DE69233719T2

DE69233719T2 - Primer, Sätze und Restriktionsfragmente und deren Benutzung in selektiver Restriktionsfragmentenamplifikation

Info

Publication number: DE69233719T2
Application number: DE69233719T
Authority: DE
Inventors: Marc Zabeau; Pieter Vos
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2012-09-25
Also published as: FI20031526A; US6045994A; DE69230873T2; JP2001061486A; NO941064D0; AU672760B2; CA2119557A1; PT534858E; ES2147550T5; PT969102E; ZA927323B; FI115402B; EP0534858B1; DK0969102T3; RU2182176C2; JPH06510668A; FI941360A0; EP0534858B2; CZ298187B6; HUT68504A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Kits, die für Anwendungen von DNA-Fingerprinting geeignet sind, und die Verwendung von DNA-Markern in einer Reihe von unterschiedlichen Gebieten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Pflanzen- und Tierzucht, die Sorten- oder Kultivar-Identifizierung, diagnostische Medizin, Krankheitsdiagnose bei Tieren und Pflanzen, Identifizierung von genetisch ererbten Erkrankungen bei Menschen, Analyse der familiären Beziehungen, forensische Analyse und mikrobielle Typisierung.
Insbesondere betrifft diese Erfindung Kits, die für Verfahren für DNA-Fingerprinting und zum Nachweisen spezifischer DNA-Marker in Genomen, die von Mikroorganismen bis zu höheren Pflanzen, Tieren und Menschen reichen, geeignet sind.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1 DNA-Fingerprinting
DNA-Fingerprinting oder DNA-Typisierung sowie andere Verfahren der Genotypisierung, des Profiling und der DNA-Identifizierungsanalyse betreffen die Charakterisierung entweder von Ähnlichkeiten oder von einem oder mehreren Unterscheidungsmerkmalen im genetischen Aufbau oder Genom einer einzelnen Person bzw. eines einzelnen Individuums, einer Sorte oder Rasse, oder einer Spezies. Die generelle Regel ist, je enger die genetische Verwandtschaft, umso größer ist die Identität oder umso zutreffender ist die Ähnlichkeit von Genomen, und folglich sind Unterscheidungsmerkmale im Genom seltener. Diese ähnlichen oder Unterscheidungsmerkmale können durch die Analyse der DNA eines Organismus nach dem Spalten („Clearing") der DNA mit einer Restriktionsendonuklease enthüllt werden. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, welche kurze Nukleotidsequenzen erkennen, in der Regel von 4 bis 8 Basen Länge, und sie spalten die zwei DNA-Stränge, wodurch Fragmente von DNA von diskreter Länge erzeugt werden. Aufgrund ihres hohen Grades der Sequenzspezifität spalten Restriktionsendonukleasen DNA-Moleküle in einer sehr spezifischen Weise. Das Ergebnis ist, dass ein reproduzierbarer Satz von DNA-Fragmenten erzeugt wird. DNA-Fragmente können entsprechend ihrer Länge auf porösen Matrizen oder Gelen fraktioniert werden, wodurch typische Bandenmuster erhalten werden, was einen DNA-Fingerprint des genetischen Aufbaus des Organismus darstellt.
2.2 DNA-Polymorphismen
Wenn die Fingerprints von sehr eng verwandten Spezies, Sorten oder Rassen verglichen werden, können die DNA-Fingerprints identisch oder sehr ähnlich sein. Wenn Unterschiede innerhalb ansonsten identischer DNA-Fingerprints beobachtet werden, werden solche Unterschiede als DNA-Polymorphismen bezeichnet: diese sind neue DNA-Fragmente, die in einem Fingerprint auftreten. Die DNA soll an dieser Position polymorph sein, und das neue DNA-Fragment kann als ein DNA-Marker verwendet werden. DNA-Polymorphismen, die in durch Restriktionsenzymspaltung erhaltenen DNA-Fingerprints nachgewiesen werden, können aus einer der folgenden Veränderungen in der DNA-Sequenz resultieren: Mutationen, welche die Restriktionsendonuklease-Zielstelle eliminiert, Mutationen, welche neue Zielstellen schaffen, Deletionen oder Inversionen zwischen den zwei Restriktionsstellen.
Solche DNA-Polymorphismen werden allgemein als RFLP, Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen, bezeichnet. Solche mutationsbedingten Veränderungen verhalten sich wie genetische Bona-fide-Marker, wenn sie in einer Weise nach Mendel vererbt werden. Folglich können DNA-Polymorphismen als genetische Marker in ziemlich der gleichen Art wie andere genetische Marker verwendet werden: bei der Vaterschaftsanalyse, bei Genstudien über die Vererbung von Merkmalen, bei der Identifizierung von Individueen.
2.3 DNA-Fingerprinting-Techniken
Für nahezu alle lebenden Organismen, mit Ausnahme von Viren, liefern Restriktionsverdaue der gesamten genomischen DNA der Organismen so viele Banden, dass es nicht möglich ist, einzelne Banden zu bewerten. Aus diesem Grund basieren alle Verfahren für das DNA-Fingerprinting auf dem Prinzip, dass nur ein kleiner Teil der DNA-Fragmente sichtbar gemacht wird, um ein einfaches Bandenmuster zu erhalten, welches den DNA-Fingerprint darstellt.
Das am häufigsten angewandte Verfahren beinhaltet das Verdauen der DNA des Organismus mit Restriktionsendonukleasen, Fraktionieren der Restriktionsfragmente durch Gel-Elektrophorese, Übertragen und Binden der fraktionierten DNA-Fragmente auf Membrane und Hybridisieren der Membran mit einem spezifischen DNA-Fragment ("Sonde"). Das DNA-Fragment bildet doppelsträngige DNA-Moleküle mit dem DNA-Fragment (oder -Fragmenten) auf der Membran, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist/aufweisen. Wenn die Sonde mit einem sichtbar zu machenden Marker als „Tag" versehen ist, kann das DNA-Fragment, an welches die Sonde gebunden ist, sichtbar gemacht werden. Diese Prozedur wird allgemein als "Southern-Hybridisierung" bezeichnet. Wenn Unterschiede in den Größen der entsprechenden Restriktions fragmente beobachtet werden, an welche die Sonde in nahe verwandten genomischen DNA-Molekülen gebunden sind, werden diese Unterschiede als DNA-Polymorphismen bezeichnet, insbesondere als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen. Die Restriktionsfragmentlängenunterschiede entsprechen den verschiedenen allelischen Formen des genetischen Locus, der durch die DNA-Sonde erkannt wird. Obwohl das Southern-Hybridisierungsverfahren für DNA-Fingerprinting in breitem Umfang zur Anwendung kam, ist das Verfahren mühsam und zeitraubend.
Darüber hinaus weist das Verfahren eine geringe Auflösung auf und kann somit nur zur Bewertung einzelner Loci oder höchstens einiger weniger Loci in einer einzelnen Reaktion angewandt werden.
