DE3938853A1 - Verfahren zum nachweis abweichender nukleotidsequenzen, hybridisierungssonden fuer dieses verfahren sowie derartige sonden enthaltender kit - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von wenigstens einer abweichenden (varianten) Sequenz bei einem einzigen Test sowie Kits für die Verwendung bei einem derartigen Verfahren.

Die vorliegende Erfindung ist von speziellem Interesse für das diagnostische Screening von DNA-Proben auf Erbleiden.

Es ist bekannt, daß beim Menschen mehrere hundert genetische Erkrankungen existieren, die auf spezielle Mutationen auf dem DNA-Niveau zurückzuführen sind. Die molekulare Basis für bestimmte dieser Erkrankungen ist bereits bekannt, und die Forschung führt sehr rasch zur Aufdeckung der molekularen Basis für solche genetischen Erkrankungen, für die gegenwärtig die Natur der Mutation noch unbekannt ist. Wenn die präzise molekulare Basis für das Erbleiden nicht bekannt ist, dann kann eine Diagnose der Störung oder die Lokalisierung der Träger nach der RFLP-Technologie erfolgen. So kann beispielsweise gegenwärtig die Duchenne-Muskeldystrophie, die Mukoviszidose und die Chorea Huntington beispielsweise unter Verwendung der RFLP-Technologie diagnostiziert werden. Derartige Tests müssen jedoch getrennt im Hinblick auf jedes einzelne Leiden durchgeführt werden, und es ist eine erhebliche Arbeitsleistung erforderlich, wobei in jedem Fall u. a. Southern Blotting, Hybridisierung und Stammbaumanalyse erforderlich ist. Von bestimmten anderen Erbleiden ist es bekannt, daß sie einzelnen Punktmutationen von Genen zugeschrieben werden können, wobei jedoch jedes dieser Leiden getrennt analysiert werden muß und spezielle Schwierigkeiten dann auftreten, wenn die Punktmutationen heterogen sind. So können beispielsweise mehr als 20 verschiedene Punktmutationen eine β-Thalassämie bewirken, und wenigstens 5, wahrscheinlich viel mehr als 12 Punktmutationen können eine Hämophilie A bewirken.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entwicklung eines Verfahrens, das die oben erwähnten Schwierigkeiten dadurch mildert, daß nach diesem Verfahren die Anwesenheit oder das Fehlen von wenigstens einer abweichenden (varianten) nachzuweisenden Sequenz bei einem Einzeltest festgestellt werden kann, und dieses Verfahren daher für das diagnostische Screening von DNA-Proben auf Erbleiden einschließlich Veranlagungen von Interesse ist.

Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von wenigstens einer abweichenden Sequenz bei einzigen Test geschaffen, wobei das Verfahren umfaßt:

• 1) Hybridisieren einer ersten nachweisbaren Nukleotidsonde und einer zweiten Nukleotidsonde mit benachbarten Segmenten jedes gewünschten diagnostischen Teils einer Ziel-Basensequenz, wobei die Nukleotidsequenzen der ersten und der zweiten Sonde derart sind, daß dann, wenn ein Hybrid der ersten und der zweiten Sonde mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz gebildet ist, die erste und die zweite Sonde durch eine Lücke voneinander getrennt sind, wobei diese Lücke von wenigstens zwei Nukleotiden der Zielsequenz definiert wird und wobei diese Nukleotide der normalen und/oder abweichenden Zielsequenz alle bis auf eines der verschiedenen natürlich vorkommenden Nukleotide oder weniger davon umfassen;
• 2) Umsetzen des diagnostischen Teils der Ziel-Basensequenz mit einer oder mehreren Art(en) von Nukleotiden unter Bedingungen, die eine komplementäre Hybridisierung ermöglichen, wobei die verwendete(n) Art(en) von Nukleotiden derart ist (sind), daß entweder das normale oder das abweichende Nukleotid zu ihnen nicht komplementär ist;
• 3) Verküpfen des erhaltenen Hybrids, und
• 4) Feststellen der Anwesenheit oder des Fehlens jeder abweichenden Sequenz durch Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von einer oder mehreren Sonden, die für die Anwesenheit oder das Fehlen jeder abweichenden Sequenz charakteristisch sind,

wobei das Verfahren so ausgeführt wird, daß die Nukleotide, die die Lücke zwischen der ersten und der zweiten Sonde bilden, wenn diese mit dem diagnostischen Teil der Ziel- Basensequenz hybridisiert sind, so gewählt sind, daß eine Verknüpfung der ersten mit der zweiten Sonde nur im Falle von entweder der normalen oder der abweichenden Basensequenz ermöglicht wird, jedoch nicht in beiden Fällen von Sequenzen.

Ein durch Hybridisierung der ersten und der zweiten Sonde mit der Zielsequenz gebildetes Hybrid mit einer Lücke zwischen den genannten Sonden wird in dieser Beschreibung als ein "geteiltes Sondenhybrid" bezeichnet, und ähnlich werden die erste und die zweite Sonde in ihrem unhybridisierten Zustand hier als "Teilsonden" bezeichnet.

Der Ausdruck "abweichende (oder variante) Sequenz" wird in dieser Beschreibung so verwendet, daß er ein einzelnes Nukleotid und auch eine Vielzahl von Nukleotiden umfaßt. Im Hinblick auf den Nachweis von Erbleiden bedeutet der Ausdruck im allgemeinen eines oder mehrere Nukleotide, die mit dem Vorliegen eines Erbleidens oder einer Veranlagung oder einer Heteroszygotie dafür assoziiert sind. Es versteht sich dabei für den Fachmann, daß der Nachweis der Anwesenheit einer abweichenden Sequenz entweder durch positiven Nachweis dieser Sequenz anhand des Nachweises einer Verknüpfung geeigneter Teilsonden erfolgen kann, oder durch Nachweis des Fehlens einer bekannten normalen Sequenz durch Nachweis einer unterbliebenen Verknüpfung der geeigneten Teilsonden. In ähnlicher Weise kann das Fehlen einer abweichenden Sequenz entweder dadurch nachgewiesen werden, daß man positiv die Anwesenheit einer bekannten normalen Sequenz durch Nachweis der Verknüpfung der geeigneten Teilsonden nachweist, oder dadurch, daß man das Fehlen der abweichenden Sequenz dadurch nachweist, daß man das Unterbleiben der Verknüpfung der geeigneten Teilsonden nachweist.

So kann beispielsweise die Anwesenheit oder das Fehlen der gewünschten abweichenden Sequenz dadurch bestimmt werden, daß man irgendwelche verknüpften Sonden mit einer Sequenz nachweist, die homolog, vorzugsweise vollständig homolog zu dem Teil der Zielsequenz ist, mit dem sie hybridisiert werden, wobei eine derartige verknüpfte Sonde den diagnostischen Bereich der Zielsequenz charakterisiert, mit der sie hybridisiert ist.

Bezüglich jeder potentiellen abweichenden Sequenz muß die erste Nukleotidsonde nachweisbar sein, während die zweite Nukleotidsonde nach Wunsch nachweisbar sein kann oder nicht.

Der Begriff "nachweisbar" meint im vorliegenden Zusammenhang, daß ein Nachweis möglich ist. So muß die erste Nukleotidsonde nicht unbedingt eine Signalgruppe wie ein radioaktives Label oder einen nicht-radioaktiven Signalkomplex tragen, obwohl diese natürlich vorhanden sein können, wenn die Sonde anschließend so behandelt werden kann, daß sie in die Lage versetzt wird, ein Signal zu erzeugen.

