgt, ist so das dem eingebauten Nukleotid im Doppelstrang gegenüberliegende Nukleotid eindeutig identifizierbar. Bevorzugterweise tragen die Abbruchnukleotide Markierungsgruppen, anhand derer ein Einbau nachweisbar ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform tragen die vier Didesoxynukleotide vier unterscheidbare Markierungsgruppen, insbesondere vier verschiedene Fluorophore. Es ist dann anhand der Fluoreszenzaktivität erkennbar, welches der vier Abbruchnukleotide eingebaut wurde und dementsprechend auch, welches Nukleotid auf dem Gegenstrang vorliegt. Die Durchführung dieser ersten Ausführungsform setzt natürlich voraus, daß die Nukleinsäurefragmente aus (c) zurückversetzte und daher mittels einer Polymerase auffüllbare 3'-Enden aufweisen.
2. Befestigung von Adaptern mit überhängenden Enden geeigneter Länge und geeigneter Sorte (3'-Überhang oder 5'-Überhang) an ein überhängendes Ende aufweisenden Fragmenten, wobei die Befestigung sequenzspezifisch erfolgt. Vorzugsweise werden in der Befestigungsreaktion mehrere Adapter eingesetzt, welche sich in ihrem Überhang unterscheiden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Markierungsgruppen tragenden Adaptern, welche sich sowohl in ihrem Überhang als auch in ihrer Markierungsgruppe unterscheiden. In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Markierungsgruppen um Fluorophore, so daß anhand der Fluoreszenzaktivität erkennbar ist, welcher Adapter an einem gegebenen Fragmentende befestigt worden ist. Zur Ermittlung der Identität der ein einbasiges überhängendes Ende bildenden Base eines Fragments in einer Mischung können beispielsweise Adapter der allgemeinen Struktur

F-Adapter-X

zur Anwendung kommen, wobei Adapter den doppelsträngigen Anteil des Adaptors meint, X eines der vier möglichen Nukleotide in Form eines einzelsträngigen Überhangs darstellt und F ein Fluorophor meint, welches die überhängende Base X kennzeichnet. So könnte folgende Zuordnung getroffen werden:

Somit läßt sich beispielsweise von einem ROX-Signal ableiten, daß der ein überhängendes G aufweisende Adapter befestigt wurde und daß es sich demnach bei der überhängenden Base des betreffenden Fragments um ein C gehandelt hatte.
Zur Identifikation von mehrbasigen Fragmentüberhängen wird "nukleotidweise" vorgegangen, für einen zweibasigen Überhang also folgendermaßen: Es werden in separaten Ansätzen zwei Adapter eingesetzt, welche folgende allgemeine Struktur aufweisen:
(1) F-Adapter-NX₁ zur Identifikation des ersten Nukleotids bzw.
(2) F-Adapter-X₂N zur Identifikation des zweiten Nukleotids,
wobei N eine Mischung aller vier möglichen Nukleotide oder auch ein universelles Nukleotid wie etwa Inosin darstellt. In einem ersten Ansatz würde dann durch Befestigung des ersten Adaptors das erste Nukleotid des zweibasigen Fragmentüberhangs, in einem zweiten Ansatz durch Befestigung des zweiten Adaptors das zweite Nukleotid des zweibasigen Fragmentüberhangs ermittelt werden. Wiederum ist bevorzugt, daß wie oben beschrieben eine eindeutige und bekannte Beziehung zwischen der Natur des Fluorophors F und dem der Sequenzierung dienenden spezifischen Nukleotid X₁ oder X₂ besteht. Durch Identifikation desjenigen ersten und zweiten Adaptors, welcher am überhängenden Ende befestigt wurde, läßt sich die Sequenz des überhängenden Endes bestimmen.
In doppelsträngiger Darstellung erfolgt die Sequenzierung eines zweibasigen 3'- Überhangs Y₁Y₂ eines Fragments beispielsweise gemäß folgendem Schema:

Die Sequenz des Überhangs Y₁Y₂ kann dann folgender Tabelle entnommen werden:

Sinngemäß lassen sich so selbstverständlich auch Überhänge einer Länge von mehr als zwei Nukleotiden, also beispielsweise von drei oder vier Nukleotiden, sequenzieren.
3. Extension selektiver Oligonukleotidprimer, deren am 3'-Ende gelegenes Nukleotid oder Nukleotide mit der oder den zu sequenzierenden Nukleotiden des Gegenstrangs hybridisieren können, gefolgt von der Identifikation derjenigen Primer, welche in der Extensionsreaktion verlängert wurden. Gegebenenfalls kann die Extension mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) erfolgen. Bevorzugterweise werden an den Enden der zu sequenzierenden Nukleinsäurefragmente zunächst Linker bzw. Adapter befestigt, welche als allen oder vielen Fragmenten gemeinsame Primerbindungsstelle dienen können. Die Oligonukleotidprimer werden dann derart ausgestaltet, daß sie nach Denaturierung der zu sequenzierenden Nukleinsäurefragmente mit dem am 3'-Ende der Nukleinsäurefragmentstränge befestigten Linkerstrang hybridisieren können. Hierbei ist dafür Sorge zu tragen, daß die dergestalt hybridisierten Oligonukleotidprimer um ein oder mehrere Nukleotide mit dem Nukleinsäurefragment "überlappen", also an ihrem 3'-Ende Nukleotide aufweisen, welche mit den Nukleotiden des Nukleinsäurefragments hybridisieren können, sofern eine Komplementarität gegeben ist. Es handelt sich also um "selektive Nukleotide", die eine Verlängerung des Primers mittels einer Polymerase zulassen, wenn sie durch besagte Hybridisierung Bestandteil eines Doppelstrangs geworden sind, die die Verlängerung des Primers aber verhindern, wenn sie keine Basenpaarung mit dem Gegenstrang ausbilden konnten.

