DE3629190A1 - Verfahren zum nachweis und zur reinigung einer einzelne basenfehlpaarungen aufweisenden dna - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekulargenetik, besonders die chemische Modifizierung von Nucleinsäuren und das Auffinden und die Reinigung spezifischer DNA- Sequenzen.

Der Sequenzvergleich zwischen kurzen, homologen DNA-Molekülen zur Identifizierung von Unterschieden bis zu einer einzigen Basenpaar-Substitution ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der genetischen Grundlagen der phänotypischen Variation und der Erbkrankheiten.

Wenn sich eine DNA-Sequenz eines Individuums A von der DNA-Sequenz eines Individuums B durch eine einzige Basenpaar- Substitution unterscheidet, werden zur Analyse der einzelnen Basenpaar-Substitution im allgemeinen die beiden Stränge der Individuen A und B getrennt, gemischt, und ein Strang des Individuums A und ein Strang des Individuums B werden wieder aneinandergelagert. Da die Sequenzen bis auf die substituierte Stelle identisch sind, bilden dabei komplementäre Stränge eine Doppelstrang-DNA. Da die Stränge aus zwei verschiedenen Individuen stammen, wird dieser Doppelstrang im folgenden als Heterodoppelstrang bezeichnet. Der Heterodoppelstrang ist ein bis auf die Stelle mit der Basenpaar-Substitution vollständig gepaartes DNA-Molekül. An dieser Stelle liegt eine Fehlpaarung vor. Im Gegensatz zum üblichen Basenpaar A-T oder G-C liegt bei der Fehlpaarung eines der Basenpaare A-C, A-G, T-C, T-G, A-A, G-G, T-T oder C-C vor EMR ID=5.1eite 17, unten). Durch den Nachweis solcher Basenfehlpaarungen lassen sich die Grundlagen der phänotypischen Variation und der Vererbung bestimmter Krankheiten besser verstehen. Außerdem ist damit ein planmäßiges Suchen nach solchen Krankheiten möglich.

Es wurden bereits verschiedene Bemühungen zum Nachweis von Basenfehlpaarungen unternommen. Dazu gehört die Spaltung der Heterodoppelstrang-DNA-Moleküle an den Basenfehlpaarungen mit S₁- und Phasedus mungo-Nuclease (T.E. Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 (1975), 989-993 und D. Kowalski et al., Biochem. 15 (1976), 4457). Diese Enzyme spalten jedoch die einzelnen Basenfehlpaarungen mit einem verhältnismäßig niedrigen Wirkungsgrad. Ferner wurde versucht, Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität in denaturierenden Polyacrylamid-Gradienten-Gele festzustellen (S.G. Fisher und L.S. Lerman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80 (1983), 1579-83). Ohne Modifikation läßt sich mit diesem Verfahren jedoch lediglich ein Teil der Unterschiede in den Basensequenzen der DNA feststellen. Schließlich wurde die differentielle Hybridisierung mit Oligonucleotid- Sondenmolekülen durchgeführt, die in einer einzigen Base unterschiedlich sind (R.B. Wallace et al., Nucl. Acids Res., 9 (1981), 3647-56). Dieses Verfahren ist jedoch nur anwendbar, wenn bereits Sequenzinformationen zugänglich sind.

Bei der vorliegenden Erfindung werden die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Versuche zur Auflösung einzelner Basenfehlpaarungen dadurch vermieden, daß Fehlpaarungen aufweisende Bereiche spezifisch mit einem "Anhängsel" versehen und dann nachgewiesen werden. Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Reinigung bestimmter Gensegmente beschrieben.

Somit betrifft die Erfindung den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis einer Doppelstrang- DNA, die einzelne Basenbefehlpaarungen aufweisen, bereitgestellt, bei dem man
a) eine Doppelstrang-DNA bildet, die mindestens eine Basenfehlpaarung aufweist;
b) die Fehlpaarungen aufweisende Doppelstrang-DNA mit einem Carbodiimid umsetzt; und
c) die umgesetzte, Fehlpaarungen aufweisende DNA aufgrund ihrer im Vergleich zu einer vollständig gepaarten, doppelsträngigen Kontroll-DNA unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität nachweist.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung einer vollständig gepaarten Heterodoppelstrang-DNA, bei dem man
a) ein Gemisch vollständig gepaarter und unvollständig gepaarter Heterodoppelstrang-DNA bildet;
b) das Gemisch mit einem Carbodiimid oder einem Derivat davon umsetzt, um die unvollständig gepaarten Heterodoppelstränge zu markieren; und
c) die markierte, unvollständig gepaarte Heterodoppelstrang- DNA von der nichtmarkierten, vollständig gepaarten Heterodoppelstrang-DNAtrennt.

Fig. 1: Dargestellt ist ein typischer Stammbaum, der die Autosomal-dominante Vererbung einer Krankheit (Krebs) zeigt.

Fig. 2: Dargestellt sind verschiedene Hybride, die sich bei der Wiederaneinanderlagerung in einem Gemisch denaturierter DNA aus zwei Individuen bilden, sowie zwei Strategien zur Unterscheidung der Hybride. In der Strategie 1 wird die DNA des Individuums A mit AluI-Methylase behandelt und die DNA des Individuums B wird mit der Methylase Dam behandelt. Nur die Heterodoppelstrang-DNA (A/B) ist sowohl gegen das Restriktionsenzym AluI als auch gegen das Restriktionsenzym MboI resistent (Dam- Methylase sensitiv). Der Vektor wird mit beiden Methylasen behandelt. Nur Rekombinanten mit A/B- Insertionen, die gegenüber der Spaltung mit AluI und MboI resistent sind, können Plaques bilden. In der Strategie 2 wird die DNA des Individuums A an Linker mit BamHI-Restriktionsenzymenden ligiert und die DNA des Individuums B wird an Linker mit EcoRI-Restriktionsenzymenden ligiert. Somit hat die Heterodoppelstrang-DNA (A/B) ein BamHI- Ende und ein EcoRI-Ende und bildet daher nur rekombinante Kolonien mit Vektoren, die eine Insertionsstelle mit einem EcoRI- und einem BamHI- Bereich aufweisen.

Fig. 3: Dargestellt ist die Nukleotidsequenz des 371 bp (Basenpaar) PstI-Fragments des Onkogens pT24. T6 bezeichnet das in die PstI-Spaltstelle von M13mp8 in Transkriptions-Richtung inserierte PstI-Fragment. T9 bezeichnet das in entgegengesetzter Orientierung inserierte Fragment. Die eingerahmten Sequenzen sind die Unterschiede zwischen dem Onkogen und seinem nichttransformierenden Homolog pTPT. Die eingerahmte Sequenz bei Position 90 liegt also in pTPT nicht vor. Substitutionen einzelner Basen im Onkogen werden an Position 220 (onkogene Glycin/Valin-Substitution) und an Position 266 (stille Mutation im Histidin-Codon) gezeigt. Ferner ist die Symmetrieachse angegeben.

Fig. 4: Dargestellt sind M13 : H-ras-Rekombinanten. Die Strukturen der M13mp8-Rekombinanten werden gezeigt. Die dicke Linie stellt das 371 pb PstI- Fragment von pT24 und das 365 bp PstI-Fragment von pTPT dar, die in den M13mp8-Polylinker inseriert sind. Der Pfeil gibt die Stelle der Hybridisierung des M13-Pentadecamer-Primers an, der bei der Primer-Verlängerung verwendet wurde. Die Wellenlinie gibt die 5′-3′-Richtung der Primer- Verlängerung an (zur genaueren Erklärung siehe Material und Methoden). Onkogene Rekombinanten werden als T6 und T9 bezeichnet. In der onkogenen Rekombinante T6 liegt die interne SmaI-Spaltstelle des 371 bp PstI-Fragments näher bei der SmaI- Spaltstelle des M13-Polylinkers. In der onkogenen Rekombinante T9 ist das PstI-Fragment in entgegengesetzter Orientierung inseriert. Homologe Wildtyp- Rekombinanten werden als P6 und P9 bezeichnet. In der Wildtyp-Rekombination P6 ist das 365 bp PstI-Fragment in derselben Orientierung inseriert, wie in T6. In der Wildtyp-Rekombinante P9 ist das 365 bp PstI-Fragment in derselben Orientierung wie in T9 inseriert.