2.4 Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Technik ist ein Verfahren zum Synthetisieren spezifischer DNA-Fragmente in vitro. Das Verfahren beruht auf der Verwendung spezifischer Oligonukleotide, die an einzigartige Sequenzen auf einem DNA-Molekül binden, und einer thermostabilen DNA-Polymerase. Die Oligonukleotide sind so gestaltet, dass sie an die gegenüber liegenden Stränge der DNA assoziieren können und als Primer in einer DNA-Synthesereaktion in einer Weise fungieren, dass jeder die Synthese neuer DNA-Stränge steuert. Damit wird in einem einzigen Synthesedurchgang eine vollständige Kopie des DNA-Moleküls zwischen den Primern erzeugt, sodass die DNA zwischen den Primern verdoppelt wird. Jeder Durchgang der DNA-Synthese führt zu einer Verdopplung der Menge an DNA und führt somit zu der Amplifikation der zwischen den zwei Primern umfassten DNA. Folglich gibt einem die PCR-Technik die Möglichkeit, ein präzises DNA-Segment unter Verwendung einer kleinen Menge an "Substrat-DNA" zu synthetisieren.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung entwarfen wir ein neues Kit, das in einem Verfahren zur Amplifikation mit dem PCR-Verfahren von Restriktionsfragmenten, die nach dem Spalten der DNA eines Organismus mit zumindest einem Restriktionsenzym erhalten wurden, eingesetzt wird. In dieser neuen Anwendung des PCR-Verfahrens werden die verwendeten Oligonukleotide nicht gegen eine bekannte DNA-Sequenz gerichtet, sondern sind so entworfen, dass sie die Enden der Restriktionsfragmente erkennen. Zu diesem Zweck ist es notwendig, die Enden der Restriktionsfragmente durch Hinzufügen von Oligonukleotid-Linkern (oder Adaptoren) zu den Enden zu modifizieren. Der Grund dafür ist, dass die Enden von Restriktionsenzymen in der Regel nur einige wenige Nukleotide gemeinsam besitzen, d. h. 2 bis 8 Nukleotide, was zu kurz ist, um zum Designen von Primern für die PCR-Amplifikation verwendet zu werden.
Die Erfindung basiert auf der Verwendung einer neuen Anwendung der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) zur Amplifikation von einem oder mehreren Restriktionsfragmenten von komplexen Mischungen von DNA-Fragmenten, die durch den Verdau von genomischen DNA-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen erhalten werden. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, die Amplifikation von DNA-Restriktionsfragmenten in Situationen zu ermöglichen, in denen die Nukleotidsequenz der 5'- und 3'-Enden der Restriktionsfragmente nicht bestimmt werden. In solchen Fällen können die üblichen sequenzspezifischen Primer, die an jeden Strang eines zu amplifizierenden Restriktionsfragments hybridisieren, nicht definiert werden, und daher kann man nicht die im Fachbereich für Amplifikationszwecke bekannten Verfahren anwenden.
Das Verfahren kann zum Beispiel auf zwei verschiedenen Wegen angewandt werden, die zu zwei unterschiedlichen Typen von Anwendungen führen:

(1) Verfahren zum DNA-Fingerprinting von Genomen durch zufälliges Auswählen von Teilmengen von einem oder mehreren Restriktionsfragmenten, die durch die PCR-Technik amplifiziert werden sollen. Die Erfindung umfasst auch synthetische Oligonukleotide für die Verwendung in den Verfahren, und einige Anwendungen der Verfahren können die forensische Typisierung, mikrobielle Identifizierung, Sortenidentifizierung, Stammbaumanalyse und das Screenen von mit genetischen Merkmalen verbundenen DNA-Markern sein;
(2) Verfahren zur Identifizierung von einem oder mehreren vorselektierten DNA-Fragmenten, die polymorph sein können, durch PCR-Amplifikation. Die Erfindung umfasst auch spezifische synthetische Oligonukleotide für die Verwendung in den Verfahren, und einige Anwendungen der Verfahren können das Screenen von genetisch vererbten Krankheiten bei Menschen, Überwachen der Vererbung von agronomischen Merkmalen in der Pflanzen- und Tierzucht und die Detektion von Infektionsagenzien bei Krankheiten sein.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 liefert einen grafischen Überblick über das allgemeine Verfahren der PCR-Amplifikation von mit Einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, die durch Verdau genomischer DNA-Moleküle mit einem Restriktionsenzym erhalten werden.
Die 2 veranschaulicht die Ligation von Adaptoren an verschiedene Enden von Restriktionsfragmenten: glatte Enden und versetzte Enden.
Die 3 veranschaulicht die PCR-Amplifikation von mit Einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten. Die Bereiche in Kästchen veranschaulichen die Adaptoren, welche mit dem Restriktonsfragment ligiert sind, und die Primer, welche bei der PCR-Amplifikation eingesetzt werden. Die Pfeile geben die Richtung der DNA-Synthese an.
Die 4 liefert einen grafischen Überblick für die PCR-Amplifikation von mit Einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten.
Die 5 zeigt das allgemeine Design der selektiven Primer, die bei der PCR-Amplifikation von mit Einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten verwendet werden. Die Pfeile bezeichnen die invertierten Repeat-Sequenzen an den Enden der Restriktionsfragmente. Die Selektivität der Primer wird in zwei Beispielen veranschaulicht, in denen es jeweils eine perfekte Paarung und eine totale Fehlpaarung zwischen der selektiven Basensequenz und derjenigen der Restriktionsfragment-Matrizen-DNA gibt.
Die 6 zeigt das Prinzip der selektiven PCR-Amplifikation unter Verwendung eines PCR-Primers, welcher Matrizen-DNA-Moleküle mit einer Trinukleotidsequenz selektiert, die sich benachbart zu der Adaptorsequenz befindet.
Die 7 veranschaulicht die selektive PCR-Amplifikation von mit Einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten.
Die 8 zeigt das Prinzip der Fragment-spezifischen Amplifikation unter Verwendung einer Kombination von zwei PCR-Primern, die jeweils 6 selektive Basen umfassen. Jeder Primer bildet eine doppelsträngige Struktur in dem unterschiedlichen Strang des Restriktionsfragments und bildet dadurch einen Primer/Matrize-Komplex, von welchem eine DNA-Synthese initiiert werden kann (dargestellt durch die Pfeile).
Die 9 veranschaulicht die allgemeinen Sequenzelemente, die mit dem Verfahren der selektiven Restriktionsfragment-Amplifikation erkannt werden, einschließlich der zwei Nukleotidsequenzen, die erkannt werden, und den die zwei Sequenzen trennenden Abstand.
Die 10 veranschaulicht die Typen von Nukleotidsequenz-Varianten, die in dem Verfahren der Identifizierung amplifizierter Fragmentlängenpolymorphismen detektiert werden.
Die 11 zeigt ein 1,0-%-Agarosegel mit der Analyse der Resultate der Amplifikation von mit PstI restringierter bzw. restriktionsbehandelter Tomaten-DNA unter Verwendung von Primern von zunehmender Selektivität.
Die 12 zeigt ein 1,0%-iges Agarosegel mit der Analyse der Resultate einer spezifischen Amplifikation von 3 unterschiedlichen PstI-Fragmenten von Tomaten-DNA unter Verwendung von Fragment-spezifischen Primern.
Die 13 zeigt ein 2,5%iges Polyacrylamid/1-%iges Agarose-Gel mit DNA-Fingerprints, die durch Selektive Restriktionsfragment-Amplifikation von zwei Tomaten-Linien erhalten wurden.
Die 14 zeigt einen Teil eines 4,5%igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 4 Tomaten-Linien unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination PstI/MseI.
Die 15 zeigt einen Teil eines 4,5%igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 10 Lactuca-Linien unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination PstI/MseI.
Die 16 zeigt einen Teil eines 4,5%igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 2 Mais-Linien unter Verwendung von SRFA mit den Enzymkombinationen PstI/TaqI und EcoRI/TaqI.
Die 17 zeigt einen Teil eines 4,5%igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 26 Xanthomonas campestris-Stämmen unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination ApaI/TaqI.