Beispielsweise läßt sich in folgender Situation, in welcher der selektive Primer 5'-YYYYYYYYYN-3' an die Linkerregion XXXXXXXX des Fragments der Sequenz 5'-OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOM-3' hybridisiert vorliegt, eine effiziente Extension des hybridisierten Primers nur dann erreichen, wenn die selektive Base N des Primers komplementär ist zur letzten fragmentspezifischen Base M:
Die für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente simultane Identifikation einer oder mehrerer Nukleotide erfolgt vorzugsweise nach Auftrennung der in der Mischung enthaltenen Nukleinsäurefragmente nach einer fragmentspezifischen Eigenschaft, vorzugsweise nach Größe und/oder Mobilität der Fragmente durch elektrophoretische Auftrennung. Besonders bevorzugt ist das Verfahren der Gelelektrophorese, bei der zur Auftrennung Flachgele oder gelgefüllte Kapillaren verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden in Schritt (c) enzymatische Umsetzungen gemäß Varianten 1-3 derart durchgeführt, daß in parallelen Ansätzen jeweils ein oder jeweils zwei Nukleotide der Fragmente identifiziert werden, wobei die in den parallelen Ansätzen zu identifizierenden Nukleotide der Fragmente in definierter Position zueinander, beispielsweise zueinander benachbart, liegen. Es werden dann zunächst in parallelen Auftrennungen der besagten Ansätze für jedes der aufgetrennten Fragmente ein oder zwei Nukleotide bekannter Position ermittelt, was vorzugsweise mittels verschiedener Markierungsgruppen geschieht, welche Aufschluß über die zu ermittelnden Nukleotide erlauben. In einem weiteren Schritt werden dann für einzelne oder alle der aufgetrennten Fragmente die ermittelten Nukleotide in diejenige Reihenfolge gebracht, in der sie auf dem zugehörigen Fragment vorliegen. Dabei kann die Reihenfolge dieser beiden Maßnahmen natürlich auch vertauscht werden. Jedenfalls werden auf diese Weise für die untersuchten Fragmente Signaturen erzeugt, also kurze Sequenzabschnitte, welche das zugehörige Fragment charakterisieren. Neben einem oder mehreren Sequenzabschnitten kann eine Signatur auch andere ein Fragment kennzeichnende Informationen enthalten, beispielsweise genaue oder ungefähre Distanzen (angegeben in Basenpaaren) zwischen charakteristischen Bereichen des Fragments, beispielsweise den unter Zuhilfenahme eines internen Längenstandards anhand der elektrophoretischen Mobilität geschätzten Abstand zwischen zwei bekannten Sequenzabschnitten, zwischen einem bekannten Sequenzabschnitt und einem Fragmentende, oder zwischen beiden Fragmentenden. Bevorzugterweise ist der Informationsgehalt einer Signatur groß genug, um die eindeutige Identifikation und/oder Isolation des zugehörigen Fragments zu erlauben. Beispielsweise reichen erfahrungsgemäß ca. 16-20 Basenpaare Sequenzinformation meist aus, um ein diesen Sequenzabschnitt enthaltenes Transkript aus einer Mischung von cDNA-Molekülen zu erkennen und das zugehörige Gen zu identifizieren. Diese Tatsache nutzen beispielsweise Verfahren der "tag-Sequenzierung" wie SAGE (Velculescu et al., Science 270: 484-487) oder MPSS (Nature Biotechnol. 18: 630-634) aus. Hierbei ist zu beachten, daß die Länge einer Sequenzsignatur für eine eindeutige Identifikation eines Transkripts im Transkriptom meist länger sein muß als der theoretischen Mindestlänge entspricht, da die Nukleotidsequenz in Genomen nicht rein zufällig ist und bestimmte Nukleotidsequenzen bevorzugt werden. Dementsprechend würde man mit einer aus einer Folge von 8 Nukleotiden bestehenden Signatur, die theoretisch für 4⁸ = 65.536 verschiedene Transkripte codieren könnte, in der Praxis zahlreiche verschiedene menschliche cDNAs identifizieren, die sich alle durch besagte Signatur auszeichnen. Dem steht die derzeit geschätzte Zahl von lediglich ca. 30.000-40.000 Genen beim Menschen gegenüber. Um also Eindeutigkeit zu gewährleisten, muß der Informationsgehalt einer Signatur hinreichend über dem theoretischen Minimum liegen. Dabei kann der Informationsgehalt einer ein Fragment kennzeichnenden Signatur unter anderem durch folgende Angaben erhöht werden:

1. längere Sequenz,
2. Information über tatsächliche oder ungefähre Länge auch von Bereichen des Fragments, deren Sequenz unbekannt ist,
3. Vorauswahl möglicher Identitäten.