Der Ausdruck "diagnostischer Teil" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang denjenigen Teil der Ziel-Basensequenz (wie diese nachfolgend definiert wird), der die potentiell abweichende Sequenz enthält, deren Anwesenheit oder Fehlen nachgewiesen werden soll.

Der Ausdruck "Ziel-Basensequenz" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine Nukleotidsequenz mit wenigstens einem diagnostischen Teil (wie dieser weiter oben definiert wurde). So kann beispielsweise bei einem Einzeltest auf β-Thalassämie die Zielsequenz bis zu 50 diagnostische Teile enthalten, wobei jeder diagnostische Teil eine einzige potentielle abweichende Sequenz enthält. Wenn eine Ziel-Basensequenz vorliegt, die nur eine einzige potentiell abweichende Sequenz enthält, so wird das Verfahren unter Verwendung von mehr als einer Ziel- Basensequenz durchgeführt.

Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist es, daß die Nachweissonden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, den (oder die) diagnostischen Teil(e) der Target-Sequenz charakterisieren, mit dem sie hybridisiert sind. So ist beispielsweise die mit einem diagnostischen Teil der Zielsequenz hybridisierte verknüpfte Sonde von solchen verknüpften Sonden unterscheidbar, die mit anderen diagnostischen Teilen der Zielsequenz hybridisiert sind. Das kann auf irgendeine geeignete Weise erfolgen. So kann beispielsweise jede nachweisbare erste Nukleotidsonde ein unterschiedliches und unterscheidbares Signal oder entsprechende Reste, die ein Signal erzeugen können, tragen. Derartige Signale und Reste die ein Signal erzeugen können, werden nachfolgend im Detail diskutiert, können jedoch beispielsweise das Festphasen-Verstärkungssystem enthalten, das beschrieben wurde von Wang C. G. in: World Biotech Report 1986, Band 2, Teil 2, Seiten 33-37 (Diagnostics Healthcare Proceedings of the conference held in November 1986, San Francisco), bei dem mit vielen ausgewählten Spurenelementen gebildete Mikroperlen mit der Sonde konjugiert sind. Die Anwesenheit von spezifischen verknüpften Sonden kann durch Röntgenfluoreszenzanalyse nachgewiesen werden. Ein sehr viel einfacheres und bevorzugtes Verfahren, die Sonden, beispielsweise die verknüpften Sonden, unterscheidbar zu machen, besteht jedoch darin, sicherzustellen, daß die Länge einer jeden nachweisbaren Sonde, z. B. die Länge jeder nachweisbaren verknüpften Sonde, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet werden kann, unterschiedlich ist. Die Anwesenheit oder das Fehlen einer gegebenen potentiellen abweichenden Sequenz kann auf diese Weise vorteilhaft mit Elektrophoresetechniken nachgewiesen werden, bei denen die unterschiedlichen nachweisbaren Sonden, z. B. die verschiedenen nachweisbaren erhaltenen verknüpften Sonden nach ihrem Molekulargewicht verteilt werden und auf diese Weise beispielsweise durch Autoradiographie identifiziert werden können. Die Längen der verknüpften Sonden können dabei um nur ein einziges Nukleotid variieren, wobei jedoch vorzugsweise die Längen sich um wenigstens drei Nukleotide unterscheiden.

Die nachweisbare erste Nukleotidsonde und die zweite Nukleotidsonde sind so, daß sie mit benachbarten Segmenten eines jeden gewünschten diagnostischen Teils hybridisieren. Es versteht sich dabei, daß innerhalb eines jeden diagnostischen Teils die potentiell abweichende Sequenz zwischen dem Segment, mit dem die nachweisbare erste Nukleotidsonde hybridisiert, und dem Segment, mit dem die zweite Nukleotidsonde hybridisiert, vorliegt.

Es versteht sich ferner, daß obwohl die erste und die zweite Sonde beide nicht vollständig homolog zu dem diagnostischen Teil sein müssen, mit dem sie hybridisieren sollen, solange sie zur Hybridisierung fähig bleiben, eine vollständige Homologie vorzuziehen ist. In jedem Falle ist es bevorzugt, daß die Nukleotide der ersten und der zweiten Sonde angrenzend an die Lücke vollständig homolog zu dem diagnostischen Teil sind, mit dem sie hybridisieren sollen.

Die Lücke zwischen den Sonden wird durch wenigstens zwei Nukleotide der Zielsequenz definiert, wobei diese Nukleotide der normalen und/oder der abweichenden Sequenz alle bis auf eines der verschiedenen natürlich vorkommenden Nukleotide oder weniger umfassen. Ferner sind auch die oder mehrere Nukleotidart(en), die für die Umsetzung des diagnostischen Teils der Zielbasensequenz bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, so ausgewählt, daß entweder das normale oder das abweichende Nukleotid dazu nicht komplementär ist. Diese Erfordernisse charakterisieren die Größe der Lücke zwischen den Sonden und legen die Mindestlücke als eine von zwei Nukleotiden fest, während die maximal zulässige Lücke abhängt von der Natur der Nukleotide der Zielsequenz, die die Lücke definieren.

Ferner wird die Lage des normalen oder abweichenden Nukleotids innerhalb der Lücke so gewählt, daß die Chance einer Verknüpfung über eine Lücke aus einem einzigen Nukleotid ohne gleichzeitiges Auffüllen der Lücke durch einschlägige komplementäre Nukleotide beseitigt oder wenigstens vermindert wird. Zu einer solchen Situation kann es kommen, wenn die erste und die zweite Sonde so mit dem diagnostischen Teil der Zielsequenz hybridisiert werden, daß eine Lücke aus wenigstens zwei Nukleotiden wie oben beschrieben, erhalten wird und das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die Auffüllung der Lücke so durchgeführt wird, daß zuletzt eine Lücke aus nur einem einzigen Nukleotid gebildet wird, wobei das einzige Nukleotid, das die Lücke bildet, entweder das normale oder das nachzuweisende Nukleotid ist. Es ist dann möglich, daß ein Verknüpfen der ersten und zweiten Sonde erfolgt, und zwar unabhängig davon, ob die Lücke aus einem Nukleotid aufgefüllt wurde oder nicht, was dazu führt, daß es nicht zuverlässig möglich ist, zwischen der Anwesenheit eines normalen und eines abweichenden Nukleotids zu unterscheiden. Es ist daher gemäß der vorliegenden Erfindung wichtig, das normale oder abweichende Nukleotid innerhalb des Spalts so anzuordnen, daß dann, wenn das Verfahren in Gegenwart eines Polymerisationsmittels durchgeführt wird, das eine Synthese in der Richtung 5′-3′ bewirkt, ein Nukleotid, das dem normalen oder dem nachzuweisenden abweichenden Nukleotid entspricht, nicht in die terminale 3′-Position in der Lücke eingeführt wird. Wenn das nicht sichergestellt ist, dann wird die erste Sonde um eine geeignete Anzahl von Nukleotiden verlängert und füllt die Lücke außer in der terminalen 3′-Position, so daß eine Lücke aus einem einzigen Nukleotid zurückbleibt mit dem Ergebnis, daß ein Risiko besteht, das die erste und die zweite Sonde über die Lücke hinweg verknüpft werden, und zwar unabhängig davon, ob die Lücke aufgefüllt wurde oder nicht. Ähnlich sollte dann, wenn die Lücke von zwei oder mehr Nukleotiden gebildet wird und das Verfahren in Gegenwart eines Polymerisationsmittels durchgeführt wird, das auf unübliche Weise eine Synthese in der Richtung 3′-5′ initiiert, ein Nukleotid, das dem normalen oder nachzuweisenden abweichenden Nukleotid entspricht, nicht in die terminale 5′-Stellung der Lücke eingeführt werden. Die Nukleotide der Zielsequenz, die die Lücke zwischen den mit der Zielsequenz hybridisierenden Teilsonden definieren, sind auf diese Weise wirksam, eine Verknüpfung der Sonden dann zu ermöglichen, wenn entweder die normale oder die abweichende Zielsequenz vorliegt, jedoch nicht in beiden derartigen Fällen von Zielsequenzen, wodurch die Anwesenheit oder das Fehlen einer abweichenden Sequenz nachgewiesen werden kann.