Fig. 5: Dargestellt sind durch Hybridisierung von Fehlpaarungen gebildete Heterodoppelstränge. Der Heterdoppelstrang A wird aus dem markierten Strang von Primer-verlängertem P6 und seinem komplementären Strang aus nichtmarkiertem T6RF gebildet. Der Heterodoppelstrang B wird aus dem markierten Strang von Primer-verlängertem T9 und seinem komplementären Strang aus P9RF gebildet. Der Heterodoppelstrang C wird aus dem markierten Strang von T6 und seinem komplememtären Strang aus P6RF gebildet. Der Heterodoppelstrang D wird aus dem markierten Strang von P9 und seinem komplementären Strang T9RF gebildet. Der ungepaarte Bereich mit 6 Basen und einzelne Basenbefehlpaarungen werden bei jedem Heterodoppelstrang angegeben. Ferner werden die bei der Untersuchung verwendeten Restriktionsenzym-Spaltstellen sowie die Längen der Restriktionsfragmente angegeben.

Fig. 6: Dargestellt ist die Umsetzung mit Carbodiimid an den Enden der Restriktionsfragmente.

A. Das isolierte 365 bp PstI-Fragment aus Primer-verlängertem P6 wurde wie angegeben behandelt und einer Elektrophorese auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel unterzogen. Die Bahnen 1, 2 und 3 zeigen Inkubationen bei 30°C, 37°C und bei 45°C ohne Carbodiimid. Die Bahnen 4, 5 und 6 zeigen die in Material und Methoden beschriebenen Umsetzungen mit Carbodiimid bei 30°C, 37°C und bei 45°C.

B. Das isolierte 228 bp SmaI-Fragment von Primer-verlängertem P9 wurde wie angegeben behandelt und einer Elektrophorese auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel unterzogen. Die Bahnen 1, 2, 3 und 4 zeigen Inkubationen bei 30°C, 37°C, 45°C und bei 55°C ohne Carbodiimid. Die Bahnen 5, 6, 7 und 8 zeigen Umsetzungen mit Carbodiimid bei 30°C, 37°C, 45°C und bei 55°C.

Fig. 7: Dargestellt ist die Wirkung des ungepaarten Bereichs mit 6 Basen auf die Mobilität des Heterodoppelstrangs. Primer-verlängertes P6 und DNA des Heterodoppelstrangs A (vgl. Fig. 3) wurden mit SmaI gespalten, auf einem 5%igen Gel aufgetrennt und die Bande mit dem 167 bp Fragment wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, gereinigt. Die gereinigte DNA wurde sodann auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel elektrophoretisiert. Bahn 1 zeigt das 167 bp SmaI-Fragment aus Primer-verlängertem P6. Bahn 2 zeigt denaturierte DNA des 167 bp SmaI-Fragments. Bahn 3 zeigt das aus dem Heterodoppelstrang A (vgl. Fig. 5) isolierte 167 bp SmaI-Fragment. Der Heterodoppelstrang A enthält einen ungepaarten Bereich mit 6 Basen und zeigt eine geringere Mobilität im Gel. Der Heterodoppelstrang wandert an derselben Stelle wie Fragmente mit 650 bp. Größenmarker für doppelsträngige DNA sind angegeben.

Fig. 8: Dargestellt ist die Analyse einer Carbodiimid- Modifikation des ungepaarten Bereichs mit 6 Basen mit der Sequenz GGGGCT in einem 12%igen Polyacrylamid- Gel. Bahn 1 zeigt das 167 bp SmaI-Fragment aus Primer-verlängertem P6, das, wie in Material und Methoden beschrieben, gereinigt wurde. Bahn 2 zeigt das SmaI-Fragment nach Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C. Bahn 3 zeigt das SmaI-Fragment des Heterodoppelstrangs A (vgl. Fig. 5), das einen nichtgepaarten Bereich mit 6 Basen (GGGGCT) aufweist. Bahn 4 zeigt das mit Carbodiimid bei 30°C umgesetzte Heterodoppelstrang-SmaI-Fragment.

Fig. 9: Dargestellt ist die Analyse der Carbodiimid-Modifikation des nichtgepaarten Bereichs mit 6 Basen mit der Sequenz CCCCGA in einem 12%igen Polyacrylamid- Gel. Bahn 1 zeigt das 167 bp SmaI-Fragment aus Primer-verlängertem T6. Bahn 2 zeigt das SmaI- Fragment nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C. Die in Bahn 1 vorliegende Einzelstrang-DNA wurde quantitativ modifiziert. Bahn 3 zeigt das SmaI-Restriktionsfragment des Heterodoppelstrangs C (vgl. Fig. 5), der einen nichtgepaarten Bereich mit 6 Basen (CCCCGA) aufweist. Bahn 4 zeigt das mit Carbodiimid bei 30°C umgesetzte Heterodoppelstrang- SmaI-Fragment.

Fig. 10: Dargestellt ist die Veränderung der Mobilitäten durch die Modifikation mit Carbodiimid.

A. Das 228 bp SmaI-Fragment wurde wie angegebenen umgesetzt, mit SauIII AI gespalten und die Fragmente wurden in einem 15%igen Polyacrylamid-Gel getrennt. Bahn 1 zeigt den nichtmodifizierten Homodoppelstrang (Primer-verlängertes P9); Bahn 2 zeigt den nichtmodifizierten Heterodoppelstrang B (vgl. Fig. 5). Die Bahnen 3, 5 und 7 zeigen den bei 30°C, 37°C bzw. 45°C mit Carbodiimid umgesetzten Homodoppelstrang. Die Bahnen 4, 6 und 8 zeigen den bei 30°C, 37°C bzw. 45°C mit Carbodiimid umgesetzten Heterodoppelstrang B.

B. Das 365 bp PstI-Fragment wurde wie angegeben umgesetzt, mit SmaI und SauIII AI einer Doppelspaltung unterzogen, und die Fragmente wurden in einem 15%igen Polyacrylamid- Gel getrennt. Die SauIII AI-Spaltung ist unvollständig. Deshalb sind in den Bahnen unterschiedliche Mengen der Partialspaltungs-Produkte mit einer Länge von 365 und 213 bp erkennbar. Die Länge der Fragmente wird auf der linken Seite angegeben. Veränderungen der Mobilität aufgrund des nichtgepaarten Bereichs mit 6 Basen werden in Klammern angegeben. Bahn 1 zeigt den nichtmodifizierten Homodoppelstrang (Primer-verlängertes P6); Bahn 2 zeigt den nichtmodifizierten Heterodoppelstrang A (vgl. Fig. 5). Die Bahnen 3, 5 und 7 zeigen den bei 30°C, 37°C bzw. 45°C mit Carbodiimid umgesetzten Homodoppelstrang. Die Bahnen 4, 6 und 8 zeigen den bei 30°C, 37°C bzw. 45°C mit Carbodiimid umgesetzten Heterodoppelstrang B.

Fig. 11: "Verwicklungen", die sich bei der Hybridisierung einer wiederholten DNA-Sequenz mit ihrer an einer anderen Stelle des Genoms lokalisierten komplementären Sequenz bilden können, werden schematisch dargestellt.

Fig. 12: Dargestellt ist ein typischer Stammbaum einer Form des vererbten Brustkrebses.