Bei der Vorauswahl möglicher Identitäten wird durch eine Zusatzaussage über das zu identifizierende Fragment oder der in Frage kommenden zugehörigen Transkripte oder Gene die Zahl bzw. die Wahrscheinlichkeit möglicher Fehlzuordnungen reduziert. Eine Zusatzaussage über das zu identifizierende Fragment könnte beispielsweise sein "mittels der Restriktionsendonuklease RsaI erzeugtes 3'-Fragment doppelsträngiger cDNA", wodurch die Identität des Sequenzanteils einer Signatur mit einem in 5' → 3'-Richtung gesehen "oberhalb" (upstream) bzw. "vor" der am meisten zum 3'-Ende des Fragments hin gelegenen RsaI-Erkennungsstelle gelegenen Sequenzbereich eines Transkripts als nicht signifikant erkannt würde. Eine Zusatzaussage über in Frage kommende Gene könnte beispielsweise sein "aus der Gesamtheit aller im Blatt exprimierten Gene", wenn mittels erzeugter pflanzlicher Signaturen Transkripte aus Blattproben identifiziert werden sollen, beispielsweise aber Gene, die ausschließlich in der Wurzel exprimiert werden, keine Berücksichtigung erfahren sollen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse von Nukleinsäurefragmenten erfolgt die simultane Bestimmung eines oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente in Schritt c) über die folgenden Einzelschritte:

a) Bestimmung eines ersten Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus b), wobei die Bestimmung simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,
b) gegebenenfalls Bestimmung eines weiteren Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus b), wobei die Bestimmung simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,
c) gegebenenfalls Wiederholung von Schritt (cb), bis die gewünschte Anzahl von Nukleotiden bestimmt worden ist,
d) Zusammenfassung der in den Schritten (ca) bis (cc) erhaltenen Sequenzinformation für eine ausgewählte Gruppe oder alle Nukleinsäure-Fragmente zu fragmentspezifischen Signaturen, wobei eine Signatur neben der Sequenzinformation noch weitere Informationen über das jeweilige Fragment enthalten kann,

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Teilmenge der in Schritt a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten den folgenden Verfahrensschritten aa) bis ad) unterworfen:

a) Auftrennung der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten nach mindestens einer fragmentspezifischen Eigenschaft,
b) gegebenenfalls Detektion der relativen Häufigkeit einiger oder aller Fragmentsorten in der aufgetrennten Mischung,
c) gegebenenfalls Vergleich der in (aa) und/oder (ab) erhaltenen Informationen über die Zusammensetzung verschiedener Mischungen von Nukleinsäure-Fragmenten aus Schritt (a),
d) gegebenenfalls Registrierung von in (ab) detektierten Nukleinsäure-Fragmenten, welche in verschiedenen Mischungen von Nukleinsäure-Fragmenten in unterschiedlicher relativer Häufigkeit auftreten,

A) eine weitere Teilmenge der in Schritt a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten,
B) eine Teilmenge der in Schritt a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten, die zuvor nach mindestens einer fragmentspezifischen Eigenschaft aufgetrennt worden ist,
C) eine mit I) oder II) zumindest zum Teil identische Mischung von Nukleinsäurefragmenten,

ist.
Es ist weiterhin bevorzugt, daß in einem der vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mindestens ein interessierendes Fragment
≥ entweder aus der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a) oder
≤ aus einer Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a), die zuvor nach einer fragmentspezifischen Eigenschaft aufgetrennt worden ist,
gewonnen wird.
Die interessierenden Fragmente werden hierbei vorzugsweise durch spezifische PCR- Amplifikation aus einem Gemisch von Nukleinsäurefragmenten gewonnen, bei der fragmentspezifische Oligonukleotidprimer eingesetzt werden, welche durch die in Schritt (cd) ermittelten Signaturen zugänglich und herstellbar sind.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft eines der vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem eine Mischung aus Nukleinsäurefragmenten nach Schritt a) oder eine Teilmenge dieser Mischung aus Nukleinsäurefragmenten nach Schritt a) bereitgestellt wird, die durch die folgenden Schritte hergestellt wurde:

a) beidseitige Flankierung der Restriktionsfragmente der Mischung mit identischen oder verschiedenen Adaptern
b) Hybridisierung der Fragmente aus Schritt (i) mit jeweils unterschiedlichen Primern, die alle zu den Adaptern aus Schritt (i) komplementäre Bereiche aufweisen und die an ihrem 3'-Ende jeweilig ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, welche über den zum Adapter komplementären Bereich hinausragen und komplementär zu einer Teilmenge der Fragmente aus der Nukleinsäuremischung aus (a) sind.
c) sequenzspezifische Extension der Primer aus ii) und gegebenenfalls anschließende PCR-Amplifikation der Nukleinsäurefragmente aus der Fragmentmischung, die in Schritt ii) sequenzspezifisch verlängert worden waren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Verfahren zur Genexpressionsanalyse bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:

1. Bereitstellung mindestens einer Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten, insbesondere einer Mischung von cDNA-Fragmenten, aufweisend mindestens eine Erkennungsstelle für eine außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonuklease,
2. Auftrennung der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten nach mindestens einer fragmentspezifischen Eigenschaft,
3. gegebenenfalls Detektion der relativen Häufigkeit einiger oder aller Fragmentsorten in der aufgetrennten Mischung,
4. gegebenenfalls Vergleich der in (b1) und/oder (c1) erhaltenen Informationen über die Zusammensetzung verschiedener Mischungen von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a1),
5. gegebenenfalls Registrierung von in (d1) detektierten Nukleinsäure-Fragmenten, welche in verschiedenen Mischungen von Nukleinsäure-Fragmenten in unterschiedlicher relativer Häufigkeit auftreten,
6. Inkubation einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten, ausgewählt aus der Gruppe I: eine Teilmenge der Mischung aus (a1), II: die in (b1) aufgetrennte Mischung von cDNA-Fragmenten oder ein Teil hiervon, III: eine mit der Mischung aus (a1) oder der aufgetrennten Mischung aus (b1) mindestens teilweise identische Mischung von Nukleinsäurefragmenten, mit der Restriktionsendonuklease oder den Restriktionsendonukleasen aus Schritt (a1),
7. Identifikation eines ersten Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (f1), wobei die Identifikation simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,
8. gegebenenfalls Identifikation eines weiteren Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (f1), wobei die Identifikation simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,
9. gegebenenfalls Wiederholung von Schritt (h1), bis die gewünschte Anzahl von Nukleotiden identifiziert worden sind,
10. Zusammenfassung der in den Schritten (g1) bis (i1) erhaltenen Sequenzinformation für eine ausgewählte Gruppe oder alle Nukleinsäure-Fragmente zu fragmentspezifischen Signaturen, wobei eine Signatur neben der Sequenzinformation noch weitere Informationen über das jeweilige Fragment enthalten kann,
11. gegebenenfalls Gewinnung interessierender Fragmente aus der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a1) oder (b1),
12. gegebenenfalls Identifikation der zu den interessierenden Nukleinsäure-Fragmenten gehörigen Gene, von denen sich die Nukleinsäure-Fragmente herleiten, mittels Durchsuchen elektronischer Datenbanken.