Die 18 zeigt einen Teil eines 4,5%igen denaturierenden Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von verschiedenen Individuen von 4 Haustieren, nämlich Huhn, Schwein, Kuh und Pferd, unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination SseI/MseI.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
5.1 Definitionen
In der nachfolgenden Beschreibung und den Beispielen wird eine Reihe von Begriffen hierin verwendet. Für ein klares und einheitliches Verständnis der Patentbeschreibung und der Ansprüche, einschließlich des solchen Begriffen beigemessenen Geltungsbereichs, werden die nachstehenden Definitionen angegeben.

– Restriktionsendonuklease: eine Restriktionsendonuklease oder ein Restriktionsenzym ist ein Enzym, welches eine spezifische Basensequenz (Zielstelle) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül erkennt und beide Stränge des DNA-Moleküls an jeder Zielstelle spaltet.
– Restriktionsfragmente: die durch den Verdau mit einer Restriktionsendonuklease erzeugten DNA-Moleküle werden als Restriktionsfragmente bezeichnet. Jedes bestimmte Genom wird durch eine spezielle Restriktionsendonuklease zu einem diskreten Satz von Restriktionsfragmenten verdaut. Die DNA-Fragmente, die aus der Restriktionsendonuklease-Spaltung resultieren, werden getrennt und durch Gel-Elektrophorese detektiert.
– Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP): die genomische DNA von zwei nahe verwandten Organismen beispielsweise zeigt Unterschiede in ihrer Nukleotidsequenz-Zusammensetzung an vielen Stellen. Wenn diese Unterschiede in der Zielstelle für eine Restriktionsendonuklease auftreten, wird die modifizierte Zielstelle nicht an diesem Punkt gespalten. Desgleichen kann eine Nukleotidsequenz-Variante eine neue Zielstelle einführen, die nicht in dem anderen Organismus existiert, was dazu führt, dass die DNA durch das Restriktionsenzym an diesem Punkt geschnitten wird. Alternativ modifizieren Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden, die in einem Organismus zwischen zwei Zielstellen für eine Restriktionsendonuklease auftreten, den Abstand zwischen diesen Zielstellen. Aufgrund dessen erzeugt der Verdau der DNA der zwei Organismen Restriktionsfragmente mit unterschiedlichen Längen. Daraus resultiert ein Polymorphismus in der Länge von durch den Verdau der DNA der zwei Organismen erzeugten Restriktionsfragmente.
– Gelelektrophorese: Um Restriktionsfragmente zu detektieren, ist ein Analyseverfahren zur Fraktionierung doppelsträngiger DNA-Moleküle auf Basis der Größe erforderlich. Die am häufigsten angewandte Technik für die Erzielung einer derartigen Fraktionierung ist die Gelelektrophorese. Die Geschwindigkeit, mit welcher DNA-Fragmente sich in solchen Gelen bewegen, hängt von deren Größe ab; so nehmen die zurückgelegten Strecken in dem Maße ab, wie die Fragmentlängen zunehmen. Die durch Gelelektrophorese fraktionierten DNA-Fragmente können direkt durch eine Anfärbeprozedur sichtbar gemacht werden, wenn die Zahl der in dem Muster eingeschlossenen Fragmente klein ist.
– Synthetische Oligonukleotide: die einzelsträngigen DNA-Moleküle mit vorzugsweise nahezu 10 bis nahezu 50 Basen, die chemisch synthetisiert werden können, werden als synthetische Oligonukleotide bezeichnet. Im Allgemeinen sind diese synthetischen DNA-Moleküle so entworfen, dass sie eine einzigartige Nukleotidsequenz aufweisen, obwohl es möglich ist, Familien von Molekülen mit verwandten Sequenzen zu synthetisieren und welche unterschiedliche Nukleotidzusammensetzungen an spezifischen Positionen innerhalb der Nukleotidsequenz aufweisen. Der Begriff 'synthetisches Oligonukleotid' wird zur Bezeichnung von DNA-Molekülen mit einer einzigartigen Nukleotidsequenz verwendet. Der Begriff 'gemischte synthetische Oligonukleotide' wird zur Bezeichnung von Familien von verwandten synthetischen Oligonukleotiden verwendet.
– Ligation: die durch das Enzym Ligase katalysierte enzymatische Reaktion, in welcher zwei doppelsträngige DNA-Moleküle kovalent miteinander verbunden werden, wird als Ligation bezeichnet. Im Allgemeinen werden beide DNA-Stränge kovalent miteinander verbunden, jedoch ist es auch möglich, die Ligasierung von einem der zwei Stränge zu verhindern durch chemische oder enzymatische Modifikation von einem der Enden. In diesem Fall tritt die kovalente Verbindung in nur einem der zwei DNA-Stränge auf.
– Adaptoren: kurze doppelsträngige DNA-Moleküle, mit einer begrenzten Anzahl an Basenpaaren, z. B. 10 bis 30 Basenpaare lang, die so entworfen sind, dass sie an die Enden von Restriktionsfragmenten ligiert werden können. Adaptoren sind aus zwei synthetischen Oligonukleotiden aufgebaut, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die zum Teil zueinander komplementär sind. Beim Mischen der zwei synthetischen Oligonukleotide bilden diese eine doppelsträngige Struktur in Lösung unter geeigneten Bedingungen. Eines der Enden des Adaptormoleküls ist so entworfen, dass es an das Ende eines Restriktionsfragments ligiert werden kann, das andere Ende ist so entworfen, dass es nicht ligiert werden kann.
– Polymerasekettenreaktion (PCR): die enzymatische Reaktion, bei welcher DNA-Fragmente von einer Substrat-DNA in vitro synthetisiert werden, wird als PCR bezeichnet. Die Reaktion beinhaltet die Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotiden, die zu Nukleotidsequenzen in DNA-Molekülen komplementär sind, welche durch einen kurzen Abstand von einigen hundert bis zu einigen tausend Basenpaaren getrennt sind, sowie die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase. Die Kettenreaktion besteht zum Beispiel aus einer Reihe von 10 bis 30 Zyklen. In jedem Zyklus wird die Substrat-DNA zuerst bei hoher Temperatur denaturiert. Nach dem Abkühlen bilden die synthetischen Oligonukleotide, die in hohem Übermaß vorhanden sind, doppelsträngige Strukturen mit den Substrat-DNA-Molekülen in Lösung an spezifischen Stellen auf dem Substrat-DNA-Molekül, welche komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen. Die Oligonukleotid-Substrat-DNA-Komplexe dienen dann als Initiierungsstellen für die DNA-Synthesereaktion, die durch die DNA-Polymerase katalysiert wird, was zu der Synthese eines zu dem Substrat-DNA-Strang komplementären neuen DNA-Strangs führt.
– DNA-Amplifikation: der Begriff DNA-Amplifikation wird zur Bezeichnung der Synthese von doppelsträngigen DNA-Molekülen in vitro unter Anwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Die Produkte der PCR-Reaktion werden als amplifizierte DNA-Fragmente bezeichnet.
– Primer: Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff Primer auf einen DNA-Strang, welcher die Synthese von DNA primen kann. DNA-Polymerase kann DNA nicht von neuem ohne Primer synthetisieren: sie können nur einen vorhandenen DNA-Strang in einer Reaktion verlängern, in welcher der komplementäre Strang als eine Matrize verwendet wird, um die Reihenfolge von Nukleotiden, die zusammengefügt werden sollen, zu steuern. Wir beziehen uns auf die synthetischen Oligonukleotidmoleküle, die in der PCR-Reaktion als Primer verwendet werden.