So kann beispielsweise die Lücke aus zwei oder drei Nukleotiden bestehen, die gleich oder verschieden sein können, oder dann, wenn eines oder mehr der beiden oder drei Nukleotide in der Lücke wiederholt auftritt, dann kann die Lücke im Einklang mit den oben erwähnten Charakteristika so lang sein wie gewünscht. Beispielsweise kann die Lücke zwischen den Teilsonden bei der normalen Zielsequenz durch die Sequenz DC definiert werden und durch GC bei der abweichenden Zielsequenz. Indem man den diagnostischen Teil der normalen Ziel-Basensequenz mit den individuellen Nukleotiden G und A unter Bedingungen umsetzt, die eine komplementäre Hybridisierung ermöglichen, und anschließend eine Verknüpfung der ersten und zweiten Sonden durchführt, so kommt es zur Bildung einer einzigen Sonde einer Länge, die der Summe der Längen der ersten und zweiten Sonde einschließlich der zwei Nukleotide, die zur Auffüllung der Lücke zwischen der ersten und der zweiten Sonde verwendet wurden, äquivalent ist. Wenn man dagegen den diagnostischen Teil der abweichenden Ziel-Basensequenz mit den gleichen individuellen Nukleotiden G und A unter den Bedingungen für eine komplementäre Hybridisierung umsetzt und anschließend versucht, die erste und die zweite Sonde miteinander zu verknüpfen, so kommt es nicht dazu, daß die Länge die ersten Sonde vergrößert wird und es kommt zu keiner Verknüpfung der beiden Sonden. Es ist dann möglich, die normale Ziel-Basensequenz von der abweichenden Basensequenz dadurch zu unterscheiden, daß man das Vorliegen einer einzigen Sonde der errechneten Länge für die Normalsequenz nachweist und die Anwesenheit einer einzigen Sonde der kürzeren errechneten Länge oder gewünschtenfalls von zwei separaten kurzen Sonden im Hinblick auf die abweichende Sequenz nachweist. Ein ähnliches Beispiel kann anhand einer Lücke zwischen den Teilsonden beschrieben werden, die für die normale Zielsequenz durch die Sequenz ACTA und für die abweichende Zielsequenz durch ACGA definiert wird, wobei die individuellen Nukleotide T, G und A dazu verwendet werden, mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz umgesetzt zu werden. Ähnlich kann beispielsweise die Lücke zwischen den Teilsonden bei der normalen Zielsequenz durch die Sequenz ACGT und bei der abweichenden Zielsequenz durch ACCT definiert werden, und zur Umsetzung des diagnostischen Teils der Ziel- Basensequenz werden die individuellen Nukleotide T, G und A verwendet.

Zu der Zielsequenz zwischen benachbarten Segmenten, mit denen die erste und die zweite Nukleotidsonde hybridisiert wurden, komplementäre Nukleotide können vorzugsweise in Gegenwart einer DNA-Polymerase eingeführt werden, beispielsweise in Gegenwart des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I oder von Kälber-Thymus-DNA-Polymerase α, jedoch vorzugsweise von Tag-Polymerase. Die erste und die zweite Nukleotidsonde können auf irgendeine per se bekannte bequeme Weise miteinander verknüpft werden, beispielsweise durch enzymatische Verknüpfung unter Verwendung von beispielsweise einer DNA-Ligase oder durch kovalent/nicht-kovalentes Verbinden unter Verwendung von beispielsweise einer Biotin-Avidin-Verbindung, sie werden jedoch vorzugsweise durch Verknüpfen mit beispielsweise DNA- Ligase verknüpft.

Das oder die zu der Zielsequenz zwischen benachbarten Segmenten, mit denen die erste und die zweite Nukleotidsonde hybridisiert sind, komplementäre(n) Nukleotid(e) werden unter Hybridisierungsbedingungen so zugesetzt, daß nicht komplementäre Nukleotide nicht eingebaut werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Verwendung von nur einem einzigen Nukleotid durchgeführt werden, beispielsweise für die Hybridisierung mit einer AA-, GG-, CC- oder TT-Lücke, es wird jedoch im allgemeinen in Gegenwart von zwei unterschiedlichen Nukleotiden durchgeführt. Eine bequeme Möglichkeit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, für jedes Paar von zuzusetzenden Nukleotiden ein besonderes Reaktionsgefäß zu verwenden. So können bis zu zehn Reaktionsgefäße verwendet werden, und zwar eines für jedes Paar von Nukleotiden. Da es dann bekannt ist, welches spezifische Paar von Nukleotiden zur Bildung einer verknüpften Sonde zugesetzt wurde, ist es möglich festzustellen, ob im relevanten diagnostischen Teil einer Zielsequenz eine normale oder eine abweichende Sequenz vorlag. In einem solchen Falle ist die verwendete DNA-Polymerase mit Vorteil des Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I oder die Kälberthymus- DNA-Polymerase α, vorzugsweise die Tag-Polymerase. Geeigneterweise hat die DNA-Polymerase keine nennenswerte Exonukleasenaktivität.