Die Erzeugung von Mischungen von Nukleinsäure-Fragmenten, vorzugsweise von Mischungen von cDNA-Fragmenten kann nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vorgenommen werden. Beispielsweise beschreibt EP 0 743 367 die Erzeugung von mittels häufig schneidender Restriktionsendonukleasen gewonnener, die 3'-Enden von cDNA-Molekülen repräsentierender und auf einer Seite von Linkem flankierter Fragmente, welche mittels selektiver (an ihrem 3'-Ende über die allen Primern eines Typs gemeinsame "universelle" Bindungsstelle hinaus um eine oder mehrere "selektive" Nukleotide verlängerter) PCR-Primer in Form mehrerer Untergruppen ("Subpools") amplifiziert werden. Jede dieser Untergruppen besteht dann aus einer Teilmenge der zunächst erzeugten Gesamtheit aller cDNA-3'-Fragmente. Einander entsprechende (d. h. mit den gleichen selektiven Primern erzeugte), aus verschiedenen auf differentiell exprimierte Gene zu untersuchende RNA-Präparationen gewonnene Fragment-Subpools werden dann gelelektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt, und die erhaltenen Banden- bzw. Signalmuster werden miteinander verglichen. Banden bzw. Signale zwischen verschiedenen Proben unterschiedlicher Intensität repräsentieren Gene, die in den verglichenen Proben unterschiedlich stark exprimiert sind.
Bei der fragmentspezifischen Eigenschaft handelt es sich um eine, insbesondere physikalische oder physikochemische, Eigenschaft, welche von verschiedenen Molekülen innerhalb eines Kontinuums oder in Form einer größeren Anzahl (beispielsweise mindestens 10 oder mindestens 100) unterschiedlicher Abstufungen oder Ausprägungen verwirklicht sein kann. Besonders bevorzugt ist die Ausnutzung unterschiedlicher Mobilität verschiedener Nukleinsäurefragmente in Trennsystemen, insbesondere unterschiedlicher elektrophoretischer Mobilität in Elektrophoresesystemen wie Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese. Hierbei ist die Mobilität in der Regel von der Länge eines Fragments beeinflußt; allerdings handelt es sich um keine streng lineare Beziehung, da auch G/C-Gehalt und Konformation eines Nukleinsäuremoleküls die Mobilität beeinflussen. Daher kann die Mobilität eines Nukleinsäuremoleküls in der Regel lediglich zur ungefähren, nicht aber zur absoluten Größenbestimmung herangezogen werden.
Die Detektion der relativen Häufigkeit einiger oder aller Fragmentsorten erfolgt über Messung der bei der Detektion einzelner Nukleinsäurefragmente erhaltenen Signalstärke. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Nukleinsäurefragmente detektierbare Markierungsgruppen, wobei der Einsatz von Fluorophoren als Markierungsgruppen besonders bevorzugt ist. Wird zur Auftrennung und Detektion beispielsweise ein automatisches Sequenzierungsgerät verwendet, so ist die relative Häufigkeit einer Fragmentsorte ("eines Fragments") als Fläche unter der entsprechenden Farbkurve im Fluorogramm (der Auftragung der gemessenen Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Retentionszeit) in Form eines Zahlenwerts leicht erhältlich. Unter einer Fragmentsorte ist hierbei die Gesamtheit aller sequenzidentischen Nukleinsäuremoleküle einer Mischung zu verstehen, gegebenenfalls zuzüglich der Nukleinsäuremoleküle hierzu komplementärer Sequenz. Oft werden die als relative Häufigkeit von Fragmentsorten erhaltenen Zahlenwerte in computerlesbarer Form gespeichert.