– Southern-Hybridisierungsprozedur: der Zweck der Southern-Hybridisierungsprozedur, auch als Southern Blotting bezeichnet, ist die physische Übertragung von durch Agarosegel-Elektrophorese fraktionierter DNA auf einen Träger, wie eine Nylon-Membran oder Nitrocellulose-Filterpapier, unter Beibehaltung der relativen Positionen von DNA-Fragmenten, die aus der Fraktionierungsprozedur resultieren. Die Methodik, die zur Bewerkstelligung der Übertragung von Agarosegel auf den Träger angewandt wird, ist es, die DNA von dem Gel in den Träger mittels Kapillarwirkung zu ziehen.
– Nukleinsäure-Hybridisierung: Nukleinsäure-Hybridisierung wird zum Detektieren verwandter DNA-Sequenzen durch Hybridisierung von einzelsträngiger DNA auf Trägern wie einer Nylon-Membran oder Nitrocellulose-Filterpapieren verwendet. Nukleinsäuremoleküle, die komplementäre Basensequenzen besitzen, bilden die doppelsträngige Struktur erneut, wenn sie in Lösung unter den passenden Bedingungen gemischt werden. Die doppelsträngige Struktur wird zwischen zwei komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren gebildet, selbst wenn eine auf einem Träger immobilisiert wird. Bei der Southern-Hybridisierungsprozedur tritt letztere Situation auf.
– Hybridisierungssonde: um eine spezielle DNA-Sequenz bei der Southern-Hybridisierungsprozedur zu detektieren, wird ein markiertes DNA-Molekül oder eine Hybridisierungssonde mit der fraktionierten DNA reagieren gelassen, die an einen Träger, wie eine Nylon-Membran oder Nitrocellulose-Filterpapier, gebunden ist. Die Bereiche auf dem Filter, die zu der markierten DNA-Sonde komplementäre DNA-Sequenzen tragen, werden selbst als eine Folge der Reassoziationsreaktion markiert. Die Bereiche des Filters, die eine solche Markierung aufweisen, können dann entsprechend dem Typ der verwendeten Markierung detektiert werden. Die Hybridisierungssonde wird allgemein durch molekulares Klonieren einer spezifischen DNA-Sequenz von dem Mais-Genom hergestellt.

5.2. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Diese Erfindung betrifft noch spezieller ein in einem Verfahren eingesetztes Kit und Mittel, welche es ermöglichen, dass die Polymerasekettenreaktion (PCR) auf die Detektion von Restriktionsfragmentpolymorphismen (RFPs), einschließlich Längenpolymorphismen, anwendbar ist. Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Detektieren von RFPs, synthetischen Oligonukleotiden für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung, Kits, welche Mittel zum Detektieren von RFPs umfassen, und Anwendungen der Verfahren und Prozeduren der Erfindung für die Pflanzen- und Tierzucht, Diagnostik von genetisch vererbten Krankheiten, Identifizierung von Organismen und forensische Typisierung etc.
Insbesondere stellt diese Erfindung Mittel für die Identifizierung entweder von einzelnen genomischen Restriktionsfragmenten oder von Sätzen von genomischen Restriktionsfragmenten von einem beliebigen Organismus, Mikroorganismus, einer Pflanze, einem Tier oder Menschen, die entweder einzeln genetisch mit einem oder mehreren speziellen Merkmalen verbunden sind oder die gemeinsam einen Fingerprint des Genoms liefern, das zur Identifizierung eines Organismus, einer Sorte oder eines Individuums verwendet werden kann.
Das allgemeine Verfahren für die Erzeugung und für die Identifizierung von Restriktionsfragmenten beinhaltet den Einsatz von Restriktionsendonukleasen, die Ligation von synthetischen Oligonukleotiden an die Restriktionsfragmente und die PCR-Amplifikation von Restriktionsfragmenten (1). Restriktionsendonukleasen spalten genomische DNA-Moleküle an spezifischen Stellen, Zielstellen, wodurch Restriktionsfragmente erzeugt werden.
Die PCR-Amplifikation von Restriktionsfragmenten, ganz gleich, ob man die Nukleotidsequenz der Enden der Restriktionsfragmente kennt oder nicht, kann gemäß der Erfindung erreicht werden, indem man zuerst synthetische Oligonukleotide (Adaptoren) an die Enden von Restriktionsfragmenten ligasiert, wodurch jedes Restriktionsfragment mit zwei gemeinsamen „Tags" versehen wird, die als eine Verankerungsbase für die bei der PCR-Amplifikation eingesetzten Primer dienen.
Typischerweise bilden Restriktionsenzyme entweder glatte Enden, in welchen die terminalen Nukleotide von beiden Strängen eine Basenpaarung ausbilden, oder zueinander versetzte Enden, in welchen einer der zwei Stränge vorsteht, wodurch eine kurze einzelsträngige Verlängerung erhalten wird (2). Im Falle von Restriktionsfragmenten mit glatten Enden werden Adaptoren mit einem glatten Ende verwendet. Im Falle von Restriktionsenden mit versetzten Enden werden Adaptoren verwendet, die eine einzelsträngige Verlängerung aufweisen, die zu der einzelsträngigen Verlängerung des Restriktionsfragments komplementär ist. Folglich werden für jeden Typ eines Restriktionsfragments spezifische Adaptoren verwendet, die nur an einem der Enden differieren, um ein Ligasieren des Adaptors an das Restriktionsfragment zu ermöglichen. Typischerweise sind die verwendeten Adaptoren aus zwei synthetischen Oligonukleotiden aufgebaut, die zum Teil zueinander komplementär sind und die in der Regel ungefähr 10 bis 30 Nukleotide lang sind, vorzugsweise 12 bis 22 Nukleotide lang sind, und die doppelsträngige Strukturen bilden, wenn sie in Lösung zusammen gemischt werden. Unter Verwendung der Enzymligase werden die Adaptoren an die Mischung von Restriktionsfragmenten ligiert. Bei Verwendung eines großen molaren Überschusses von Adaptoren gegenüber Restriktionsfragmenten stellt man sicher, dass alle Restriktionsfragmente am Ende Adaptoren an beiden Enden tragen. Restriktionsfragmente, die mit diesem Verfahren hergestellt werden, werden als mit „Tags" versehene Restriktionsfragmente bezeichnet, und das Verfahren wird weiter als ein Restriktionsfragment-Tagging bzw. Versehen des Restriktionsfragments mit einem „Tag" bezeichnet.
Die Adaptoren können nun als Matrizen für die Primer mit den hierin zuvor definierten Charakteristika dienen, die in der anschließenden PCR-Amplifikationsreaktion eingesetzt werden In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung trägt das Restriktionsfragment den gleichen Adaptor an beiden Enden, und es kann ein einzelner PCR-Primer zur Amplifizierung des Restriktionsfragments verwendet werden, wie in 3 veranschaulicht. Da in einem solchen Fall alle Restriktionsfragmente in der gleichen Weise mit einem „Tag" versehen sind, ist es ganz klar, dass die PCR-Amplifikation einer Mischung von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten alle Restriktionsfragmente in einer synchronen Weise amplifiziert. In einer weiteren Ausführungsform unter Verwendung von unterschiedlichen Restriktionsenzymen zur Spaltung der DNA werden zwei unterschiedliche Adaptoren an die Enden der Restriktionsfragmente ligiert. In diesem Fall können zwei unterschiedliche PCR-Primer zur Amplifizierung solcher Restriktionsfragmente verwendet werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen wird der Adaptor für eines der Enzymenden biotinyliert. Dies erlaubt es einem, aus der komplexen Mischung von Restriktionsfragmenten jene Restriktionsfragmente zu selektieren, die mindestens ein Ende für dieses Restriktionsenzym tragen, unter Anwendung üblicher Verfahren für die Isolierung biotinylierter Moleküle. Dieser Schritt verringert die Komplexität des Ausgangsmischung von Restriktionsfragmenten und stellt einen Anreicherungsschritt vor der PCR-Amplifikation dar, wodurch in bestimmten Fällen der Hintergrund reduziert wird. Die gleichzeitige Amplifikation von mehreren verschiedenen Fragmenten wird häufig als Multiplex-PCR bezeichnet. Das Prinzip der Multiplex-Restriktionsfragment-Amplifikation ist in 4 veranschaulicht.