Fig. 13: Dargestellt sind die Ergebnisse einer Southern- blot-Analyse unterschiedlicher DNA-Fragmente aus in Fig. 12 angegebenen Individuen, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis und zur Wiedergewinnung von DNA-Sequenzen bereitgestellt, die einzelne Basenfehlpaarungen enthalten. Dabei wird ein "Anhängsel" nach der Denaturierung und Wiederaneinanderlagerung einer Restriktionsendonuklease-Spaltung eines Gemisches der zu vergleichenden Proben angebracht. Das "Anhängsel" ist für nichtgepaarte DNA-Bereiche spezifisch. Die Wiederaneinanderlagerung einzelner Stränge von identischen Fragmenten ergibt vollständig gepaarte Homodoppelstränge. Die Wiederaneinanderlagerung einzelner Stränge von Fragmenten, die sich in einer einzelnen Base unterscheiden, ergibt jedoch Heterodoppelstränge, die eine Basenfehlpaarung aufweisen. Wenn das "Anhängsel" angeheftet ist, ändert es nur die elektrophoretische Mobilität des Heterodoppelstrangs in einem Polyacrylamid-Gel. Dadurch erleichtert es den Nachweis und die Wiedergewinnung des gewünschten Fragments.

Das verwendete "Anhängsel" ist Carbodiimid, da es nur nichtgepaarte Guanin (G)- und Thymin (T)-Reste in Super- coil-DNA modifiziert, ohne dabei die vollständige Watson- Crick-Paarung zu beeinflussen (J. Lebowitz et al., J. Virol., 18 (1976), 205-210 und J. Lebowitz et al., Nucl. Acids Res., 4 (1977), 1695-1711). Mindestens ein bei der Wiederaneinanderlagerung zweier beliebiger Moleküle, die sich in einem einzelnen Basenpaar voneinander unterscheiden, gebildeter Heterodoppelstrang enthält ein ungepaartes G oder T. Damit sind alle Substitutionen zugänglich, da die Spezifität von Carbodiimid bei Fehlpaarungen in der DNA erhalten bleibt. Kelly & Maden haben bereits durch Untersuchung der Sekundärstruktur ribosomaler RNA gezeigt, daß Carbodiimid mit fehlgepaartem Uracil (U) und G mitten zwischen stabileren Paaren so reagiert, wie es das auch mit denselben Basen in nichtgepaarten Abschnitten tut (Nucl. Acids Res., 8 (1980), 4521-34).

Die stumpfen Enden eines DNA-Moleküls werden gegenüber dessen inneren Bereichen destabilisiert und durch ihre Zugänglichkeit für die Carbodiimid-Modifikation können durch interne Fehlpaarungen verursachte Unterschiede verborgen bleiben. Kelly & Maden (a.a.O.) zeigten jedoch ferner, daß sich rG : rC-Paare am Ende eines doppelsträngigen Bereichs der rRNA zwar durch das basenspezifische Reagens Bisulfit modifizieren lassen, wohingegen sie sich nicht mit Carbodiimid umsetzen lassen. Auch dieser Befund spricht für die Vorteile von Carbodiimid. Schließlich ist die Carbodiimid- Modifikation durch Inkubation bei milden, leicht alkalischen Bedingungen (pH 10,5, 21°C), die nicht die Doppelstrang- DNA beeinträchtigen, reversibel (N.W.Y. Ho und P.T. Gilham, Biochem., 6 (1967), 3632-39).

In den nachfolgenden Beispielen wird ein Test beschrieben, bei dem Heterodoppelstrang-DNA-Moleküle mit nur einer einzigen Basenfehlpaarung als Sequenz-Veränderung einer Elektrophorese in hochprozentigen Polyarcylamid-Gelen unterzogen werden. Die G- und T-Basen in den Fehlpaarungen wurden quantitativ mit Carbodiimid modifiziert. Dadurch wird die Wanderungsfähigkeit im Polyarcrylamid-Gel reduziert.

Die Möglichkeit, einzelne Basenfehlpaarungen selektiv zu modifizieren und anschließend nachzuweisen, läßt sich in verschiedenen Bereichen der Molekulargenetik unmittelbar anwenden. In einer ersten Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung als System zum Auffinden von Mutationen verwendet werden. Dabei wird ein Oligonukleotid als Sondenmolekül verwendet, das entweder aus einer natürlichen Quelle isoliert wurde oder chemisch synthetisiert wurde. Dieses kann mit einem analytisch nachweisbaren Reagens markiert sein. Die DNA-Sequenzen in einer Probe werden sodann erfindungsgemäß geprüft. Dabei ist jede Sequenz identifizierbar, die sich von der Sequenz des Sondenmoleküls in mindestens einem Basenpaar unterscheidet. Es waren bereits Versuche unternommen worden, einzelne Basenaustausche als Mutationen nachzuweisen, die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen verändern. Solche Mutationen, die die Erkennungsstelle verändern, stellen jedoch nur eine kleine Untergruppe aller möglichen Mutationen dar. Damit ist dieses Nachweissystem nur begrenzt anwendbar. Wie bereits erwähnt, werden bei einem anderen Verfahren Oligonukleotide verwendet, die den Bereich überstreichen, der die nachzuweisende Punktmutation aufweist. Die Länge der Oligonukleotide wird so gewählt, daß eine einzelne Basenfehlpaarung bereits ein Hybrid herabgesetzter Stabilität verursacht (vgl. z. B. S.V. Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78 (11) (1981), 6613-17; B.J. Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80 (1) (1983), 278-82; und D.H. Schultze et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80 (7) (1983), 2007-11). Zu den Beschränkungen dieser Annäherung gehören die niedrige Empfindlichkeit, weil die Hybridisierungs- Bedingungen dadurch, daß vollständig gepaarte DNAs von DNAs mit einzelnen Basenpaarungen unterscheidbar sein müssen, sehr genau zu sein haben; die beträchtliche Hintergrund-Hybridisierung durch die im Überschuß zu verwendenden kurzkettigen Oligonukleotide und die genau gesteuerte Hybridisierungs- und Elutions-Temperatur, die zur Unterscheidung zwischen einer vollständig gepaarten Doppelstrang-DNA und einer Doppelstrang-DNA erforderlich ist, die einzelne Basenfehlpaarungen enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Verwendung längerer Oligonukleotide. Dadurch wird das Ausmaß der aus dem Stand der Technik bekannten Hintergrund-Hybridisierung lediglich vermindert. Zusätzlich zur Modifizierung der Fehlpaarung lassen sich Testbedingungen anwenden, die die Empfindlichkeit beim Nachweis erhöhen.

In einer anderen Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Reinigung einfach vorliegender DNA-Sequenzen bereitgestellt. Zur Entwicklung des Verfahrens sind Stammbäume erforderlich, die durch deutliche Aufspaltungen die Vererbbarkeit der Krankheit zeigen. Diese Situation liegt vor bei Dickdarmkrebs, Brustkrebs und bei zystischer Fibrose. Derartige Stammbäume gibt es auch für eine Vielzahl anderer Krankheiten. Fig. 1 zeigt einen hypothetischen Stammbaum von Dickdarmkebs.

Im in Fig. 1 dargestellten Stammbaum haben die Kinder A und B beide das für Dickdarmkrebs prädisponierende Gen von gemeinsamen Urgroßeltern geerbt.

Obwohl die DNAs von A und B das von den gemeinsamen Urgroßeltern geerbte und für Dickdarmkrebs prädisponierende Gen gemeinsam haben, ist die gemeinsame DNA-Fraktion von A und B nur eine kleine Fraktion ihrer Gesamt-DNA. Bei jeder Generation wurde die Hälfte der DNA von einem nichtverwandten Mann oder einer nichtverwandten Frau beigesteuert (durch gepunktete Kreise in Fig. 1 umgebene Symbole). Wenn man also die DNA isolieren könnte, die A und B gemeinsam von C und D geerbt haben, so würde deren Menge im vorliegenden Fall nur noch 1/64 × 2 der DNA betragen. Diese DNA schließt jedoch den Bereich ein, der das Gen mit dem Mutanten Allel trägt, welches für Dickdarmkrebs prädisponiert. Bei erfolgreicher Isolierung der gemeinsam geerbten DNA hat man das für Dickdarmkrebs prädisponierende Gen 32- fach angereichert.