Im Schritt der Registrierung von Nukleinsäure-Fragmenten, vorzugsweise von cDNA- Fragmenten, unterschiedlicher relativer Häufigkeiten werden diejenigen Fragmente identifiziert, welche sich in ihrem Anteil zwischen verschiedenen biologischen Proben bzw. zwischen verschiedenen Mischungen von cDNA-Fragmenten unterscheiden. Wird dafür Sorge getragen, daß aus den in den Proben vorhandenen mRNA-Molekülen cDNA- Fragmente erzeugt werden, deren Häufigkeitsverteilung der Häufigkeitsverteilung der verschiedenen mRNA-Moleküle ähnlich ist oder ihr sogar gleicht, so zeigen cDNA- Fragmente zwischen miteinander verglichenen Fragmentmischungen unterschiedlicher Häufigkeit auch mRNA-Moleküle unterschiedlicher Häufigkeit und somit differentiell exprimierte Gene an. Um kleinere Schwankungen beispielsweise in der Effizienz der zuvor erfolgten enzymatischen Schritte oder der Detektion zu kompensieren, kann gegebenenfalls ein Schwellenwert für Häufigkeitsunterschiede festgelegt werden, so daß beispielsweise nur diejenigen cDNA-Fragmente weiter untersucht werden, deren relative Häufigkeit zwischen miteinander verglichenen Fragmentmischungen sich um mindestens den Faktor zwei unterscheidet.
Die simultane Identifikation eines Nukleotids oder mehrerer Nukleotide für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt vorzugsweise, indem wie oben beschrieben an den überhängenden Fragmentenden ein für die Identität des zu identifizierenden Nukleotids charakteristischer Prozeß durchgeführt wird, für den eine Mischung aus mehreren oder allen Nukleinsäurefragmenten eingesetzt wird und dessen Ergebnis sich vorzugsweise über den Einbau einer Markierung, insbesondere einer Fluoreszenzmarkierung, beobachten läßt. Hierbei ist bevorzugt, daß die identifizierten Nukleotide in Nachbarschaft zueinander liegen, die so erhaltenen Informationen über die Nukleotididentitäten also eine zusammenhängende Teilsequenz des jeweiligen Nukleinsäurefragments ergeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Ablauf besagten Prozesses, der "Sequenzierungsreaktion", eine Auftrennung der im Prozeß entstandenen Produkte vorgenommen, wobei hier die Auftrennung wiederum nach der fragmentspezifischen Eigenschaft aus (b2) erfolgt.
Bei der Zusammenfassung der erhaltenen Sequenzinformationen zu fragmentspezifischen Signaturen wird jedem oder einigen der aufgetrennten Nukleinsäuremoleküle die für einige Positionen erhaltene Nukleotididentität zugeordnet.
Die über ein Fragment erhaltene Information wird als Signatur bezeichnet. Hierbei kann die Signatur neben Sequenzinformation noch weitere Informationen enthalten, beispielsweise auf andere Weise erhaltene Sequenzinformation oder über die Fragmentmobilität erhaltene ungefähre Fragmentgröße. Werden beispielsweise gemäß o. g. EP 0 743 367 cDNA-3'-Fragmente unter Verwendung der Restriktionsendonuklease RsaI (Erkennungssequenz GTAC) erzeugt und einem ausgewählten Fragment, von der Erkennungsstelle für RsaI aus gesehen, den in Schritten (g2) bis (12) ermittelten Nukleotiden die Identität A (1. Nukleotid), G (2. Nukleotid), T (3. Nukleotid) sowie A (4. Nukleotid) zugewiesen, so läßt sich hieraus eine Sequenzsignatur der Nukleotidsequenz GTACAGTA erzeugen. Neben der ungefähren Fragmentgröße könnte als weitere Randinformation noch aufgenommen werden, daß sich (einen vollständigen Ablauf des RsaI-Verdaus vorausgesetzt) zwischen der Teilsequenz GTAC und dem 3'-Fragmentende naturgemäß keine weitere identische Teilsequenz befinden kann. Jedenfalls können fragmentspezifische Signaturen für alle oder einen Teil der in einer Fragmentmischung enthaltenen Fragmente definiert werden. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur vergleichenden Genexpressionsanalyse werden Signaturen insbesondere für diejenigen Fragmente definiert, welche sich in ihrer relativen Häufigkeit innerhalb der zu vergleichenden Fragmentmischungen um mindestens einen festgelegten Faktor unterscheiden.
Im übrigen muß es sich bei dem Sequenzanteil einer Signatur keinesfalls um eine zusammenhängende Sequenz handeln. So ist es beispielsweise denkbar, daß von einem gegebenen Fragment terminale Nukleotidsequenz beider Fragmentenden bestimmt und zu einer Signatur zusammengefaßt werden; auch hierbei ist es selbstverständlich möglich, weitere Informationen wie z. B. ungefähre Fragmentlänge in die Signatur aufzunehmen. Beispielsweise könnte für ein bestimmtes Fragment die Signatur