Die vorliegende Erfindung basiert weiter auf der Definition von spezifisch entworfenen Primern und spezifischen Verfahren zur Steuerung der PCR-Amplifikationsreaktion in einer solchen Weise, dass eine kontrollierte Amplifikation möglich ist, und in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung in einer solchen Weise, dass nur eine kleine Teilmenge von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten amplifiziert wird.
Im Allgemeinen ergeben Restriktionsendonuklease-Verdaue von genomischer DNA und insbesondere von tierischer, pflanzlicher oder humaner genomischer DNA sehr große Zahlen von Restriktionsfragmenten. Die Zahl von Restriktionsfragmenten hängt von der Größe des Genoms und von der Häufigkeit des Auftretens der Zielstelle der Restriktionsendonuklease in dem Genom ab, was wiederum in erster Linie von der Zahl der Nukleotide in der Zielstelle bestimmt wird. Die Zahl der Nukleotide in den Zielstellen von gebräuchlicherweise verwendeten Restriktionsendonukleasen liegt im Bereich von 4 bis 8. Die Genomgrößen von Organismen schwanken stark von einigen Millionen Basenpaaren im Fall von Mikroorganismen bis zu mehreren Milliarden Basenpaaren für Tiere und Pflanzen. Somit kann die Zahl der nach dem Spalten genomischer DNA-Moleküle mit einem Restriktionsenzym erhaltenen Restriktionsfragmente von einigen Hundert bis zu mehreren Millionen schwanken. Allgemein ist die Zahl von Restriktionsfragmenten so groß, dass es nicht möglich ist, einzelne Restriktionsfragmente in durch Gelelektrophorese fraktionierten genomischen DNA-Verdauen zu identifizieren. Solche Verdaue erzeugen in der Regel ein Verschmieren von Banden.
Die PCR-Amplifikation von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten dürfte somit auch ein Verschmieren von Banden erzeugen, da alle Fragmente in der PCR-Reaktion synchron coamplifizieren dürften. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die auf genomische DNAs mit großen Größen anwendbar ist, haben wir ein allgemeines Prinzip zur Begrenzung der Zahl von Restriktionsfragmenten, die amplifiziert werden sollen, angewandt. Dies erfolgt durch Vorselektion einer Teilmenge von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, sodass nur eine relativ kleine Zahl von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten während der PCR-Amplifikationsreaktion amplifiziert wird.
Das in dieser Ausführungsform der Erfindung definierte selektive Prinzip beruht auf dem Design der Oligonukleotide, die als Primer für die PCR-Amplifikation verwendet werden, wie in 5 veranschaulicht ist.
Mit einem „Tag" versehene Restriktionsfragmente besitzen die folgende allgemeine Struktur: eine variable DNA-Sequenz (entsprechend dem Restriktionsfragment vor dem Versehen mit einem Tag), flankiert auf beiden Seiten von einer invertierten DNA-Sequenz (konstanten Sequenz). Die invertierte DNA-Sequenz (konstante DNA-Sequenz) ist aus einem Teil der Zielsequenz der Restriktionsendonuklease und aus der Sequenz des an beide Enden des Restriktionsfragments gebundenen Adaptors aufgebaut. Die variablen Sequenzen der Restriktionsfragmente, die zwischen den konstanten DNA-Sequenzen umfasst sind, sind in der Regel unbekannt und haben somit eine zufällige Sequenzzusammensetzung. Demzufolge sind die Nukleotidsequenzen, welche die konstante DNA-Sequenz flankieren, in einer großen Mischung von Restriktionsfragmenten völlig zufällig.
Die vorliegende Erfindung stellt daher auch spezifische PCR-Primer bereit, welche einen konstanten Nukleotidsequenzteil umfassen, und in der Ausführungsform der Erfindung, die auf der Amplifikation einer restringierten Teilmenge der erhaltenen Restriktionsfragmente beruht, einen variablen Sequenzteil. In dem konstanten Sequenzteil ist die Nukleotidsequenz so entworfen, dass der Primer ein perfektes Basenpaar mit der konstanten DNA-Sequenz von einem der DNA-Stränge am Ende des Restriktionsfragments ausbildet. Der variable Sequenzteil umfasst eine zufällig gewählte Nukleotidsequenz mit einer gewählten Basenzahl im Bereich von 1 bis 10 Basen.
Der Ausdruck "variable Sequenz" bezeichnet noch exakter eine Sequenz, die aus selektierten Nukleotiden besteht, die eine Sequenz bilden, die dann zum Zwecke der Amplifikation einer Teilmenge von Restriktionsfragmenten konstant bleibt. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können mehrere Sequenzen von selektierten Basen verwendet werden, um mehrere voneinander unterschiedene Primer zu definieren. In einem solchen Fall können Primer die gleiche konstante Sequenz und variable Sequenzen, die aus selektierten Basen gebildete sind, aufweisen, die unter den auf diese Weise gebildeten Primern unterschiedlich sind.
Durch die Hinzufügung dieser variablen (selektierten) Sequenzen an das '3-Ende der Primer wird die Vorselektion von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmente gesteuert, die in dem PCR-Schritt amplifiziert werden: wenn die PCR-Reaktion unter passenden Bedingungen durchgeführt wird, initiieren die Primer nur die DNA-Synthese auf jenen mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, in welchen die variable DNA-Sequenz eine perfekte Basenpaarung mit dem Matrizenstrang des mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragments eingehen kann, wie in 5 veranschaulicht ist.
Die Selektion wird durch die Anzahl von Nukleotiden, die in dem variablen Sequenzteil des Primers ruhen, bestimmt: die Selektivität der Primer nimmt mit der Zahl der Nukleotide in dem variablen (selektierten) Sequenzteil zu. Wir verwenden auch den Begriff 'selektive Basen' zur Bezeichnung der Nukleotide in dem variablen Sequenzteil, womit gezeigt wird, dass die Selektion dieser Basen den Primer selektiv macht. Es muss erkannt werden, dass ein mit einem „Tag" versehenes Restriktionsfragment nur amplifiziert wird, wenn die selektiven Basen der verwendeten Primer beide komplementären Sequenzen an den Enden des Fragments erkennen. Wenn der Primer mit nur einem Ende übereinstimmt, wird die Amplifikation eher linear als exponentiell, und das Produkt bleibt undetektiert.