Das Verfahren zur Abtrennung der gemeinsam geerbten DNA von der nicht gemeinsam geerbten DNA macht sich den Vorteil zunutze, daß etwa eine von 400 Basen der DNA zwischen zwei nichtverwandten Individuen unterschiedlich ist. Deshalb weist eine nicht gemeinsam geerbte (nichtverwandte) DNA etwa alle 400 DNA-Basen einen Unterschied in der Sequenz auf. Die gemeinsam geerbte DNA wird überhaupt keine oder zumindest nur sehr wenige Unterschiede in ihrer Basensequenz aufweisen. Dies wird nachstehend erläutert.

Aus dem gezeigten Beispiel ist ersichtlich, daß nicht gemeinsam geerbte DNA-Bereiche Unterschiede in ihren Sequenzen aufweisen. Wenn diese DNA-Sequenzen so erwärmt werden, daß sich die beiden DNA-Stränge trennen, gemischt werden und anschließend abgekühlt werden, so daß sich die DNA- Stränge wieder aneinanderlagern, bilden sich dabei durch Paarung der DNA von A mit der DNA von B die folgenden Strukturen:

Aus der Darstellung ist ersichtlich, daß sich eine Basenfehlpaarung (G/A) im Falle nicht gemeinsam geerbter DNA ergibt.

Anschließend ist es das Ziel, die Struktur I von der Struktur II abzutrennen und zu reinigen. Dabei müssen jedoch zwei technische Hürden überwunden werden. Dies sind A) die Wiederaneinanderlagerung von DNA im komplexen menschlichen Genom und B) die Entfernung von DNA, die mit sich selbst aneinandergelagert ist.

A) Wenn die DNAs des Individuums A und des Individuums B erwärmt und anschließend angekühlt werden, bilden sie Basenpaare. Das menschliche Genom enthält jedoch repetitive DNA-Sequenzen. Dies bedeutet, daß dieselbe oder fast dieselbe DNA-Sequenz, beispielsweise ein Abschnitt mit 300 Basenpaaren, sehr oft im Genom vorkommt. Ein großer Teil der DNA liegt nur einfach vor, d. h. in einer mütterlichen und einer väterlichen Kopie. Dagegen sind repetitive DNA- Sequenzen zwischen diesen einfach vorliegenden Sequenzen verstreut. Durch diese Situation werden potentielle Schwierigkeiten verursacht, wenn die repetitiven DNA-Sequenzen eines Bereichs mit derselben repetitiven DNA-Sequenzen hybridisieren, die mit anderen einfach vorliegenden DNA- Sequenzen in Zusammenhang stehen. Dabei können als "Verwicklungen" bezeichnete Strukturen ausgebildet werden, die sich, wie in Fig. 11 dargestellt, im Elektronenmikroskop sichtbar machen lassen.

Durch Modifizierung eines als PERT (Phenol-Emulsions-Reassoziierungs- Technik) bezeichneten Verfahrens, das von D.E. Kohne et al. (Biochemistry 16 (24) (1977), 5329-41) und von R. Wieder und J.G. Wetmur (Biopolymers 21 (1982), 655-677) beschrieben wurde, läßt sich menschliche genomische DNA wieder aneinander lagern. Anscheinend beruht dies darauf, daß einfach vorkommende Sequenzen im richtigen Zusammenhang hybridisieren und die hybridisierenden repetitiven DNA-Sequenzen verdrängen. Die Modifizierung des PERT- Verfahrens besteht in der Zugabe von 5 bis 10% Formamid. Dadurch werden die Ergebnisse verbessert. Nach diesem Verfahren lassen sich DNA-Moleküle mit 20 000 Basenpaaren wieder aneinanderlagern.

B) Nachdem die DNA erwärmt ist (oder mit Alkali behandelt ist), trennen sich ihre beiden Stränge. Erfindungsgemäß ist es das Ziel, die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu erhalten, die sich wieder bilden und aus einem Strang des Individuums A und einem Strang des Individuums B bestehen (d. h. Heterodoppelstrang-Moleküle). Die Hälfte der erhaltenen, doppelsträngigen DNA-Moleküle wird jedoch aus zwei Strängen der DNA des Individuums A oder zwei Strängen der DNA des Individuums B bestehen (Fig. 2). Diese Moleküle müssen entfernt werden.

Restriktionsenzyme spalten DNA in bestimmten Sequenzen. Die Restriktionsenzyme liegen zusammen mit als Methylasen bezeichneten Enzymen vor. Ein Restriktionsenzym hat eine verwandte Methylase. Die Methylase schützt die spezifische Sequenz, die das natürliche Substrat des Restriktionsenzyms ist, vor der Spaltung. Die Auswahl besonderer Restriktionsenzym/ Methylase-Kombinationen ist dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird die DNA des Individuums A mit einer Methylase behandelt, z. B. dem Enzym AluI, und die DNA des Individuums B wird mit der DAM-Methylase behandelt. Diese zwei Enzyme werden ausgewählt, weil die Erkennungssequenz jedes Enzyms durchschnittlich alle 200 bis 400 Basenpaare im menschlichen Genom vorkommt. Wenn die Analyse auf große Moleküle beschränkt ist, sind nach der Hybridisierung nur AB-DNA-Moleküle sowohl gegen AluI und MboI (das mit Dam verwandte Restriktionsenzym) resistent. In einem lange DNA-Stücke bei der erfolgreichen Integration erfordernden Klonierungssystem stellt also nur die AB-DNA ein geeignetes Substrat dar (vgl. unten).

Um sicherzustellen, daß ein Strang des Doppelstrangs von der DNA des einen Individuums (A) und der andere Strang vom zweiten Individuum (B) beigesteuert wird, wird in einem anderen System die DNA der Individuen A und B aus Fig. 1 isoliert und auf Stücke von "Gengröße" reduziert. Dies läßt sich durch eine Endonuklease-Spaltung oder physikalisch, z. B. durch Scherung, erzielen. Es werden Endonukleasen, wie AluI, BalI, HaeIII, NruI, PvuII oder SmaI bevorzugt, die Spaltprodukte mit stumpfen Enden bilden. Falls jedoch eine Endonuklease verwendet wird, die einen einzelsträngigen, überstehenden Bereich erzeugt, sollten die Reaktionsprodukte durch Entfernen des überstehenden Bereichs, z. B. durch Abbau mit S1-Nuklease, zu Molekülen mit stumpfen Enden umgewandelt werden.

Nach der Spaltung werden die stumpfen Enden durch Anhängen bestimmter Oligonukleotid-Linker endmarkiert. Dabei wird das DNA-Fragment des Individuums A mit einer Oligonukleotid- Sequenz endmarkiert, die eine EcoRI-Restriktionsspaltstelle aufweist, und die DNA-Fragmente des Indiviuums B werden mit einer Oligonukleotid-Sequenz endmarkiert, die eine BamI-Restriktionsspaltstelle aufweist. Die DNA-Moleküle werden dann in Klonierungsvektoren eingebaut. Diese sind so angepaßt, daß sie DNA-Moleküle mit einem EcoRI- Ende und einem BamHI-Ende aufnehmen können. Moleküle mit homologen Enden, z. B. 2 EcoRI- oder 2 BamHI-Enden, können nicht in den Vektor ligiert werden.