Obwohl die vorliegende Erfindung besonders nützlich ist, um Oligonukleotide spezifischen Hybridisierungsstellen in komplexen Genomen zuzuführen, beispielsweise um die Anwesenheit von Punkt-Mutationen zu analysieren, so ist sie doch auch von Nutzen zur Analyse von anderen Variationen in komplexen Genomen, wie beispielsweise Translokationen, und derartige Analysen können zusammen mit der Analyse von beispielsweise Punkt-Mutationen bei dem gleichen Test durchgeführt werden. Zur Analyse von Translokationen wird es bevorzugt, daß das nicht nachweisbare zweite Polynukleotid einer Teilsonde einen Teil eines damit assoziierten Bindungspaares trägt und mit Genomsequenzen in der Nähe von potentiellen Translokations- Bruchstellen hybridisiert. Die nachweisbare Sonde ist vorzugsweise bis zu einigen Kilobasen lang und überspannt einen Bereich von potentiellen Translokations-Bruchstellen. Eine quantitative Verknüpfung von Polynukleotiden, die die Teilsonde umfassen, im Anschluß an eine Hybridisierung mit Nukleotiden, die zu dem Spalt aus wenigstens zwei Nukleotiden zwischen den benachbarten Enden der ersten und zweiten Nukleotidsonde komplementär sind, tritt auch nur dann auf, wenn der Genombereich unmittelbar angrenzt und nicht durch Translokationen unterbrochen ist. Das Auftreten einer Translokation hindert einen Teil der nachweisbaren Sonde daran, mit dem nicht nachweisbaren Polynukleotid verknüpft zu werden. Bei einer anschließenden Denaturierung des hybridisierten Polynukleotids und durch Anwendung des anderen Teils des Bindungspaars wird dann ein Teil des nachweisbaren Polynukleotids nicht in Assoziation mit dem Polynukleotid gefunden, das von dem anderen Teil des Bindungspaars komplexiert wurde. Das Bindungspaar enthält vorzugsweise einen Antigen-Antikörper- Komplex oder eine Biotin-Avidin-Wechselwirkung, wodurch beispielsweise die denaturierten Hybride durch eine mit einem Teil des Bindungspaars komplexierte Festphase hindurchgelassen werden können und das Eluat im Hinblick auf die Anwesenheit der nachweisbaren Sonde analysiert werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren geschaffen, das wenigstens eine Analyse einer Translokation in einer Ziel-Basensequenz, z. B. einem komplexen Genom, umfaßt, wobei die nachweisbare erste Nukleotidsonde geeignet ist, über einen Bereich potentieller Translokation(en) zu hybridisieren und die nicht nachweisbare zweite Nukleotidsonde geeignet ist, mit Sequenzen in der Nähe der genannten potentiellen Translokation(en) zu hybridisieren, wobei die nachweisbare zweite Nukleotidsonde einen Teil eines Bindungspaars trägt und wobei das Verfahren die Bildung eines Teilsondenhybrids umfaßt, das einer Hybridisierung mit Nukleotiden unterzogen wird, die komplementär zu der Lücke aus wenigstens zwei Nukleotiden zwischen den benachbarten Enden der ersten und zweiten Nukleotidsonde sind, wonach zur Bildung eines verknüpften Sondenhybrids verknüpft wird.

Gewünschtenfalls kann sowohl die nachweisbare erste Nukleotidsonde als auch die zweite Nukleotidsonde eine solche Einheit tragen, daß nach der Bildung des verknüpften Sondenhybrids und geeignetenfalls Denaturierung ein Signal nur dann nachweisbar ist, wenn eine Nukleotidsequenz erhalten wird, die sowohl die mit der nachweisbaren ersten Nukleotidsonde verknüpfte Einheit als auch die mit der zweiten Nukleotidsonde verknüpfte Einheit trägt. Die Nukleotidsonden können beispielsweise Oligonukleotidsonden sein.

Diese Technik kann beispielsweise unter Anwendung von nicht radioaktiven Energieübertragungsprozeduren (vgl. beispielsweise europäische Patentveröffentlichung Nr. 70 685 der Standard Oil Co.) oder von Enzym-Kanalisierungstechniken (vgl. z. B. europäische Patentveröffentlichung Nr. 95 087 der Syva Co.) in die Praxis umgesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eine Analyse einschließen, bei der eine Zielsequenz oder ein diagnostischer Teil davon einer Hybridisierung mit mehr als zwei Oligonukleotidsonden unterzogen wird, woran sich eine Hybridisierung mit Nukleotiden anschließt, die der (den) Lücke(n) aus wenigstens zwei Nukleotiden zwischen benachbarten Enden der Oligonukleotidsonden komplementär sind, so daß dann, wenn eine komplementäre Zielsequenz vorhanden ist, ein Teilsondenhybrid erhalten wird, wobei die nachweisbare erste Nukleotidsonde eine terminale Oligonukleotidsonde ist, die nachweisbar ist, und die zweite Nukleotidsonde die andere terminale Oligonukleotidsonde ist, die einen Teil eines Bindungspaars trägt, wobei individuelle andere Oligonukleotidsonden separat aber anschließend an eine fortlaufende Zielsequenz zwischen den genannten terminalen Oligonukleotidsonden hybridisiert werden und die individuellen Oligonukleotidsonden verknüpft werden, um die nachweisbare Oligonukleotidsonde mit der Oligonukleotidsonde mit einem daran angefügten Teil eines Bindungspaars zu verknüpfen, um ein verknüpftes Sondenhybrid zu bilden, das dann denaturiert wird und mit dem anderen Teil des Bindungspaars in Berührung gebracht wird, wodurch die nachweisbare verknüpfte Sondennukleotidsequenz einschließlich des Bindungspaars von anderen Nukleotidsequenzen abgetrennt werden kann. Somit weist ein terminales Oligonukleotid (das benachbart zu einer Reihe anderer Oligonukleotide hybridisiert) beispielsweise eine daran angefügte nachweisbare Signaleinheit auf, während das andere terminale Oligonukleotid eine Einheit trägt, die einen Teil eines Bindungspaars bildet und diese Einheit es auf wirksame Weise ermöglicht, das Oligonukleotid in Lösung aus einer Mischung zu gewinnen, die andere Nukleotidsequenzen enthält. Benachbart hybridisierte Oligonukleotide werden miteinander durch eine geeignete Behandlung verknüpft, um die Signaleinheit und die Bindungseinheit über eine verknüpfte Sonde effektiv miteinander zu verbinden. Der Verlust irgendeines individuellen Oligonukleotidhybrids führt dazu, daß es anschließend zu keiner Verbindung der Signaleinheit mit der Bindungseinheit kommt. Das verknüpte Sondenhybrid wird denaturiert und mit dem anderen Teil des Bindungspaars in Berührung gebracht, der ein terminales Oligonukleotid in der verknüpften Sonde erkennt. Die verknüpfte Sonde kann somit gewünschtenfalls von anderen Oligonukleotiden in der Mischung abgetrennt und dann auf die Anwesenheit der nachweisbaren Einheit analysiert werden.

Auf diese Weise hängt die Assoziation des bindenden Oligonukleotids mit dem Signaloligonukleotid davon ab, daß beim Verknüpften benachbarter hybridisierter Oligonukleotide alle benachbarten Oligonukleotide zwischen dem hybridisierten Signaloligonukleotid und dem Bindungsoligonukleotid vorhanden sind. Das Bindungspaar, das eine Abtrennung der verknüpften Sonde mit einer damit assoziierten Bindungseinheit bewirkt, kann Avidin und Biotin sein oder ein Antigen und ein assoziierter spezifischer Antikörper. Diese Ausführungsform ermöglicht die Analyse von längeren Zügen von Ziel-Nukleotidsequenzen als im Falle von nur zwei benachbarten hybridisierenden verknüpften oder geteilten Sonden wie bei den anderen Ausführungsformen.

Wenn es gewünscht wird, daß die Nukleotidsonde ein Signal trägt oder einen Rest, der in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, dann können derartige Signale oder Reste per se bekannt sein, beispielsweise eine radioaktive Markierung.