Es ist möglich, zuvor den Selektivitätsgrad, der mit variablen Sequenzen mit unterschiedlichen Zahlen von selektiven Basen erreicht wird, mit Hilfe der allgemeinen Formel 4²ⁿ zu schätzen, worin n der Zahl der selektiven Basen entspricht: bei Verwendung von 1 selektiven Base wird 1 von 16 mit einem „Tag" versehenen Fragmenten amplifiziert, bei Verwendung von 2 selektiven Basen wird 1 von 256, bei Verwendung von 3 selektiven Basen wird 1 von 4096, bei Verwendung von 4 selektiven Basen wird 1 von 65536 etc. amplifiziert. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gibt einem somit die Möglichkeit, eine zufällige Teilmenge von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten von einem beliebigen genomischen DNA-Verdau unabhängig von der Zahl der durch das verwendete Restriktionsenzym erzeugten Fragmente selektiv zu amplifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zahl der selektiven Nukleotide so gewählt, dass die Zahl der Restriktionsfragmente, die amplifiziert werden, auf 5 bis 200 begrenzt ist. Obwohl diese Zahl durch Teilen der Anzahl an Fragmenten durch 4²ⁿ berechnet werden kann, ist eine präzise Vorhersage nicht möglich, weil nicht alle Restriktionsfragmente mit gleicher Effizienz amplifiziert werden können. Von daher findet man in der Praxis weniger Fragmente der Amplifikation als theoretisch erwartet wird. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass Mischungen von zwei (oder mehr) Primern verwendet werden können. Dies ermöglicht die Amplifikation der Fragmente, die durch jeden Primer erkannt werden, und außerdem der Fragmente, die durch die zwei Primer erkannt werden. Schließlich sollte darauf hingewiesen werden, dass die Selektion auf Basis der Basenpaarung zwischen den selektiven Nukleotiden des Primers und der komplementären Matrize stark durch die für den Reassoziationsschritt gewählte Temperatur in der PCR-Reaktion beeinflusst wird, wenn diese Temperatur unterhalb der oder zu nahe an der Schmelztemperatur des Primer/Matrize-Komplexes liegt, werden Primer die nicht perfekt übereinstimmenden Matrizensequenzen reassoziieren, wodurch das Auftreten einer Fehlpaarung in dem Komplex ermöglicht wird. Dies sollte vermieden werden, weil es zu der Amplifikation von viel mehr Fragmenten als vorhergesagt führt, was zu variableren Resultaten führt.
Die gemäß der Erfindung erhaltenen PCR-Produkte können mit Hilfe standardmäßiger Fraktionierungsverfahren zum Separieren von DNA-Molekülen entsprechend der Größe identifiziert werden, gefolgt von einem Anfärben der DNA-Moleküle mit geeigneten Agenzien. Alternativ können die für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer mit einem geeigneten, radioaktiv markierten oder fluoreszierenden Chromophor mit einem „Tag" versehen werden, wodurch die Identifizierung der Reaktionsprodukte nach der Größenfraktionierung ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die PCR-Produkte durch Gel-Elektrophorese unter Verwendung von Standard-Gel-Matrices, wie Agarose, Polyacrylamid oder gemischter Agarose/Polyacrylamid, ohne auf diese beschränkt zu sein, fraktioniert. Die gemäß der Erfindung erhaltenen PCR-Produkte werden weiter mit dem Begriff 'Amplifizierte Restriktionsfragmente (ARF)' bezeichnet.
Die Mittel und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung von Sätzen von ARF von Restriktionsverdauen von jedem beliebigen komplexen Genom genutzt werden. Die Erfindung erlaubt es, dass die Zahl der erhaltenen Restriktionsfragmente entsprechend der Auflösung des Gel-Fraktionierungssystems, das zum Trennen der ARFs zum Einsatz kommt, eingestellt wird. In einer speziellen Ausführungsform sind die selektiven Primer so entworfen, dass 5 bis 10 ARFs gebildet werden, die danach durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt werden. Eine weitere spezielle Ausführungsform beinhaltet die Verwendung von selektiven Primern, die so entworfen sind, dass 20 bis 50 ARFs gebildet werden, die danach auf einem hoch auflösenden Gel-Elektrophoresesystem, wie Polyacrylamidgelen oder gemischten Polyacrylamid-/Agarosegelen, ohne auf diese beschränkt zu sein, getrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind das/die Restriktionsenzym oder -enzyme so gewählt, dass Restriktionsfragmente in einem Größenbereich von 20 bis 1000 Basenpaaren erhalten werden, da, wie allgemein für die PCR-Amplifikation bekannt ist, dieser Fragmentgrößenbereich am wirksamsten amplifiziert wird. Obwohl viele Fragmente auf verschiedenen Standard-Gel-Matrizen fraktioniert werden können, werden beste Resultate durch Fraktionierung auf denaturierenden Polyacrylamidgelsystemen erzielt, wie sie derzeit für die DNA-Sequenzierung eingesetzt werden.
Gemäß der Erfindung werden unterschiedliche Sätze von ARFs mit jedem unterschiedlichen selektiven Primer in der PCR-Amplifikationsreaktion erhalten. Die Muster von nach der Trennung identifizierten ARFs stellen einzigartige und perfekt reproduzierbare Fingerprints der genomischen DNA dar. Solche Fingerprints können mehrere Anwendungsmöglichkeiten haben, wie forensische Typisierung, die diagnostische Identifizierung von Organismen und die Identifizierung von Spezies, Rassen, Sorten oder Individuen, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Identifizierungsgrad wird durch den Ähnlichkeitsgrad (den Grad der Variabilität), der sich bei verschiedenen Vertretern einer spezifischen Gruppe zeigt, bestimmt. Die Variabilität oder Ähnlichkeit wird durch den Variationsgrad in der Nukleotidzusammensetzung der verwandten Genome bestimmt. Das zugrunde liegende Prinzip der Erfindung ist, dass in jedem amplifizierten Restriktionsfragment zwei Nukleotidsequenzen detektiert werden, die durch einen bestimmten Abstand voneinander getrennt sind, wie in 9 veranschaulicht wird. Jede der zwei Nukleotidsequenzen ist aus zwei Teilen aufgebaut: (a) der Zielstelle für die Restriktionsendonuklease und (b) der Nukleotidsequenz benachbart zu der Zielstelle, die in dem selektiven Primer eingeschlossen ist. Bei verwandten Organismen, Spezies, Sorten, Rassen oder Individuen werden diese Sequenzelemente und deren relative Abstände in einem höheren oder geringeren Maße konserviert. Damit stellen die Fingerprints eine Basis für die Bestimmung des Grades von Sequenzbeziehungen zwischen Genomen dar. Andererseits können Unterschiede in den ARF-Mustern dazu genutzt werden, Genome voneinander zu unterscheiden. Der besondere Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber anderen Verfahren für das Fingerprinting von Genomen ist die hohe Auflösung, die mit dem Verfahren erzielt werden kann: mehrere zig oder sogar Hunderte ARFs können gleichzeitig verglichen werden.
Eine weitere spezielle Anwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Screenen und die Identifizierung von Restriktionsfragmentpolymorphismen (RFP). Veränderungen in der Nukleotidzusammensetzung von genomischer DNA führen häufig zu Polymorphismen von Restriktionsfragmenten: Insertionen oder Deletionen beeinflussen die Größe der diese enthaltenden Restriktionsfragmente (10), Nukleotidveränderungen können zu der Eliminierung von Restriktionsendonuklease-Zielstellen oder der Erzeugung neuer Restriktionsendonuklease-Zielstellen führen (11). Die am häufigsten angewandten Techniken zum Identifizieren solcher Veränderungen sind Southern-Blotting-Experimente unter Verwendung von klonierten DNA-Sonden, eine Technik, die in der Regel als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-(RFLP-)Detektion bezeichnet wird. Diese Technik beinhaltet das umfassende Screenen von zufällig klonierten DNA-Fragmenten in Southern-Blotting-Experimenten für assoziierte RFLPs unter verschiedenen Genomen. In Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können RFPs direkt durch Vergleichen der von unterschiedlichen Genomen erhaltenen ARFs identifiziert werden. Im Prinzip ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung für das Detektieren von RFPs empfindlicher, weil nicht nur Unterschiede in den Zielstellen der Restriktionsendonuklease detektiert werden, sondern auch Unterschiede in den benachbarten Nukleotidse quenzen, die in den selektiven PCR-Primern umfasst sind. Folglich stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein weit überlegenes Verfahren zum Detektieren von RFLPs dar.