Nach erfolgreicher Bereitstellung eines Verfahrens zur Wiederaneinanderlagerung von DNA in einem komplexen menschlichen Genom und zur Entfernung von DNA, die mit sich selbst aneinandergelagert ist, ist es noch nötig, zwischen vollständig gepaarten DNA-Hybriden (Fig. 2 D) und Hybriden zu unterscheiden, die einzelne Basenfehlpaarungen (Fig. 2 C) aufweisen und in den Klonierungsvektor inseriert wurden. Wie nachstehend eingehend beschrieben wird, werden die DNA- Hybride vor der Integration in das Klonierungssystem mit Carbodiimid umgesetzt. Carbodiimid ist ein Reagens, das bevorzugt DNA-Regionen mit Fehlpaarungen markiert. Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignete Carbodiimide werden von J.C. Sheenan et al. (J. Org. Chem.21(1956), 439) und von J.C. Sheenan et al. (J. Org. Chem. 26 (1961), 2525) beschrieben. Die Auswahl eines bestimmten Carbodiimids kann vom Fachmann unter Berücksichtigung von Parametern, wie sterische Behinderung und Wasserlöslichkeit, getroffen werden. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid- Verbindungen werden bevorzugt. Wenn die Typen C und D in den Klonierungsvektor inseriert sind, können sie dadurch unterschieden werden, daß man einen Wirt verwendet, der das fehlgepaarte Segment mit dem Carbodiimid-"Anhängsel" nicht reparieren und damit auch nicht replizieren kann. Es lassen sich Mutanten von Bakterien verwenden, die einen Defekt im DNA-Reparaturmechanismus aufweisen, wie UVR-A, recA Mutanten von E. coli. Somit überleben und wachsen nur Kolonien, die eine Plasmid-DNA enthalten, in die vollständig gepaarte Segmente eingebaut sind. Dies ist ein Verfahren zur bevorzugten Wiedergewinnung und Anreicherung der vollständig gepaarten Doppelstränge, die die gewünschte genetische Information enthalten und sich direkt analysieren lassen oder subklonieren lassen.

In der vorstehend erläuterten PERT/Methylase-Strategie werden lange Heterodoppelstrang-Moleküle (etwa 20 kb) gebildet. Daher wird ein anderes Klonierungsverfahren unter Verwendung desselben Bakterienstammes (UVR-A, recA) angewendet. Der Vektor ist das lambda-Phagenderivat, lambda-Sep 6-lac5 (E. Meyorwitz und D. Hogness, Cell 28 (1982), 165- 176) oder Charon 35 (W.A.M. Loenen und F.R. Blattner, Gene 26 (1983), 171-179). In diesen Vektor lassen sich EcoRI- Fragmente mit einer Länge von 7 bis 20 kb einbauen. In dieser Ausführungsform wird die mit sich selbst aneinandergelagerte DNA durch Behandlung der Vektorarme mit AluI und DAM-Methylase entfernt. Die Heterodoppelstrang-DNAs werden getrennt, wie vorstehend beschrieben, mit den Methylasen behandelt. Nachdem die Insertion in den Vektor ligiert ist, wird das Gemisch mit den Restriktionsenzymen AluI und MboI behandelt. Nur Heterodoppelstrang-Moleküle überstehen diese Behandlung und führen zur Bildung von Plaques.

In einer anderen Ausführungsform wird die Carbodiimid-modifizierte DNA von der nichtmodifizierten DNA in einer zweidimensionalen Gel-Elektrophorese getrennt. Nach diesem Verfahren werden die Proben, die die modifizierte und nichtmodifizierte DNA enthalten, zunächst einer eindimensionalen Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen. Dann werden die Carbodiimid-Reste in situ durch Behandeln des Gels mit Alkali (pH 10,5) entfernt. Die Proben werden dann einer Elektrophorese im rechten Winkel zur ersten Laufrichtung unterzogen (zweite Dimension). DNA, die ihre Mobilität nicht verändert, wird zur Klonierung wiedergewonnen.

In einer weiteren Ausführungsform werden die durch den A/B- Vergleich erhaltenen Sondenmoleküle beim Absuchen zur Identifizierung vergleichbarer Bereiche in anderen Familienmitgliedern verwendet. In Fig. 12 ist ein typischer Stammbaum von vererbtem Brustkrebs dargestellt.

Wenn der zwischen A und B durchgeführte DNA-Vergleich jetzt zwischen C und D und ebenso zwischen E und F durchgeführt wird, erhält man 3 Banken klonierter DNA-Fragmente. Die DNAs der erhaltenen Banken werden sofort so mit einem Restriktionsenzym behandelt, daß die Population der menschlichen DNA-Insertionen ausgeschnitten wird. Mit dem komplexen Gemisch wird anschließend ein Southern-blot hergestellt. Verfahren zur Entfernung der Vektor-DNA (Plasmid- oder Phagen-DNA) und der repetitiven DNA-Sequenzen in den menschlichen DNA-Insertionen sind bekannt. Typische Ergebnisse von Southern-blots von DNA aus C gegen D-DNA und von E-DNA gegen F-DNA, die mit Nick-translatierter A-DNA gegen B-DNA hybridisiert wurden, sehen ähnlich aus, wie das in Fig. 13 dargestellte Ergebnis. Die gepunkteten Linien in Fig. 13 verbinden Banden, die in den C/D- und E/F-Vergleichen mit gleicher Geschwindigkeit wandern. Diese bedeuten Sequenzen, die in der A/B-Bank, der Quelle der radioaktiv markierten DNA-Sondenmoleküle, sowie in den C/D- und E/F-Banken vorkommen. Höchstwahrscheinlich stehen diese Sequenzen in enger Verbindung mit dem Gen für vererblichen Brustkrebs. Die Banken sollten nur identische, gleichzeitig vererbte DNA-Sequenzen der Vergleiche zwischen den DNAs der Individuen A und B oder C und D oder E und F enthalten. Die individuellen Plaques, die den Banden entsprechen, können sodann aus der Bank nach üblichen Plaque-Tests "gefischt" werden.

Allgemeine Methoden und Materialien

In den nachfolgenden Beispielen werden die folgenden Methoden und Materialien verwendet.

Restriktionsenzyme werden bei Bethesda Research Laboratories oder bei New England Biolabs gekauft und nach den Angaben des Herstellers verwendet. Radiochemikalien werden bei Ammersham International gekauft. Acrylamid und Bisacrylamid werden bei Bio-Rad gekauft. Der M13 Pentadecamer- Primer und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I werden bei Bethesda Research Laboratories gekauft. 1-Cyclohexyl- 3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat wird bei Aldrich Chemical Co. Inc. gekauft und als wäßrige, 0,5 M Lösung verwendet. pT24, ein das menschliche Onkogen H-ras enthaltendes Plasmid (D.J. Capon et al., Nature 302 (1983), 33-37) und pTPT, ein den homologen Wildtyp enthaltendes Plasmid (O. Fasano et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81 (1984), 4008-12), werden von Cold Spring Harbor Laboratories erhalten.

Konstruktion der M13-Rekombinanten

Ein den 5′-nichtkodierenden Bereich des ersten Exons von pT24 und pTPT enthaltendes PstI-Fragment wird gemäß der Kettenabbruchmethode sequenziert (F. Sänger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74 (1977), 5463-67). Ein 371 bp PstI-Fragment des Onkogens H-ras und ein 365 bp PstI-Fragment der homologen Wildtyp-DNA werden aus pT24 bzw. pTPT isoliert. Diese PstI-Fragmente weisen einen Längenunterschied von 6 Basenpaaren aufgrund des Plasmids pT24 auf (Fig. 3). PstI-Fragmente, die den 5′-nichtkodierenden Bereich enthalten, werden in die PstI-Spaltstelle von M13mp8, bei Bethesda Res. Lab. Inc., Gaithersburg, MD, erhältlicher Klonierungsvektor, ligiert (16 Stunden bei 14°C in 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1mM ATP). Die Liegierungsreaktionen werden mit 40 ng/µl DNA bei einem vierfachen Überschuß der Insertion zur Vektor-DNA und mit 8 E/µl T4 DNA-Ligase durchgeführt. Mit den ligierten DNA- Molekülen wird der E. coli Stamm JM103 transformiert (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, 1982) und auf mit Xgal angereicherte YT-Platten ausplattiert. DNA wird nach einem Verfahren zur Herstellung von Minipräparaten aus Kolonien hergestellt, die eine Insertion aufweisen (D.S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem., 114 (1981), 193-97). Rekombinanten enthalten das in beiden Orientierungen inserierte PstI-Fragment (Fig. 4).