Der Rest, der in der Lage ist, ein Nichtradioisotopensignal zu erzeugen, kann alternativ auch einen Signalteil umfassen, der normalerweise von dem Oligonukleotid durch eine Abstandshalter- Gruppe getrennt ist. Eine derartige Abstandshalter- Gruppe kann gewünschtenfalls mit dem Signalteil des Komplexes durch eine direkte kovalente Bindung oder durch eine Protein- Liganden oder eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung gebunden sein, beispielsweise eine Avidin-Biotin oder Dinitrophenyl- Antidinitrophenyl-Antikörper-Wechselwirkung. Es versteht sich, daß der Signalteil des Restes selbst in der Lage sein kann, ein Signal zu liefern, oder in der Lage sein kann, bei seiner Wechselwirkung mit einem geeigneten Mittel nach per se bekannten Verfahren ein Signal zu liefern. So enthält beispielsweise ein bevorzugter Signalteil des kovalent gebundenen Rests ein System zur Erzeugung einer enzymatisch aktivierten Farbveränderung. Bevorzugte Enzymsysteme umfassen alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, β-Galactosidase, Luciferase oder Meerrettich-Peroxidase. Derartige Enzymsysteme sind nicht selbst in der Lage, ein Signal abzugeben, sind jedoch in der Lage, in Gegenwart eines geeigneten Substrats nach bekannten Methoden ein Signal zu erzeugen. Der Signalteil des kovalent angefügten Rests kann dabei gemäß irgendeiner herkömmlichen Technik wirken, beispielsweise durch Lumineszenz, Fluoreszenz oder durch Farberzeugung. Wenn das Enzym alkalische Phosphatase verwendet wird, dann ist ein besonders bequemes Substrat das chemielumineszierende Substratsystem, das in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2 54 051 (Wayne State University) sowie von Schaap et al, Tetrahedron Letters, 28, 11, 1155-1158 beschrieben ist.

Bei der Verwendung ist es für die Nukleinsäuresonde im allgemeinen erforderlich, sehr kleine Mengen der vollständig komplementären Oligonukleotidsequenz nachzuweisen. Unter solchen Umständen ist es vorteilhaft, in die Sonde ein Mittel zur Verstärkung des Signals einzuarbeiten. Die Verstärkung kann nach bekannten Techniken erfolgen, beispielsweise unter Verwendung von einem oder mehreren der in den europäischen Patentveröffentlichungen 27 036 (Selff), 49 606 (Selff), 58 539 (Selff) und 60 123 (Selff) beschriebenen Systems.

Die Anwesenheit von irgendwelchen verknüpften Sonden kann nach irgendeinem geeigneten Verfahren nachgewiesen werden, hängt aber von der Signaleinheit oder dem Rest, der ein Signal erzeugen kann, ab, die sich an den nachweisbaren Sonden befinden. Beispielsweise können die verknüpften Sonden von der Ziel-Nukleotidsequenz, mit der sie hybridisiert sind, durch Denaturierung getrennt werden, erforderlichenfalls durch selektive Denaturierung, und die verknüpften Sonden können durch Elektrophorese und geeignetenfalls Autoradiographie analysiert werden. Der Nachweis kann auch unter Verwendung eines Bindungspaares erfolgen. So kann beispielsweise die erste oder zweite Nukleotidsonde gewünschtenfalls einen Teil eines Bindungspaares tragen. Im allgemeinen wird der eine Teil eines Bindungspaares von einer zweiten Nukleotidsonde getragen oder ist ein Teil davon. Der andere Teil des Bindungspaares kann in Lösung oder auf einem Träger vorliegen. Auf diese Weise kann geeignetenfalls die mit der nachweisbaren ersten Nukleotidsonde verknüpfte zweite Nukleotidsonde an einem Träger isoliert werden, der den anderen Teil des Bindungspaares trägt. Ein derartiges Bindungspaar kann beispielsweise auf einer Protein-Liganden- oder Antigen- Antikörper-Wechselwirkung beruhen, wie beispielsweise einer Avidin-Biotin- oder Dinitrophenyl-Antidinitrophenylantikörper- Wechselwirkung.

Ein Teil des Bindungspaars kann dabei sogar eine Nukleotidsequenz sein, die ein Teil der Sondensequenz sein kann, oder ein Nukleotidsequenzzweig an der Sonde. Der andere Teil des Bindungspaars kann dann beispielsweise ein Protein sein, das an die Nukleotidsequenz bindet, oder eine andere Nukleotidsequenz, mit der sie hybridisiert.

Auf diese Weise macht es das erfindungsgemäße Verfahren möglich, viele Individuen auf Erbleiden und -zustände zu analysieren, einschließlich eines Heterozygotie-Nachweises, beispielsweise wenn sowohl ein erwartetes "normales" nachzuweisendes Oligonukleotid als auch ein erwartetes nachzuweisendes "Mutanten"- Nukleotid an der geeigneten Stelle substituiert sind. Darüber hinaus macht es das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren möglich, das Verfahren erheblich schneller abzuschließen als bei einer Standard-RFLP-Analyse, da kein Southern-Blotting erforderlich ist und eine Filter-Hybridisierung vermieden werden kann.

Wenn somit beispielsweise ein Gen eine gegebene Anzahl von X-bekannten Punktmutationen enthalten kann, von denen jedes ein spezielles Erbleiden bewirkt, dann kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um eine Diagnose zu erhalten. Es können dazu X Oligonukleotide, z. B. 30 Mere, synthetisiert werden, von denen jedes beispielsweise zu der 3′-Seite der möglichen Mutationspunkte komplementär ist. Jedes Oligonukleotid weist daher eine unterschiedliche Sequenz auf. Jedes Oligonukleotid kann markiert sein, beispielsweise 5′-markiert, geeigneterweise radioaktiv markiert (z. B. mit ³²P). Dann können X weitere Oligonukleotide synthetisiert werden, die jedes eine unterschiedliche Länge von beispielsweise Unterschieden von 5 Nukleotiden aufweisen können, z. B. Längen von 15, 20, 25 und 30 Nukleotiden, und von denen jedes einen terminalen Rest benachbart zu dem erwarteten Mutanten und seiner entsprechenden markierten Sonde aufweist, beispielsweise eine Base am 5′-terminalen Rest. Dieser zweite Satz von Oligonukleotiden ist auch in der Lage, mit der normalen DNA-Sequenz zu hybridisieren. Die Oligonukleotide sind so gestaltet, daß sie mit beiden Seiten der erwarteten Punktmutation hybridisieren, so daß ein geteiltes Sondenhybrid gebildet wird, das eine Lücke von wenigstens zwei Nukleotiden zwischen den Sondenteilen des Hybrids aufweist. Es kann dann eine gesamte humane DNA genommen werden, denaturiert werden und alle 2X Oligonukleotide können einem einzigen Reaktionsbehälter zugesetzt werden. Die Oligonukleotide können dann mit der denaturierten DNA hybridisiert werden und es können eine oder mehrere Art(en) von Nukleotiden unter Bedingungen zugesetzt werden, die eine komplementäre Hybridisation ermöglichen, woran sich eine Verknüpfung anschließt. Die Verknüpfungsmischung kann dann denaturiert werden und der Elektrophorese unterzogen werden, z. B. durch Aufgeben auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel. Dann kann eine Autoradiographie durchgeführt werden, so daß die Anwesenheit oder das Fehlen möglicher Punktmutationen sichtbar gemacht wird. Bezüglich der normalen DNA kommt es zu keiner Verknüpfung, wenn die zugesetzte Art von Nukleotid(en) komplementär zu der entsprechenden mutanten Sequenz ist, so daß die längsten sichtbar gemachten Sequenzen nicht länger sind als das längste Oligonukleotid-Ausgangsmaterial. Nur die Anwesenheit einer Punktmutation führt zu einer Verknüpfung und damit zur Anwesenheit einer längeren Nukleotidsequenz. Wenn allerdings die zweite Nukleotidsonde markiert ist, kann diese Sonde in begrenztem Maße verlängert werden, eine geeignete Wahl der Ursprungslänge im Zusammenhang des diagnostischen Bereichs ermöglicht es, längere Verlängerungsprodukte zu vermeiden, die irrtümlich für Verknüpfungsprodukte gehalten werden könnten. Die Größe des Produktbandes (d. h. die Länge der Nukleotidsequenz) charakterisiert die Natur der Mutation absolut.