5'-CTCA{192}GGAT-3'

bedeuten, daß das Fragment mit der Nukleotidsequenz CTCA am 5'-Ende "beginnt", mit der Nukleotidsequenz GGAT am 3'-Ende "aufhört" und insgesamt ungefähr 200 bp ( = 4 bp + 192 bp + 4 bp) lang ist.
Die Gewinnung interessierender Fragmente aus der Mischung von Nukleinsäure- Fragmenten, vorzugsweise von cDNA-Fragmenten kann unter Zuhilfenahme der ermittelten fragmentspezifischen Signaturen beispielsweise mittels PCR mit Hilfe genspezifischer Primer erfolgen. Wurde etwa im oberen Beispiel eine Mischung von 3'- cDNA-Fragmenten mittels der Restriktionsendonuklease RsaI gewonnen, gefolgt von der Ligation von Linkem an die erzeugten (glatten) Fragmentenden, und wurde für ein ausgewähltes Fragment die obige Signatur GTACAGTA erhalten, so ist über das Fragment bekannt, daß nach erfolgtem RsaI-Schnitt (Entfernung u. a. der ersten beiden Nukleotide der RsaI-Erkennungsstelle, GT) die ersten auf die Linkersequenz folgenden Nukleotide die Sequenz ACAGTA darstellen. Wird nun ein Primer zur PCR-Amplifikation eingesetzt, welcher auf die Linkersequenz an seinem 3'-Ende folgend eben diese Nukleotidsequenz ACAGTA aufweist, so ist das zugehörige Fragment direkt durch Amplifikation aus der Fragmentmischung zugänglich, da besagter Primer selektiv eine Amplifikation derjenigen Fragmente begünstigt, mit denen er über seine volle Länge sequenzidentisch (bzw. komplementär hierzu) ist. Das so erhaltene Fragment kann dann einer weiteren Analyse unterzogen werden, beispielsweise einer Sequenzierung, gefolgt von einer Datenbankabfrage nach sequenzidentischen oder sequenzähnlichen Einträgen.
Die Identifikation der zu den interessierenden Nukleinsäure- bzw. cDNA-Fragmenten gehörigen Gene mittels Durchsuchen elektronischer Datenbanken kann erfolgen, wenn der Informationsgehalt einer Signatur hoch genug ist, um eine eindeutige oder weitgehend eindeutige Identifikation eines Gens zuzulassen, und wenn die Datenbank entsprechende Einträge aufweist. Wie hoch der Informationsgehalt von Signaturen einer biologischen Spezies sein muß, um eine eindeutige Zuordenbarkeit einer Signatur zum zugehörigen Gen zu erlauben, ist empirisch zu ermitteln und kann selbst innerhalb einer biologischen Spezies von Gen zu Gen verschieden sein; so kann es etwa vorkommen, daß ein bestimmtes Decamer (eine aus 10 Nukleotiden bestehende Signatur) charakteristisch für ein einziges Gen ist, während ein anderes Decamer in zahlreichen verschiedenen Genen auftritt.
In einer bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die für interessierende Nukleinsäurefragmente erhaltenen Signaturen zur Identifizierung der Nukleinsäurefragmente in einer Datenbanksuche eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die für interessierende Nukleinsäurefragmente erhaltenen Signaturen eingesetzt, um fragmentspezifische Oligonukleotidprimer zu entwerfen. Bei dieser Anwendung ist weiterhin bevorzugt, die erhaltenen Oligonukleotidprimer zur Amplifikation ausgewählter Fragmente einzusetzen, wobei als Amplifikationstemplate die Mischung von Nukleinsäurefragmenten oder eine Teilmenge hiervon eingesetzt wird.
In einer weiteren bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als Mischung von Nukleinsäurefragmenten Mischungen aus genomischer DNA oder cDNA erzeugter, beidseitig von identischen oder verschiedenen Adaptern flankierter Restriktionsfragmente eingesetzt, wobei die adapterflankierten Fragmente zunächst einer Amplifikation mittels an ihrem 3'-Ende über den zum Adapter komplementären Bereich hinaus um eine oder mehrere Nukleotide verlängerter Primer unterzogen werden und die so erhaltenen Amplifkationsprodukte zur Durchführung des Verfahrens eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als Mischung von Nukleinsäurefragmenten solche Fragmente eingesetzt, welche durch Restriktionsverdau mit Restriktionsendonukleasen vom Typ IIs aus genomischer oder cDNA erzeugt wurden und welche einseitig oder beidseitig von Adaptorsequenzen flankiert sind. Bei dieser Anwendung werden von der oder den eingesetzten Typ IIs- Restriktionsendonukleasen überhängende Enden erzeugt, deren Sequenz nicht unmittelbar durch die Restriktionsendonuklease, sondern durch die Nukleinsäuresequenz der Schnittstelle determiniert wird und die sich folglich von Fragment zu Fragment unterscheiden können. Gewünschtenfalls können zur Befestigung Adapter eingesetzt werden, welche sich lediglich an bestimmten überhängenden Enden befestigen lassen, insbesondere an solchen, deren Nukleotidsequenz komplementär ist zur Nukleotidsequenz der überhängenden Adapter-Enden. Auf diese Weise ist es möglich, bestimmte vorausgewählte Adapter lediglich an einem Teil aller Nukleinsäurefragmente zu befestigen und somit eine Teilmenge der eingesetzten Mischung von Nukleinsäurefragmenten zu erzeugen (sog. "molekulare Indexierung", vgl. Kato, Nucleic Acids Res. 1996, Jan. 15, 24 (2): 394-395).
Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 die Erzeugung adapterflankierter Nukleinsäurefragmente,
Fig. 2 die Sequenzierung überhängender Fragmentenden mittels Adapterligation,
Fig. 3 die Erzeugung verschiedener überhängender Enden durch Verkürzung eines Nukleinsäurefragments,
Fig. 4 die Identifikation eines Nukleotids für alle Fragmente einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten,
Fig. 5 die Identifikation von vier Nukleotide für alle Fragmente einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten.
Fig. 1 zeigt die Erzeugung adapterflankierter Nukleinsäurefragmente, wobei

1. 1 die Fragmentierung einer Nukleinsäurepräparation mittels zweier Restriktionsendonukleasen, und
2. 2 die Befestigung von Adaptern an den Fragmentenden

Fig. 2 zeigt die Sequenzierung überhängender Fragmentenden mittels Adapterligation, wobei

1. 1 die Sequenzierung der ersten Position der überhängenden Enden, und
2. 2 die Sequenzierung der zweiten Position der überhängenden Enden zeigt. Es ist die Sequenzierung eines das 3'-Ende eines cDNA-Moleküls repräsentierenden Nukleinsäurefragments gezeigt. Die zur Sequenzierung eingesetzten Adapter zeichnen sich durch verschiedene Sequenz der überhängendenden Enden sowie durch verschiedene Markierungsgruppen aus, welche für die Sequenz des jeweiligen überhängenden Endes codieren. Eine die Base A anzeigende Markierungsgruppe wird durch einen gepunkteten Adapter, eine ein C anzeigende Markierung durch einen schraffierten Adapter, eine ein G anzeigende Markierung durch einen ausgefüllten Adapter und eine ein T anzeigende Markierung durch einen kreuzschraffierten Adapter angezeigt. Eine in (1) durch Ligation am Fragment befestigte, ein T anzeigende Markierungsgruppe zeigt an, daß es sich bei der ersten Base des Überhangs um die hierzu komplementäre Base A handelt. Eine in (2) durch Ligation am Fragment befestigte, ein C anzeigende Markierungsgruppe zeigt an, daß es sich bei der zweiten Base des Überhangs um die hierzu komplementäre Base G handelt.