Primer-Verlängerung

Einzelsträngige DNA des Phagen M13, die das Onkogen enthält, und das Wildtyp PstI-Fragment werden mit ³²P-dATP durch Primer-Verlängerung markiert (Fig. 4). Das Reaktionsgemisch besteht aus 400 ng einzelsträngiger Phagen-DNA, 4 ng Penta- decamer-Primer in 7,0 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7,0 mM MgCl₂, 50,0 mM NaCl in 10 µl. Das Gemisch wird 2 Minuten auf 100°C erhitzt und 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird auf ein Volumen von 20 µl gebracht mit 60 µCi ³²P-dATP, 0,5 µl von jeweils 10 mM dGTP, dCTP, dTTP, 2 µl 0,1 M DTT und 5 Einheiten Klenow-Fragment. Es wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Es werden 0,5 µl 10 mMdATP zugesetzt. Die Chase-Reaktion wird 15 Minuten durchgeführt. Anschließend wird mit Phenol extrahiert. Das doppelsträngige Molekül, das einen markierten Strang aufweist, läßt sich mit Restriktionsendonukleasen spalten.

Heterodoppelstrang-Bildung

Primer-verlängerte Rekombinanten von M13 werden mit PstI oder SmaI gespalten. In Gegenwart eines 50fachen Überschusses des homologen, nichtmarkierten und auf gleiche Weise gespaltenen M13 RF werden die markierten Restriktionsenzym- Spaltungen in einem Endvolumen von 150 µl 15 Minuten bei 100°C hitzedenaturiert. Die überschüssige, nichtmarkierte DNA wird zur Begünstigung der Bildung von Heterodoppelsträngen zugegeben. Die Fragmente werden 60 Minuten bei 42°C hybridisiert (Fig. 5). Homodoppelstrang-Fragmente der Primer-verlängerten DNA werden nicht denaturiert und renaturiert.

Fragment-Reinigung

Es wird eine 30%ige Polyacrylamid-Stammlösung (30 : 0,8, Acrylamid : Bis) hergestellt. Die DNA-Fragmente werden in einem 5%igen Polyacrylamid-Gel, 0,1 M Tris-Borat, pH 8,0, 1 mM EDTA elektrophoretisiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Fragmente werden aus einem Gelstreifen in 0,05 M Tris-Borat-Puffer über Nacht bei 2 V/cm elektroeluiert. Die DNA wird dreimal mit Phenol und sodann mit Chloroform extrahiert, in 0,35 M Ammoniumacetat/Äthanol gefällt und mit 70% Äthanol gewaschen.

Carbodiimid-Umsetzung

Die DNA-Fragmente werden mit 0,1 M Carbodiimid, 0,1 M Natriumborat, pH 8,5, 4 Stunden bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert. Die Proben werden mit Wasser 10fach verdünnt und zweimal in 0,25 M Ammoniumacetat/Äthanol gefällt. Das Präzipitat wird dreimal mit 70% Äthanol gewaschen. Die DNA wird wie in Beispiel 1 beschrieben gespalten, um die Fragmente mit den Fehlpaarungen voneinander zu trennen.

Gel-Elektrophorese

Nach der Umsetzung mit Carbodiimid wird die Trennung der Fragmente mit Hilfe eines 12- bis 15%igen Polyacrylamid- Gels durchgeführt. Die Gele werden in einem umgewälzten Puffer (40 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) 7 bis 10 Stunden bei 150 V und 30°C gefahren und anschließend autoradiographiert.

Beispiel 1

Das Beispiel 1 zeigt, wie erfindungsgemäß einzelne Basenfehlpaarungen in doppelsträngiger DNA nachgewiesen werden.

Als Modellsystem zum Test der Carbodiimid-Umsetzung fehlgepaarter DNA dient ein kurzer Bereich, der den Beginn der codierenden Region des H-ras-Onkogens enthält. Wenn dieses Fragment mit nichttransformierender, homologer DNA hybridisiert wird, enthält das Heterodoppelstrang-Molekül einen nichtgepaarten Bereich mit 6 Basen sowie zwei einzelne Basenfehlpaarungen (Fig. 5). Diese Fehlpaarungs- Strukturen innerhalb der DNA-Segmente sind potentielle Stellen für die Modifikation mit Carbodiimid.

A. Umsetzung mit Carbodiimid an den Enden der Fragmente

Die Wirkung der Carbodiimid-Modifikation auf die Wanderung der DNA-Segmente in hochprozentigen Polyacrylamidgelen wird geprüft. Mit Restriktionsenzym gespaltene DNA, die entweder einen vollständigen Doppelstrang (SmaI-Spaltung) oder überstehende Einzelstrangenden (PstI-Spaltung) aufweist, wird vor der Elektrophorese mit Carbodiimid umgesetzt. Die Spaltung mit PstI erzeugt 3′-überstehende Enden der Sequenz 5′ TGCA 3′. Die T- und G-Reste sind potentielle Stellen für die Modifikation mit Carbodiimid. SmaI erzeugt Fragmente mit stumpfen Enden, die drei G-C- Paare am Fragmentende aufweisen. Erwartungsgemäß sind diese Fragmente resistent gegenüber der Modifikation mit Carbodiimid.

Aus Primer-verlängertem P6 wird ein 365 bp PstI-Fragment isoliert (Fig. 4). Das gereinigte Fragment wird mit Carbodiimid bei 30°C, 37°C und bei 45°C umgesetzt und durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und anschließende Autoradiographie analysiert (Fig. 6A). Nach der Carbodiimid- Modifikation bei 30°C wandert das PstI-Fragment als einzelne Bande mit herabgesetzter Mobilität im Vergleich zum nichtmodifizierten Fragment (Fig. 6A, Bahnen 4 und 1).

Die Umsetzung bei höheren Temperaturen, d, h. bei 37°C und 45°C, ergibt eine fortschreitende Verbreiterung des Bandenmusters (Fig. 6A, Bahnen 5 und 6). Nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C und 37°C ist bei einem aus Primer- verlängertem T9 (Fig. 4) isolierten 228 bp SmaI-Fragment mit stumpfen Enden keine Veränderung in der Mobilität zu beobachten (Fig. 6B, Bahnen 5 und 6). Bei höheren Temperaturen, d. h. 45°C und 55°C, werden im Bandenmuster ähnliche Veränderungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, beobachtet (Fig. 6B, Bahnen 7 und 8).

Reaktionsfähigkeit eines internen, nichtgepaarten Bereichs von 6 Basen mit Carbodiimid

Die Reaktionsfähigkeit interner DNA-Fehlpaarungen wird geprüft. Dazu werden Heterodoppelstränge zwischen einem Fragment des H-ras-Onkogens und seinem Homolog gebildet (Fig. 5). Der Bereich mit 6 ungepaarten Basen, der in den Heterodoppelstrang-DNA-Molekülen vorliegt, verursacht einen deutlichen Abfall der Wanderung des Fragments in einem Polyacrylamid-Gel. Dadurch lassen sich Heterodoppelstrang- Fragmente von beliebigen, wiederaneinandergelagerten, vollständig gepaarten Fragmenten quantitativ trennen und reinigen. Bei einem 167 bp SmaI-Fragment aus dem Heterodoppelstrang A (Fig. 5) verursacht der Bereich mit 6 nichtgepaarten Basen einen Abfall der Mobilität. Deshalb wandert das Fragment in einem 12%igen Gel so, als ob es eine Länge von 650 bp hätte (Fig. 7, Bahn 3).

Die DNA-Fragmente werden aus einem Gel-Stückchen elektroeluiert und, wie vorstehend in Materialien und Methoden angegeben, vor der Modifikation mit Carbodiimid gereinigt. Der Bereich mit 6 ungepaarten Basen in dem 167 bp SmaI- Fragment des Heterodoppelstranges A weist 5 potentielle Stellen für die Modifikation mit Carbodiimid innerhalb der Sequenz GGGGCT auf. Eine Veränderung in der Gel-Mobilität nach der Umsetzung mit Carbodiimid ist mit der vorhersehbaren Modifizierung der ungepaarten Basen korrelierbar. Nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C wandert der Heterodoppelstrang durch das 12% Polyacrylamid-Gel schneller. Dies wird aus dem Auftreten verschiedener, diffuser, neuer Banden deutlich (Fig. 8, Bahn 4). Bei einer Modifikation mit Carbodiimid unter denselben Bedingungen tritt bei dem 167 bp Homodoppelstrang keine Veränderung in der Elektrophorese-Mobilitätauf (Fig. 8, Bahn 2).