Es ist ohne weiteres einzusehen, daß der vorausgehend beschriebene erste Satz von X Oligonukleotiden auch so gestaltet sein könnte, daß ihre terminalen 3′-Reste der erwarteten mutanten Base benachbart sind. Selektive Verknüpfung mit einem zweiten Satz aus weiteren X Oligonukleotiden von zunehmender Kettenlänge kann wie oben bewirkt und wie beschrieben nachgewiesen werden.

Es dabei ohne weiteres verständlich, daß jeder der beiden Sätze von X Oligonukleotiden so synthetisiert werden kann, daß beispielsweise Längenunterschiede von 5 Nukleotiden vorliegen. Im allgemeinen ist der Satz von Oligonukleotiden der konstanten Länge markiert, wie weiter oben beschrieben wurde.

Die Bestätigung der Anwesenheit oder des Fehlens einer angegebenen Punktmutation kann dadurch erhalten werden, daß man die obigen Prozeduren wiederholt, jedoch dabei einen geeigneten Satz von Nukleotiden einsetzt, die zu der erwarteten normalen Sequenz vollständig komplementär sind. Eine Kombination dieser beiden Ansätze liefert ein Verfahren zum Nachweis von Heterozygoten, das dann wertvoll zur Analyse von dominanten Erbleiden und zum Nachweis von Trägern von rezissiven Erbzuständen ist.

Beispiele für Basenpaarsubstitutionen, die eine Erbkrankheit bewirken, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, umfassen die folgenden:

Tabelle

Basenpaar-Substitutionen, die zu genetischen Störungen führen

A Autosomat

beta-Thalassämie

Wenn gewünscht, kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung so durchgeführt werden, daß das Signal, das durch die nachweisbare(n) Sonde(n) erzeugt wird, verstärkt wird. Das kann dadurch erreicht werden, daß man irgendeine Verbindung, beispielsweise eine Verknüpfung, und/oder ein Auffüllen mit DNA-Polymerase in Gegenwart eines Überschusses von einem oder mehreren Sondensätzen durchführt, wobei jeder Sondensatz eine nachweisbare erste Nukleotidsonde und eine zweite Nukleotidsonde aufweist und jede Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die homolog zu angrenzenden Segmenten eines gewünschten diagnostischen Teils einer Zielsequenz ist. So kann beispielsweise die für den Nachweis verknüpfte Sonde geformt werden, denaturiert werden, beispielsweise zum Nachweis, und es können weitere Teilsondenhydride gebildet, verknüpft und denaturiert werden, was gewünschtenfalls ad infinitum weiter getrieben werden kann, wodurch es zu der gewünschten Verstärkung kommt. Wenn daher beispielsweise die Menge der zu untersuchenden Genom-DNA den begrenzenden Faktor darstellt, können Verstärkungstechniken angewandt werden. Daher kann DNA-Polymerase/Verknüpfung durchgeführt werden, beispielsweise in Lösung, gefolgt von einer Denaturierung, beispielsweise einer Wärmedenaturierung, gefolgt von der Anwendung einer weiteren DNA- Polymerase/Verknüpfung, wobei die Reaktionen in Gegenwart eines Überschusses der relevanten Sondensätze und Nukleotide durchgeführt werden.

Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Sondensatz für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geschaffen, wobei jeder Sondensatz eine erste nachweisbare Nukleotidsonde sowie eine zweite Nukleotidsonde aufweist, die mit benachbarten Segmenten eines diagnostischen Teils einer Ziel-Basensequenz hybridisiert sind, wobei die Nukleotidsequenz der ersten und der zweiten Sonde so sind, daß sie bei ihrer Verwendung ein Hybrid mit einer komplementären Zielsequenz bilden, in dem die erste und die zweite Sonde voneinander durch eine Lücke getrennt sind, die von wenigstens zwei Nukleotiden der komplementären Zielsequenz gebildet wird, wobei die Nukleotide der normalen und/oder abweichenden Zielsequenz alle bis auf eines der verschiedenen natürlich vorkommenden Nukleotide oder weniger umfassen, wobei die Lücke außerdem dadurch gekennzeichnet ist, daß bei der Verwendung eine oder mehrere Art(en) von Nukleotiden für die Umsetzung mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz verwendet werden können, wobei diese Nukleotidarten so auswählbar sind, daß entweder das normale oder das abweichende Nukleotid dazu nicht komplementär ist.

Die potentielle abweichende Sequenz in dem diagnostischen Teil einer Ziel-Basensequenz ist vorzugsweise eine Basenpaar- Substitution, die beispielsweise eine genetische Störung anzeigt. Im Hinblick darauf bilden Sondensätze, die auf genetischen Störungen basieren, die in der voranstehenden Tabelle aufgeführt sind, eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Die erste und die zweite Nukleotidsonde können irgendeine passende Länge aufweisen. Die Sonden können daher unabhängig voneinander 5 bis 50 Nukleotide, beispielsweise 15 bis 30 Nukleotide enthalten. Die erste und die zweite Nukleotidsonde sind geeigneterweise durch bis zu 5 Nukleotide der Zielsequenz voneinander getrennt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt eine Lücke von zwei Nukleotiden vor.

Um das erfindungsgemäße Verfahren auf geeignete Weise durchzuführen, ist es im allgemeinen vorteilhaft, die Nukleotidsonden einem Kit beizugeben, und dieser Kit wird daher als ein weiteres Merkmal bzw. eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrachtet.

Somit wird gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Kit für den Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von wenigstens einer abweichenden Nukleotidsequenz geschaffen, der wenigstens einen Sondensatz, wie er oben beschrieben wurde umfaßt, wobei jeder Sondensatz eine nachweisbare erste Nukleotidsonde und eine weitere Nukleotidsonde umfaßt und wobei jede Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist, die homolog zu benachbarten Segmenten eines gewünschten diagnostischen Teils einer Zielsequenz ist, wobei eine potentiell abweichende Sequenz zwischen der Nukleotidsequenz der ersten und der zweiten Sonde so vorliegt, daß dann, wenn ein Teilsondenhybrid mit einer komplementären Zielsequenz gebildet wird, die Sonden durch eine Lücke voneinander getrennt sind, die von wenigstens zwei Nukleotiden der komplementären Zielsequenz gebildet wird.

Der Kit kann zusätzlich einen Satz oder Sätze von einem oder mehreren Nukleotiden enthalten, die entweder komplementär oder nicht komplementär zu der Ziel-Nukleotidsequenz sind, die die erste und die zweite Nukleotidsonde miteinander verbrückt, und außerdem Reagenzien zum Verknüpfen der genannten Sonden enthalten.

Der Kit enthält vorzugsweise Mittel zum Extrahieren von DNA und/oder Mittel zum Immobilisieren von DNA auf einem festen Träger.