Fig. 3 stellt die Erzeugung verschiedener überhängender Enden durch Verkürzung eines Nukleinsäurefragments dar, wobei

1. 1 die Befestigung dreier verschiedener, jeweils an unterschiedlicher Position eine Erkennungsstelle (schraffierter Bereich) für eine Typ IIS- Restriktionsendonuklease enthaltender Adaptoren,
2. 2 die Inkubation der Befestigungsprodukte mit besagter Typ IIS- Restriktionsendonuklease, und
3. 3 die Freisetzung verkürzter überhängender Fragmentenden zeigt, welche in Bezug auf den doppelsträngigen Bereich des Ausgangsfragments die Positionen -5 und -6 (links), -3 und -4 (Mitte) sowie -1 und -2 (rechts) in terminal-einzelsträngiger und damit einer Sequenzierung über Adapterligation zugänglicher Form enthalten, zeigt. Als Ausgangsfragment ist hier ein mittels der Restriktionsendonuklease MboI gewonnenes 3'-cDNA-Fragment dargestellt.

Fig. 4 beschreibt die Identifikation einer Base für alle Fragmente einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten. Die Fragmente werden mit fluoreszenten Markierungsgruppen versehen und mittels Kapillargelelektrophorese nach ihrer Mobilität aufgetrennt. Das resultierende Fluorogramm (oben dargestellt) wird zu einer Katalogisierung der Fragmente (Vergabe durchlaufender Nummern) eingesetzt. Danach werden für die zu bestimmende Position der Fragmente gemäß obiger Beschreibung die dort befindlichen Nukleotide identifiziert. Nach Durchführung der entsprechenden Reaktionen, bei denen die Identität besagter Nukleotide mittels Einführung nukleotidspezifischer Markierungsgruppen codiert wird, werden die Produkte ebenfalls mittels Kapillargelelektrophorese aufgetrennt, und die Identität der eingeführten Markierungsgruppen unter Berücksichtigung von Mobilität und ggf. Signalintensität ermittelt. Die Identifikation der interessierenden Base ergibt "G" für Fragment 3, "A" für Fragment 2, "T" für Fragmente 1 und 6, sowie "C" für die Fragmente 4, 5 und 7.
Fig. 5 zeigt die Identifikation von vier Nukleotiden für alle Fragmente einer Mischung von Nukleinsäurefragmenten (Fragmente 1-7). Im Falle der direkten Aufeinanderfolge der vier Nukleotiden ergeben sich folgende Sequenzsignaturen:
Fragment 1: TGTA
Fragment 2: ATGA
Fragment 3: GATG
Fragment 4: CCGT
Fragment 5: CACC
Fragment 6: TGAT
Fragment 7: CTCC

Claims

1. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurefragmenten, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung mindestens einer Mischung von solchen Nukleinsäurefragmenten, die mindestens eine Erkennungsstelle für eine außerhalb ihrer Erkennungsstelle schneidende Restriktionsendonuklease aufweisen,

b) Inkubation zumindest einer Teilmenge der Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus Schritt (a) mit mindestens einer Restriktionsendonuklease, deren Schnittstelle außerhalb ihrer Erkennungsstelle liegt,

c) Bestimmung einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b), die simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Rahmen der Bestimmung in Schritt (c) zusätzlich die Auftrennung der geschnittenen Nukleinsäurefragmente nach fragmentspezifischen Eigenschaften erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der geschnittenen Nukleinsäurefragmente nach fragmentspezifischen Eigenschaften durch Gelelektrophorese erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung durch Kapillarelektrophorese erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt (c) die folgenden Einzelschritte (ca) bis (cd) umfaßt:

a) Bestimmung eines ersten Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b), wobei die Bestimmung simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,

b) gegebenenfalls Bestimmung eines ersten weiteren Nukleotids der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b), wobei die Bestimmung simultan für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente erfolgt,

c) gegebenenfalls Wiederholung von Schritt (cb), bis die gewünschte Anzahl von Nukleotiden bestimmt worden ist,

d) Zusammenfassung der in den Schritten (ca) bis (cc) erhaltenen Sequenzinformation für eine ausgewählte Gruppe oder alle Nukleinsäure-Fragmente zu fragmentspezifischen Signaturen, wobei eine Signatur neben der Sequenzinformation noch weitere Informationen über das jeweilige Fragment enthalten kann,

wobei die Nukleotidbestimmung in den Schritten (ca) bis (cc) gegebenenfalls auch die Auftrennung der Nukleinsäurefragmente der Mischung mit umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine von der in Schritt (b) zu inkubierenden Teilmenge verschiedene Teilmenge der in Schritt (a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten den folgenden Verfahrensschritten (aa) bis (ad) unterworfen wird:

a) Auftrennung der Mischung von Nukleinsäurefragmenten nach mindestens einer fragmentspezifischen Eigenschaft,

b) gegebenenfalls Detektion der relativen Häufigkeit einiger oder aller Fragmentsorten in der in (aa) aufgetrennten Mischung,

c) gegebenenfalls Vergleich der in (aa) und/oder (ab) erhaltenen Informationen über die Zusammensetzung verschiedener Mischungen von Nukleinsäurefragmenten aus Schritt (a),

d) gegebenenfalls Registrierung von in (ab) detektierten Nukleinsäurefragmenten, welche in verschiedenen Mischungen von Nukleinsäurefragmenten in unterschiedlicher relativer Häufigkeit auftreten,

während eine andere Teilmenge ausgewählt aus der Gruppe (I) bis (III) nach den Schritten (b) und (c) behandelt wird, wobei