Das aus dem Heterodoppelstrang C (Fig. 5) isolierte SmaI- Fragment enthält einen Bereich mit 6 nichtgepaarten Basen. Dieser hat die komplementäre Sequenz CCCCGA. Dieser Heterodoppelstrang wandert ebenso zusammen mit Fragmenten einer Länge von 650 bp. Er enthält jedoch nur eine potentielle Stelle für die Modifikation mit Carbodiimid. Nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C zeigt das Fragment eine einzelne, distinkte Bande mit höherer Mobilität, die einer Länge von 580 bp entspricht (Fig. 9, Bahn 4).

Umsetzung von einzelnen Basenfehlpaarungen mit Carbodiimid

Bereits kleine, nichtgepaarte DNA-Bereiche verursachen Veränderungen in der Mobilität. Daher wurde erfindungsgemäß davon ausgegangen, daß auch DNA-Fragmente nachweisbar sind, die eine einzelne Basenfahlpaarung aufweisen. Aus dem Heterodoppelstrang B (Fig. 5) wird ein 228 bp SmaI- Fragment isoliert. Zwei einzelne Basenfehlpaarungen werden in diesem Fragment durch 45 Basenpaare getrennt. Das Fragment wird mit Carbodiimid bei verschiedenen Temperaturen umgesetzt. Nach der Umsetzung mit Carbodiimid wird mit SauIII AI zwischen den Fehlpaarungen gespalten. Es wird ein 91 bp-Fragment erhalten, das eine T-C-Fehlpaarung erhält. Ferner wird ein 137 bp-Fragment erhalten, das eine T-G-Fehlpaarung aufweist.

Die DNA-Fragmente werden in einem 15%igen Polyacrylamid- Gel elektrophoretisiert (Fig. 10A). Fragmente, die eine einzelne Basenfehlpaarung aufweisen, haben dieselbe Mobilität wie das entsprechende Homodoppelstrang-Fragment. Daraus folgt, daß eine einzelne Basenfehlpaarung zur Trennung der DNA nicht ausreicht.

Nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C zeigt der 91 bp Heterodoppelstrang, der eine T-C-Fehlpaarung aufweist, ein Absinken in der Mobilität gegenüber dem 91 bp Homodoppelstrang (Fig. 10A, Bahnen 4 und 3). Der 137 bp Heterodoppelstrang, der eine T-G-Fehlpaarung aufweist, zeigt keinen Unterschied in der Mobilität bei 30°C. Nach einer Umsetzung mit Carbodiimid bei 37°C zeigt der 137 bp Heterodoppelstrang jedoch ein Absinken in der Mobilität gegenüber dem identisch behandelten Homodoppelstrang (Fig. 10A, Bahnen 6 und 5). Unter diesen Bedingungen zeigt der 91 bp Heterodoppelstrang dieselbe erniedrigte Mobilität, die auch bei der Umsetzung bei 30°C beobachtet wird. Die Umsetzung der DNA mit Carbodiimid bei 45°C führt zu einer verringerten Mobilität sowohl für Homodoppelstrang- als auch für Heterodoppelstrang-Moleküle (Fig. 10A, Bahnen 7 und 8).

Ein 361 bp PstI-Fragment des Heterodoppelstranges A wird mit Carbodiimid umgesetzt. Erst danach wird mit SmaI und SauIII AI gespalten. In diesem Experiment ist die Spaltung mit SauIII AI unvollständig. Dadurch lassen sich die verhältnismäßigen Verschiebungen in den Mobilitäten vergleichen, die durch die Umsetzung mit Carbodiimid an einzelnen Basenfehlpaarungen, nichtgepaarten Restriktionsfragment- Enden und an internen, ungepaarten Bereichen hervorgerufen werden (Fig. 10B). Nach der Umsetzung mit Carbodiimid bei 30°C zeigte der 91 bp SmaI/SauIII AI Heterodoppelstrang, der stumpfe Enden und eine T-C- Fehlpaarung aufweist, eine 4%ige Verminderung der Mobilität gegenüber dem nichtmodifizierten Heterodoppelstrang (Fig. 10B, Bahnen 4 und 2). Unter denselben Bedingungen zeigt der 122 bp SauIII AI/PstI-Homodoppelstrang eine 3%ige Verminderung der Mobilität gegenüber dem nichtmodifizierten Homodoppelstrang (Fig. 10B, Bahnen 3 und 1). Der 122 bp-Heterodoppelstrang, der eine T-G-Fehlpaarung aufweist, zeigt zwei Stufen in der Verschiebung der Mobilität. Die erste ist eine 3%ige Verminderung gegenüber dem nichtmodifizierten Heterodoppelstrang (Fig. 10B, Bahnen 4 und 2). Sie ist auf die Umsetzung der PstI-Enden mit Carbodiimid bei 30°C zurückzuführen. Die zweite ist eine zusätzliche 9%ige Verminderung der Mobilität gegenüber dem bei 30°C modifizierten Heterodoppelstrang (Fig. 10B, Bahnen 6 und 4). Dies ist auf die Umsetzung der T-G-Fehlpaarung bei 37°C zurückzuführen. Der 213 bp SmaI/PstI-Heterodoppelstrang weist eine vergleichbare zweistufige Verschiebung der Mobilität auf. Die erste Stufe (30°C) ist auf die Umsetzung von PstI-Ende und die T-C-Fehlpaarung zurückzuführen (Fig. 10B, Bahnen 2 und 4). Die zweite Stufe (37°C) ist auf die Umsetzung an der T-G-Fehlpaarung zurückzuführen (Fig. 10B, Bahnen 4 und 6). DNA-Fragmente, die einen internen, nichtgepaarten Bereich enthalten (152 bp PstI/SmaI-Fragment und 365 bp PstI-Fragment) wandern beide mit deutlich verringerter Mobilität gegenüber den entsprechenden Homodoppelstrang- DNA-Segmenten (Fig. 10B, Bahnen 2 und 1). Die Umsetzung mit Carbodiimid erzeugt Heterodoppelstrang- Moleküle mit etwas gesteigerter Mobilität gegenüber den nichtumgesetzten Heterodoppelstrang-Molekülen (Fig. 10B, Bahnen 4, 6 und 8, verglichen mit Bahn 2).

Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit von Carbodiimid, an einzelsträngige Bereiche von Doppelstrang-DNA zu binden. Damit ist die Grundlage für die Entwicklung eines Systems zur Unterscheidung von DNA-Fragmenten aufgrund von Unterschieden in der Sequenz geschaffen. Fehlpaarungen und nichtgepaarte Bereiche in ansonsten vollständig gepaarten DNA-Fragmenten wurden durch die Bildung von Heterodoppelsträngen zwischen den denaturierten Strängen homologer Fragmente hergestellt, die Basen-Substituionen und Additionen oder Deletionen aufweisen. Die veränderte Mobilität in einem hochprozentigen Polyacrylamid-Gel wird zum Nachweis der Umsetzbarkeit dieser Heterodoppelstrang-Moleküle mit Carbodiimid verwendet. Einzelne Basenfehlpaarungen und nichtgepaarte Bereiche reagieren mit Carbodiimid bei 30°C und bei 37°C, während vollständig gepaarte DNA nicht reagiert. Die relative Instabilität der T-C-Fehlpaarung gestattet ihre Modifikation bei einer niedrigeren Temperatur als bei der T-G-Fehlpaarung (F.H.C.Crick, J. Mol. Biol., 19 (1966), 548-555). Höhere Temperaturen führen zu einer Art Atmung innerhalb des Moleküls und an den Enden des Fragments (P. Lu et al., J. Biomol. Struct. and Dynamics 1 (1983), 509-521). Dadurch werden interne Basen für Carbodiimid zugänglich.