Gewünschtenfalls kann wenigstens eine der nachweisbaren ersten Nukleotidsonde und der zweiten Nukleotidsonde in jedem Sondensatz einen Teil eines Bindungspaares tragen, wobei der andere Teil des Bindungspaares beispielsweise auf dem festen Träger vorliegt, der mit dem Kit geliefert wird. Der Kit enthält ferner üblicherweise geeignete Pufferlösungen und/oder Waschlösungen und schriftliche oder gedruckte Benutzungsanweisungen für den Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand des nachfolgenden Beispiels und der Figuren noch näher erläutert. In den Figuren zeigen:

Fig. 1 die Analyse von individuellen Genorten. Die Autoradiographie zeigt Banden von gelelektrophorisierten Reaktionsmischungen, die im Detail in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben werden. Die Bänder 1 bis 6 entsprechen den Reaktionen 1 bis 6.

Fig. 2 die Analyse von zwei getrennten Genorten gleichzeitig. Die Bänder 7 und 8 entsprechen den Reaktionen 7 und 8. Die Autoradiographie zeigt Banden von gelelektrophorisierten Reaktionsmischungen, die ebenfalls im Detail in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben werden.

In beiden genannten Figuren sind die Größen der Reaktionsprodukte (in Nukleotidzahlen) rechts angezeigt. Die Herkunft der Gele ist ebenfalls angegeben. BPB zeigt die Position des Bromphenolblau-Marker-Farbstoffs.

Beispiel

Oligodesoxyribonukleotide (Oligonukleotide) werden komplementär zu Regionen im Bereich von Exons des humanen α-I-Antitriypsin- (αIAT)-Gens synthetisiert. Die Basenpaarsequenz der Nukleotide 1112-1329 des Gens ist wie folgt:

Versuchsdurchführung

Ein Plasmid, das eine teilweise cDNA-Insertion enthält, die für das Carboxylende von humanem aIAT kodierte, das Nukleotide 1020-1340 gemäß der Definition von Cohan et al (DNA, 3, 327-330, 1984) enthielt, wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym Alu I unter den von dem Hersteller (Böhringer Mannheim) empfohlenen Bedingungen verdaut. Oligonukleotide,
5′d(CCCATGTCTATCCCCCCCG) (Oligo 4),
5′d(CCAAGTCTCCCCTCTTCATGGG) (Oligo 6), und
5′d(ACCCCTCCCCTCCATCCCTGGCCCCCTC) (Oligo 8),
die zu den Nukleotiden 1141-1159, 1208-1229 bzw. 1275-1302 komplementär waren, wurden in getrennten Reaktionen 5′-phosphoryliert, wobei 100 nM an Oligonukleotid sowie ein zweifacher Überschuß an 5′γ³²P-Adenosin-Triphosphat(5′γ³²P ATP) in einem Puffer verwendet wurde, der 50 mM Tris/HCl (pH 9.0), 10 mM MgCl₂, 20 mM DTT, 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA enthielt. Die spezifische Aktivität der 5′γ³²P ATP betrug 5000 Ci/mmol. Die Phosphorylierung wurde unter Verwendung von Polynukleotidkinase (1,5 Einheiten pro pmol Oligonukleotid) erreicht. Jede Reaktion wurde bei 37°C 275 min inkubiert und dann 5 min auf 100°C erhitzt.

Die Oligonukleotide wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Elektroelution gereinigt, gefolgt von einer Ethanolfällung. Die Phosphorylierung wurde durch Autoradiographie bestätigt. Außerdem wurden Oligonukleotide,
5′d (GGGGCCATGTTTTTAGAGGCCA) (Oligo 3),
5′d (CCTTTGTCTTCTTAATGATTGAACAAAA) (Oligo 5) und
5′d (CACCCAAAAATAACTGCCTCTCGCTCCT) (Oligo 7)
verwendet, die komplementär zu den Nukleotiden 1117-1138, 1178-1205 bzw. 1245-1272 waren.

Die Oligonukleotide 3 und 4 sind durch das Dinukleotid 5′d(TA) getrennt, das komplementär zu dem Dinukleotid 3′d(AT) im humanen αIAT-Gen ist. In ähnlicher Weise sind die Oligonukleotide 5 und 6 durch das Dinukleotid 5′d(TA) getrennt. Die Oligonukleotide 7 und 8 sind durch das Dinukleotid 5′d (CA) getrennt, das komplementär zu dem Dinukleotid 3′d(GT) im humanen α-IAT-Gen ist.

Die Matrize für die Auffüllung und die Verknüpfungen war ein αIAT cDNA-Plasmid, das mit Alu I geschnitten worden war (Alu I schneidet weder zwischen jedem Paar der Oligonukleotide, d. h. 3 und 4, 5 und 6 oder 7 und 8, noch innerhalb der Sequenz irgendeines der Oligonukleotide). 20 µg des Plasmids wurden in mittlerem Salzpuffer (ergänzt durch BCL) mit dem Restriktionsenzym Alu I (17,5 Einheiten) für 160 min bei 37°C inkubiert. Daß die Reaktion vollständig war, wurde durch Agarosegelelektrophorese auf einem 1,4% Gel in Tris/Boratpuffer, der 0,5 µg/ml Ethidiumbromid enthielt, und durch Sichtbarmachung unter UV-Licht gezeigt.

Die folgenden Sätze von Oligonukleotiden wurden an die cDNA- Matrize angeheftet, woran sich eine Behandlung mit Paaren von Nukleotidtriphosphaten (dNTPs) wie nachfolgend gezeigt, anschloß.

Jede Reaktion wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt:

Reaktionspuffer: 67 mM Tris/HCl (pH 8.8), 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 6.7 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoäthanol und 6,7 µM EDTA.
cDNA-Matrize: 50 fmol/Reaktion.
5′³²P-Oligonukleotid (4,6 oder 8): 300 fmol/Reaktion.
Nicht-markiertes Oligonukleotid (3,5 oder 7): 75 fmol/Reaktion dNTP: 40nMol/Reaktion (Reaktionsvolumen 20 µl).

Stufe

• (a) Denaturierung der cDNA-Matrize bei 91°C für 2 min,
• (b) Anfügen von relevanten Oligonukleotiden bei 60°C für 5 min,
• (c) Zugabe von Taq-Polymerase (0,1 Einheiten),
• (d) Zugabe von dNTPs, in dem man zwei min bei 60°C reagieren ließ,
• (e) Blitzabkühlung auf -70°C für 20 min, danach Auftauen-lassen der Mischung auf Raumtemperatur,
• (f) Zugabe von 2,5 µl 10x Ligasepuffer (660 mM Tris/HCl (pH 7,6), 66 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 4 mM ATP)
• (g) Zugabe von T4 DNA-Ligase (2,5 µl, 0,125 Einheiten, vorher in 1X Ligasepuffer verdünnt),
• (h) Inkubation bei 23°C für 40 min, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C für 40 min, gefolgt von einer Inkubation bei 60°C für 5 min,
• (i) Zugabe von mittlerem Salzpuffer (ergänzt durch BCL) und 0,5 Einheiten Alu I-Restriktionsenzym,
• (j) Inkubation bei 37°C für 120 min,
• (k) Entfernung von 4 µl in 10 µl 90% 1mM EDTA und 0,1% Bromphenolblau,
• (l) Denaturierung der Probe bei 90°C, gefolgt durch rasches Abkühlen auf 0°C,
• (m) Elektrophorese auf 15%igem Polyacrylamidgel in 7M Harnstoff enthaltendem Tris/Borat-Puffer und
• (n) Autoradiographie des Gels.