RFLP^® werden derzeit für mehrere Anwendungen, einschließlich forensischer Typisierung, der Überwachung von genetisch vererbten Krankheiten bei Menschen und der Überwachung der Vererbung von agronomischen Merkmalen in der Pflanzen- und Tierzucht, genutzt. Das zugrunde liegende Prinzip ist, dass bestimmte DNA-Polymorphismen, die mit spezifischen genetischen Merkmalen eng verbunden sind, zur Überwachung des Vorhandenseins oder des Fehlens spezifischer genetischer Merkmale genutzt werden können.
Gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Analyse von ARF-Mustern zur Definition der genetischen Verbundenheit von polymorphen ARFs mit spezifischen genetischen Merkmalen genutzt werden. Solche polymorphen ARFs werden weiter als Amplifizierte Fragmentlängenpolymorphismen (AFLP) bezeichnet, zur Unterscheidung von DNA-Polymorphismen vom RFLP-Typ, die in Southern-Blotting-Experimenten unter Verwendung von klonierten DNA-Sonden detektiert werden.
Eine spezielle Anwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Detektion von mit spezifischen genetischen Merkmalen verbundenem AFLP^®. Die Anwendung beinhaltet die Analyse von ARF-Mustern, die mit unterschiedlichen selektiven Primern in Restriktionsverdauen von genomischer DNA von nahe verwandten Individuen erhalten werden, die Unterschiede in dem spezifischen genetischen Merkmal zeigen, und die Anwendung von Analysetechniken, die Korrelationen zwischen der Vererbung von einem oder mehreren AFLPs und dem durch die spezifischen genetischen Merkmale gezeigten Phänotyp feststellen können.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Anwendung des Verfahrens der Erfindung zur Identifizierung von einem oder mehreren spezifischen Restriktionsfragmenten. Ein spezifisches Restriktionsfragment kann von einer komplexen Mischung von mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmenten zunächst durch Bestimmen der Nukleotidsequenz der ersten 8–12 Basen an jedem Ende des Restriktionsfragments amplifiziert werden. Auf Basis dieser Sequenzen kann man zwei Primer entwerfen, wobei jeweils 5 bis 10 selektive Nukleotide eine Sequenz zeigen, die zu derjenigen der Sequenz, welche die Restriktionsstelle des komplementären Strangs des Restriktionsfragments flankiert, komplementär ist. Unter Verwendung solcher Primersätze kann man nach der PCR-Amplifikation ein einzelnes amplifiziertes Fragment erhalten. Das in diesem Verfahren verwendete Restriktionsfragment kann entweder ein kloniertes Restriktionsfragment oder ein amplifiziertes Restriktionsfragment sein. Da nicht viele Restriktionsfragmente sehr effizient amplifiziert werden können, beinhaltet das bevorzugte Verfahren der Erfindung zum Identifizieren polymorpher DNA-Marker zunächst das Amplifizieren von einem zufällig ausgewählten Satz von Fragmenten und das Identifizieren von AFLPs, die starke Banden nach der PCR-Amplifikation ergeben. Diese AFLP^® können durch Sequenzierung zur Entwicklung Restriktionsfragment-spezifischer Primer charakterisiert werden. Typischerweise wird der AFLP^® durch Ausschneiden der entsprechenden DNA-Bande aus dem Gel und Bestimmen der Nukleotidsequenzen an beiden Enden zur Ermittlung der Sequenz der zu den Restriktionsendonuklease-Zielstellen benachbarten ersten 5 bis 10 Nukleotide isoliert. Nachdem diese Nukleotidsequenzen einmal bekannt sind, können Restriktionsfragment-spezifische Primer entworfen werden, welche nur ein einzelnes Restriktionsfragment von einem genomischen DNA-Verdau amplifizieren. In dieser speziellen Ausführungsform der Erfindung kann ein Satz von zwei verschiedenen selektiven Primern für das Detektieren eines spezifischen Restriktionsfragments verwendet werden. Bei jedem der zwei selektiven Primer von einem Satz werden die selektiven Basen so gewählt, dass sie zu der Nukleotidsequenz benachbart zu der Restriktionsendonuklease-Zielstelle komplementär sind, wie in 8 veranschaulicht wird. Die Zahl der selektiven Basen, die in jedem Primer eingeschlossen sein soll, hängt von der Komplexität der Restriktionsendonuklease-Fragmentmischung ab.
Die PCR-Technik hat sich seit einigen Jahren enorm entwickelt und wird schnell zu einem der am meisten angewandten Diagnoseverfahren in der menschlichen Gesundsfürsorge. Deren Anwendung schließt unter anderem die Detektion von infektiösen Krankheiten und die Detektion von genetisch vererbten Krankheiten ein. Jeder diagnostische Test basiert auf der Verwendung von zwei spezifischen synthetischen Oligonukleotiden, die als Primer in der PCR-Reaktion verwendet werden, um ein oder mehrere DNA-Fragmente von spezifischen Längen zu erhalten. Beim Nachweis von Krankheiten weist der Test das Vorhandensein von nur einem DNA-Molekül pro Probe nach, was das charakteristische DNA-Fragment ergibt. Im Falle von genetisch vererbten Krankheiten sind die Primer so entworfen, dass ihre Produkte zwischen normalen und Krankheitsallelen unterscheiden können. Die Unterscheidung beruht entweder auf Sequenzunterschieden in dem DNA-Segment in dem Genom, das zu dem Primer komplementär ist, oder auf Unterschieden im Abstand zwischen den zwei Primern.
Weil die Primer einen extrem hohen Spezifitätsgrad zeigen, ist es möglich, unterschiedliche Krankheiten gleichzeitig zu überwachen, ein Verfahren, das häufig als Multiplex-PCR bezeichnet wird. Das Multiplex-PCR-Verfahren ist jedoch mit der Einschränkung behaftet, dass allgemein nur wenige, nämlich 5 bis 8 verschiedene Merkmale gleichzeitig überwacht werden können. Die wissenschaftliche Basis für diese Beschränkung ist, dass die optimalen Bedingungen für die PCR-Amplifikation (Reassoziationstemperatur, Mg⁺-Konzentration, Primerkonzentration) beträchtlich schwanken je nach dem verwendeten Paar von Primern. Bei der Multiplex-PCR müssen Kompromissbedingungen eingerichtet werden, unter welchen alle Primerpaare detektierbare Produkte ergeben. Ferner ist dieses Phänomen von dem Phänomen starker Unterschiede in der Effizienz der Amplifikation verschiedener Fragmente überlagert. Folglich ist man häufig auf das Problem gestoßen, dass Produkte bestimmter Primerpaare bei Multiplex-PCR-Reaktionen nicht detektierbar sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung überwindet im Wesentlichen diese Einschränkungen von Multiplex-PCR, weil alle in der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer einen beträchtlichen Teil ihrer Nukleotidsequenz gemeinsam aufweisen. Darüber hinaus wählen wir durch die Auswahl des AFLP^® DNA-Marker aus, die mit gleicher Effizienz amplifiziert werden. Damit zeigen die Optima der PCR-Amplifikationsbedingungen für die unterschiedlichen selektiven Primer eine viel geringere Abweichung als dies bei gängigerweise verwendeten Sequenzspezifischen Primern festgestellt wird. Im Wesentlichen der ideale Kompromiss zwischen der Zahl der Basen in dem synthetischen Oligonukleotid, die notwendig sind, um die erforderliche Spezifität der Detektion eines einzelnen DNA-Fragments einer bestimmten Größe in einem komplexen Genom zu erhalten, die weiter oben berechnet wird, und der Länge und Zusammensetzung des Oligonukleotids, die für die effiziente PCR-Amplifikation optimal sind. Das Verfahren der Erfindung stellt damit ein weit überlegenes Verfahren für Multiplex-PCR bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zum Isolieren von DNA-Marker von jeglichem Genom und für die Verwendung solcher DNA-Marker in allen möglichen Anwendungen des DNA-Fingerprinting bereit.