Drei Substrate verursachen eine Verminderung in der elektrophoretischen Mobilität nach der Modifikation mit Carbodiimid. Die T- und G-Reste der überstehenden PstI-Enden verursachen eine 3%ige Reduktion. Der T-Rest der T-C- Fehlpaarung in einem ansonsten doppelsträngigen Fragment verursacht eine 4%ige Verminderung und die Modifikation sowohl des T- als auch des G-Restes einer T-G-Fehlpaarung verursacht eine 9%ige Reduktion der Mobilität im Gel. Möglicherweise lassen sich diese Ergebnisse folgendermaßen erklären. In 12- bis 15%igen Polyacrylamid-Gelen ist die durchschnittliche Porengröße ein kleines Vielfaches der Querschnittsfläche der DNA (S.G. Fisher und L.S. Lermen (1983), a.a.O.). Eine odere mehrere an die einzelsträngigen PstI-Enden der sich durch die Matrix windenden DNA gebundene Carbodiimid-Moleküle bedeuten nur einen kleinen Zuwachs der Querschnittsfläche und verursachen eine geringe Verminderung der Mobilität im Gel. An den T-Rest einer T-C-Fehlpaarung gebundenes Carbodiimid liegt außerhalb der Helix und bedeutet einen deutlichen Zuwachs der Querschnittsfläche. Dadurch wird eine größere Verminderung der Mobilität im Gel verursacht. Die Umsetzung einer G-T- Fehlpaarung mit Carbodiimid führt zu einer Bindung von zwei Carbodiimid-Molekülen, die beide außerhalb der Helix liegen. Dadurch wird die Mobilität im Gel weiter reduziert. Die jeweilige Querschnittsfläche ist nämlich noch größer.

Nach der Modifikation mit Carbodiimid zeigt das aus dem Heterodoppelstrang A (Fig. 5) isolierte 167 bp SmaI-Fragment ein vollständig unterschiedliches Muster der Veränderung der Mobilität im Gel. Die den Heterodoppelstrang bildenden Einzelstränge unterscheiden sich lediglich durch 6 aufeinanderfolgende Basenpaare. Trotzdem wandern diese Moleküle 55% langsamer als vollständig gepaarte Eltern- Homodoppelstränge (Fig. 7). Es ist unwahrscheinlich, daß eine solch starke Verminderung der elektrophoretischen Mobilität durch lediglich 6 nichtgepaarte Basen im Doppelstrang verursacht wird.

Eine alternative Erklärung ist, daß die 6 ungepaarten Basen eine Biegung in der Struktur des DNA-Moleküls verursachen, die die elektrophoretische Mobilität stark vermindert. Die Carbodiimid-Modifikation vermindert die Verdrehung teilweise und führt dazu, daß das Molekül schneller wandert.

Das beschriebene Verfahren ist zur Aufklärung der genetischen Grundlagen der phenotypischen Variation und der vererblichen menschlichen Krankheiten geeignet. Die Analyse von Veränderungen in Restriktionsspaltmustern ist nur beschränkt anwendbar, denn viele einzelne Basenaustausche mit klinischer Bedeutung liegen nicht zwangsläufig innerhalb einer bekannten Restriktionsenzym-Spaltstelle (U.J. Kidd et al., Nature, 304 (1983), 230-34). Die Verwendung von Oligonukleotid- Sondenmolekülen gestattet den Nachweis jedes beliebigen Basenaustausches in der DNA. Dies ist jedoch teuer, technisch schwierig und erfordert die Kenntnis von Sequenzinformationen. Die Modifikation mit Carbodiimid ist eine wertvolle Alternative zu den bekannten Verfahren zum Auffinden von Mutationen. Außerdem lassen sich Moleküle, die kritische Sequenzunterschiede aufweisen, durch das Anhängen von Carbodiimid an die Fehlpaarungen wie vorstehend beschrieben reinigen.

Claims (18)

1. Verfahren zum Nachweis einer Doppelstrang-DNA, die einzelne Basenfehlpaarungen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine Doppelstrang-DNA bildet, die mindestens eine Basenfehlpaarung aufweist;
b) die Fehlpaarungen aufweisende Doppelstrang-DNA mit einem Carbodiimid umsetzt; und
c) die umgesetzte, Fehlpaarungen aufweisende DNA aufgrund ihrer im Vergleich zu einer vollständig gepaarten, doppelsträngigen Kontroll-DNA unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fehlpaarungen aufweisende Doppelstrang-DNA etwa 4 Stunden bei 25 bis 40°C mit 0,1 M Carbodiimid bei pH 8,5 umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Carbodiimid 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)- carbodiimid ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektrophoretische Mobilität in einem 12- bis 15-Gew./Vol.-%igen Polyacrylamid-Gel bei 150 V nach 7 bis 10 Stunden bei 30°C bestimmt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fehlpaarungen aufweisende Doppelstrang- DNA durch Hybridisierung eines ersten DNA-Einzelstranges mit einem zweiten DNA-Einzelstrang bildet, wobei die Nucleotid-Sequenz des zweiten Stranges im wesentlichen komplementär zu der des ersten Stranges ist und mindestens eins der dabei gebildeten Basenpaare nicht A-T oder G-C ist.

6. Verfahren zur Reinigung einer vollständig gepaarten Heterodoppelstrang-DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Gemisch vollständig gepaarter und unvollständig gepaarter Heterdoppelstrang-DNA bildet;
b) das Gemisch mit einem Carbodiimid oder einem Derivat davon umsetzt, um die unvollständig gepaarten Heterodoppelstränge zu markieren; und
c) die markierte, unvollständig gepaarte Heterodoppelstrang- DNA von der nichtmarkierten, vollständig gepaarten Heterodoppelstrang-DNA trennt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fehlpaarungen aufweisende DNA etwa 4 Stunden bei 25 bis 40°C mit 0,1 M Carbodiimid bei pH 8,5 umsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Carbodiimid 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)- carbodiimid ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den vollständig gepaarten Heterodoppelstrang durch Klonierung in einem UvrA, RecA-Wirt abtrennt, der Carbodiimid-DNA-Derivate nicht reparieren kann.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Carbodiimid-markierten Doppelstrang vom nichtmarkierten Doppelstrang durch ein Immunadsorptions- System abtrennt, das einen an einen festen Träger gebundenen anti-Carbodiimid-Antikörper enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trennung mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese durchführt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch der Stufe a) durch Hybridisierung der DNA aus zwei Individuen bildet, die eine gemeinsame DNA-Fraktion aufweisen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Fraktion etwa 1/64 beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die gemeinsame DNA eine DNA enthält, die das Individuum für eine genetische Erkrankung prädisponiert.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Krankheit Dickdarmkrebs, Brustkrebs oder zystische Fibrose ist.

16. Bildung von Heteroduplex-DNAs mit bis zu etwa 20 000 Basenpaaren durch Phenolelmulsions-Reassoziierung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bildung von Verwicklungen durch Zugabe von 5 bis 10% Formamid wesentlich reduziert.

17. Verfahren zur Bildung von Heterodoppelstrang-DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) die DNA einer ersten Probe mit einer ersten Methylase methyliert;
b) die DNA einer zweiten Probe mit einer zweiten Mehylase methyliert;
c) die methylierten DNAs vermischt, denaturiert und wieder aneinander lagert;
d) die beiden wieder aneinandergelagerten DNAs mit den zugehörigen Restriktionsenzymen der ersten und zweiten Methylase behandelt; und
e) die gegen den Abbau durch die Restriktionsenzyme resistente Heterodoppelstrang-DNA wieder gewinnt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Methylase die AluI-Methylase ist und das zugehörige Restriktionsenzym AluI ist und, daß die zweite Methylase die DAM-Methylase und das zugehörige Restriktionsenzym MboI ist.