Eine Prüfung der Autoradiographie zeigte Banden, wie sie für die Polymerase/Ligase-Produkte erwartet wurden, d. h. entweder das Ausgangs-³²P-Oligonukleotid ± Verlängerung durch Einbau von dNTPs (wenn diese komplementär zu der Matrize waren), oder längere Produkte, die sich von der selektiven Insertion von komplementären dNTPs zwischen die Oligonukleotidpaare und anschließende Verknüpfung ableiten. Die beobachteten Produkte sind somit:

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von wenigstens einer abweichenden Sequenz bei einem einzigen Test, wobei das Verfahren umfaßt:

• 1) Hybridisieren einer ersten nachweisbaren Nukleotidsonde und einer zweiten Nukleotidsonde mit benachbarten Segmenten jedes gewünschten diagnostischen Teils einer Ziel-Basensequenz, wobei die Nukleotidsequenzen der ersten und der zweiten Sonden derart sind, daß dann, wenn ein Hybrid der ersten und der zweiten Sonde mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz gebildet ist, die erste und die zweite Sonde durch eine Lücke voneinander getrennt sind, wobei diese Lücke von wenigstens zwei Nukleotiden der Zielsequenz definiert wird und wobei diese Nukleotide der normalen und/oder abweichenden Zielsequenz alle bis auf eines der verschiedenen natürlich vorkommenden Nukleotide oder weniger davon umfassen;
• 2) Umsetzen des diagnostischen Teils der Ziel-Basensequenz mit einer oder mehreren Art(en) von Nukleotiden unter Bedingungen, die eine komplementäre Hybridisierung ermöglichen, wobei die verwendete(n) Art oder mehrere Art(en) von Nukleotiden derart ist (sind), daß entweder das normale oder das abweichende Nukleotid zu ihnen nicht komplementär ist;
• 3) Verknüpfen des erhaltenen Hybrids; und
• 4) Feststellen der Anwesenheit oder des Fehlens jeder abweichenden Sequenz durch Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens von einer oder von mehreren Sonden, die für die Anwesenheit oder das Fehlen jeder abweichenden Sequenz charakteristisch sind,

wobei das Verfahren so ausgeführt wird, daß die Nukleotide, die die Lücke zwischen der ersten und der zweiten Sonde bilden, wenn diese mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz hybridisiert sind, so gewählt sind, daß eine Verknüpfung der ersten mit der zweiten Sonde nur im Falle von entweder der normalen oder der abweichenden Basensequenz ermöglicht wird, jedoch nicht in beiden Fällen von Sequenzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Nukleotidsonde jeweils so ausgewählt sind, daß dann, wenn eine Lücke aus nur einem einzigen Nukleotid erhalten wird, dieses einzige, die Lücke definierende Nukleotid weder das normale, noch das abweichende nachzuweisende Nukleotid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Sonde durch eine Lücke voneinander getrennt sind, die von zwei Nukleotiden der Zielsequenz definiert wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde, die für die Anwesenheit oder das Fehlen jeder abweichenden Sequenz charakteristisch ist, eine einzige verknüpfte Sonde ist, die sowohl die erste als auch die zweite Nukleotidsonde enthält.

5. Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwesenheit oder das Fehlen von mehr als einer abweichenden Sequenz gleichzeitig nachgewiesen wird.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens eine Analyse einer Translokation in einer Ziel-Basensequenz umfaßt, wobei die nachweisbare erste Nukleotidsonde für eine Hybridisierung über einen Bereich möglicher Translokation(en) geeignet ist und die nicht nachweisbare zweite Nukleotidsonde geeignet ist, mit Sequenzen angrenzend an die genannte(n) Translokation(en) zu hybridisieren, wobei die nicht nachweisbare zweite Nukleotidsonde einen Teil eines Bindungspaares trägt.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zielsequenz oder ein diagnostischer Teil davon mit mehr als zwei Oligonukleotidsonden hybridisiert wird, woran sich eine Hybridisierung mit Nukleotiden anschließt, die zu der (den) Lücke(n) aus wenigstens zwei Nukleotiden zwischen benachbarten Enden der Oligonukleotidsonden komplementär sind, so daß dann, wenn eine komplementäre Zielsequenz vorhanden ist, ein Teilsondenhybrid erhalten wird, wobei die nachweisbare erste Nukleotidsonde eine terminale Oligonukleotidsonde ist, die nachweisbar ist, und die zweite Nukleotidsonde die andere terminale Oligonukleotidsonde ist, an die ein Teil eines Bindungspaars gebunden ist, und wobei eine oder mehrere individuelle andere Oligonukleotidsonde(n) getrennt jedoch anschließend an eine angrenzende Zielsequenz zwischen den genannten terminalen Oligonukleotidsonden hybridisiert werden, und daß die individuellen Oligonukleotidsonden verknüpft werden, so daß die sie nachweisbare Oligonukleotidsonde mit der Oligonukleotidsonde verbinden, die einen Teil eines Bindungspaares trägt, und ein verknüpftes Sondenhybrid gebildet wird, das anschließend denaturiert wird und mit dem anderen Teil des Bindungspaars in Berührung gebracht wird, wodurch durch die nachweisbare verknüpfte Sondennukleotidsequenz einschließlich des Bindungspaars von anderen Nukleotidsequenzen abgetrennt werden kann.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor Stufe 4) die hybridisierte(n) Sonde(n) von der Zielbasensequenz getrennt werden, woran sich der Reihe nach die Durchführung der Stufen 1), 2) und 3) anschließt und wobei die erwähnte Arbeitsweise gegebenenfalls wenigstens einmal wiederholt wird, wodurch eine Vielzahl von Kopien der Sonde(n) für deren Nachweis erhalten wird.

9. Ein Sondensatz mit einer ersten nachweisbaren Nukleotidsonde und einer zweiten Nukleotidsonde, wobei diese Sonden mit benachbarten Segmenten eines diagnostischen Teils einer Ziel- Basensequenz hybridisierbar sind, wobei die Nukleotidsequenzen der ersten und der zweiten Sonde so sind, daß sie bei ihrer Verwendung mit einer komplementären Zielsequenz ein Hybrid bilden, bei dem die erste und die zweite Sonde durch eine Lücke voneinander getrennt sind, die durch wenigstens zwei Nukleotide der komplementären Zielsequenz gebildet wird, wobei diese Nukleotide der normalen und/oder abweichenden Zielsequenz alle bis auf eines der verschiedenen natürlich vorkommenden Nukleotide oder weniger umfassen und wobei die Lücke außerdem dadurch charakterisiert ist, daß bei der Verwendung eine oder mehrere Art(en) von Nukleotiden für die Umsetzung mit dem diagnostischen Teil der Ziel-Basensequenz verwendet werden kann (können), wobei die genannte(n) Art(en) von Nukleotiden so auswählbar sind, daß entweder das oder die normale(n) oder abweichende(n) Nukleotid(e) dazu nicht komplementär ist (sind).

10. Sondensatz nach Anspruch 9 für die Diagnose einer erheblichen Krankheit, eines erheblichen Zustands oder einer erheblichen Veranlagung.

11. Kit mit wenigstens einem Sondensatz nach Anspruch 9 oder 10 zusammen mit schriftlichen oder gedruckten Benutzungsanweisungen für den Kit sowie geeigneten Pufferlösungen und/oder Waschlösungen.

12. Ein in vitro-Diagnoseverfahren, das die Verwendung eines Sondensatzes nach Anspruch 9 oder 10 oder die Verwendung eines Kits nach Anspruch 11 umfaßt.