A) eine weitere Teilmenge der in Schritt (a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten,

B) eine Teilmenge der in Schritt (a) bereitgestellten Mischung von Nukleinsäurefragmenten, die zuvor nach mindestens einer fragmentspezifischen Eigenschaft aufgetrennt worden ist,

C) eine mit (I) oder (II) zumindest zum Teil identische Mischung von Nukleinsäurefragmenten,

ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mindestens ein interessierendes Fragment
entweder aus der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a) oder
aus einer Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a), die zuvor nach einer fragmentspezifischen Eigenschaft aufgetrennt worden ist,
isoliert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mindestens ein interessierendes Fragment
entweder aus der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a) oder
aus einer Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten aus (a), die zuvor nach einer fragmentspezifischen Eigenschaft aufgetrennt worden ist,
isoliert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in dem zusätzlichen Verfahrensschritt zur Isolierung von Fragmenten fragmentspezifische Oligonukleotidprimer unter Verwendung der in Schritt (cd) ermittelten Signaturen hergestellt und anschließend zur spezifischen Amplifikation dieser Fragmente mittels PCR aus dem Gemisch von Nukleinsäurefragmenten eingesetzt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (cd) erhaltenen Signaturen einzelner Nukleinsäurefragmente der Fragmentmischung in einer Datenbanksuche zur Identifizierung dieser Fragmente eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus (a) eine Mischung von cDNA-Fragmenten oder eine Mischung von Fragmenten genomischer DNA ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus (a) Restriktionsfragmente umfaßt, die aus der Inkubation eines Nukleinsäure-Gemisches mit mindestens einem Restriktionsenzym hervorgegangen sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Mischung von Nukleinsäurefragmenten aus (a) mindestens eine weitere Teilmenge bereitgestellt wird, die durch die folgenden Schritte hergestellt wird:

a) beidseitige Flankierung der Restriktionsfragmente der Mischung mit identischen oder verschiedenen Adaptern

b) Hybridisierung der Fragmente aus Schritt (i) mit jeweils unterschiedlichen Primern, die alle zu den Adaptern aus Schritt (i) komplementäre Bereiche aufweisen und die an ihrem 3'-Ende jeweilig ein oder mehrere Nukleotide aufweisen, welche über den zum Adapter komplementären Bereich hinausragen und komplementär zu einer Teilmenge der Fragmente aus der Nukleinsäuremischung aus (a) sind.

c) sequenzspezifische Extension der Primer aus (ii) und gegebenenfalls anschließende PCR-Amplifikation der Nukleinsäurefragmente aus der Fragmentmischung, die in Schritt (ii) sequenzspezifisch verlängert worden waren.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Mischung aus Nukleinsäurefragmenten aus Schritt (a) dadurch bereitgestellt wird, daß die jeweiligen Nukleinsäurefragmente der zu analysierenden Fragmentmischung mit einem oder mehreren Linkem ligiert werden, die an mindestens einer spezifischen Position mindestens eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease besitzen, deren Schnittstelle außerhalb ihrer Erkennungsstelle liegt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen Nukleinsäurefragmente der zu analysierenden Fragmentmischung mit jeweils mehreren verschiedenen Linkern ligiert werden, die sich untereinander in der Position der Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease unterscheiden, deren Schnittstelle außerhalb ihrer Erkennungsstelle liegt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente simultane Bestimmung einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b) über das Auffüllen überhängender Enden mit einer Mischung aus Desoxynukleotid- und markierten Didesoxynukleotid-Triphosphaten nach der Sequenzierungsmethode nach Sanger durchgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt c) für mehrere oder alle Nukleinsäurefragmente simultane Bestimmung einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b) über die folgenden Schritte (cm) bis (cp) erfolgt:

a) Hybridisierung jeweils eines Stranges der Nukleinsäurefragmente aus (b) mit selektiven Oligonukleotidprimern, deren am 3'-Ende gelegenes Nukleotid oder Nukleotide mit dem oder den zu sequenzierenden Nukleotiden des jeweiligen Stranges hybridisieren können

b) Extension dieser selektiven Oligonukleotidprimer;

c) Identifikation derjenigen selektiven Oligonukleotidprimer, welche in Schritt (cn) verlängert wurden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die parallele Bestimmung einer oder mehrerer Nukleotide der geschnittenen Nukleinsäurefragmente aus (b) über die sequenzspezifische Befestigung von Adaptoren mit überhängenden Enden geeigneter Länge und Sorte erfolgt, welche sich in ihrem Überhang voneinander unterscheiden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die überhängenden Enden der eingesetzten Adaptoren einen degenerierten Anteil und einen Anteil mit definierter Sequenz umfassen.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Adaptoren, deren überhängende Enden unterschiedliche Anteile mit definierter Sequenz umfassen, unterschiedlich markiert sind.