Die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulichen die Erfindung, die nichtsdestotrotz nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENT-AMPLIFIKATION VON TOMATEN-DNA, UNTER VERWENDUNG VON PSTI
A) Isolierung und Modifizierung der DNA
Gesamt-Tomaten-DNA (Lycopersicon esculentum c. v. Moneymaker) wurde aus jungen Blättern isoliert, wie es durch Bematzski und Tanksley beschrieben wurde (Theor. Appl. Genet. 72, 314–321). Die typische Ausbeute betrug 50–100 μg DNA pro Gramm an frischem Blattmaterial. Die DNA wurde mit PstI (Pharmacia) restringiert, und doppelsträngige (ds) PstI-Adaptoren wurden an die Restriktionsfragmente nach der oben beschriebenen Prozeduren ligiert. Diese Adaptoren wiesen die folgende Struktur auf:
Der 3'TGCA-Überhang bei diesen Adaptoren assoziierte an die versetzten Enden, die durch PstI erzeugt wurden. Die PstI-Erkennungssequenz CTGCAG wird bei der Ligation dieses Adaptors nicht restauriert, da der 5'C-Rest durch A ersetzt wird. Die Ligationsreaktion wurde in einer solchen Art und Weise entworfen, dass das Endergebnis fast ausschließlich DNA-Fragment-an- Adaptormolekülen ist. Dies wurde erreicht durch: 1. die Verwendung von nicht phosphorylierten Adaptoren, was eine Adaptor-an-Adaptor-Ligation ausschließt, 2. die Durchführung der Ligation und der Restriktions-Reaktion zur selben Zeit. Die letztere Vorgehensweise führt zu einer Restriktion eines beliebigen Fragment-an-Fragment-Ligationsproduktes, wodurch diese Produkte fast vollständig beseitigt werden. Ligationsprodukte Adaptor-an-Fragment können durch das Restriktionsenzym nicht geschnitten werden, da die PstI-Erkennungssequenz in diesen Produkten nicht restauriert wird. Die für die Adaptor-Ligation verwendeten Reaktionsbedingungen waren:
2 μg Tomaten-DNA
0,2 μg Adaptoren
20 Einheiten PstI
1 Einheit T4-DNA-Ligase
10 mM Tris.HAc pH-Wert 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc,
2 mM Dithiotreitol, 0,5 mM ATP
Die Ligationsreaktion wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 μl 3 Stunden lang bei 37°C durchgeführt. Nach der Adaptor-Ligation, wurden nicht ligierte Adaptoren durch eine selektive Fällung entfernt. Zu diesem Zweck wurde die Reaktionsmischung auf 100 μl vergrößert und NH4Ac wurde auf eine Endkonzentration von 2,5 M zugegeben. 100 μl von –20°C kaltem Ethanol wurde zugegeben, und die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde durch eine Zentrifugation während 10 Minuten bei 14000 U/min in einer gekühlten Eppendorf-Zentrifuge bei 4°C gewonnen. Das DNA-Pellet wurde einmal mit 0,5 ml 70%-igem Ethanol bei Raumtemperatur gewaschen und in 40 μl T0,1E (10 mM Tris.HCl pH-Wert 8,0, 0,1 mM EDTA) gelöst. Die DNA wurde bei –20°C gelagert. Die Vorgehensweise der selektiven Fällung, die hier beschrieben wird, entfernt in effizienter Weise die nicht ligierten Adaptoren aus der Reaktionsmischung, wobei aber kleine DNA-Fragmente (≤ 200 bp) ebenfalls verloren werden.
B) Die Amplifikations-Reaktion
Die oben präparierte DNA wurde als eine Matrize für die Amplifikation der PstI-Fragmente verwendet. Die Reaktionsmischung für die PCR enthielt:
1 ng Matrizen-DNA
150 ng Primer
1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer)
200 μM von allen 4 dNTPs
10 mM Tris.HCl pH-Wert 8,5, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl
H2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μl
Die Reaktionsmischung wurde mit 20 μl leichtem Mineralöl überschichtet, um eine Verdunstung während der Amplifikations-Reaktion zu vermeiden. Die PCR wurde auf einem Perkin Elmer DNA Thermal Cycler durchgeführt, wobei das folgende Zyklus-Profil zum Einsatz kam: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 60°C, ein Temperaturanstieg von 60°C bis 72°C mit einer Rate von 1°C/5 Sekunden und 2½ Minuten bei 72°C. Eine Gesamtzahl von 33 Zyklen wurde durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 20 μl Chloroform zugegeben und 10 μl Beladungs-Farbstoff, in diesem Fall 50% Saccharose mit 0,1% w/v des Farbstoffs Orange G (Merck). Dies wurde dann mit der Reaktionsmischung gut vermischt und kurz zentrifugiert, um die organische Phase (Mineralöl und Chloroform) von der Reaktionsmischung, die mit dem Beladungs-Farbstoff ergänzt war, zu trennen. 20 μl dieser Reaktionsmischung wurde auf einem 1,0%-igem Agarosegel analysiert.
C) Amplifikation von Tomaten-DNA mit Primern von zunehmender Selektivität
Tomaten-DNA, die mit PstI restringiert und mit dem PstI-Adaptor als „Tag" versehen war, wurde unter Verwendung der oben näher beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Vier verschiedene Primer wurden ausgewählt mit den Sequenzen:
Der Primer 1 ist ein Teil des oberen Strangs des Adaptors, der für die Modifizierung der DNA verwendet wurde, und sollte daher alle PstI-Fragmente amplifizieren. Der Primer 2 enthält einen Teil der Adaptor-Sequenz, die PstI-Erkennungssequenz (Kleine Buchstaben) und ein selektives Nukleotid (fett gedruckt), und sollte theoretisch etwa 1/16 Teil von allen PstI-Fragmenten amplifizieren. Die Primer 3 und 4 sind zu Primer 2 ähnlich, enthalten aber 2 bzw. 3 selektive Nukleotide, und man erwartet daher, dass sie etwa 1/256 und 1/4096 der PstI-Fragmente amplifizieren. Ein Teil der Reaktionsmischungen wurden auf einem 1,0%-igem Agarosegel analysiert, das in der 11 gezeigt ist. Die Bahnen 1 und 6 dieser Figur enthalten DNA-Marker, von denen die Größen auf der linken Seite angegeben sind. Die Bahnen 2, 3, 4 und 5 enthalten die PCRs, die mit den Primern 1, 2, 3 bzw. 4 erhalten wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass nur im Fall des Primers mit 3 selektiven Nukleotiden die Zahl der amplifizierten Fragmente derartig war, dass ein klares Banden-Muster erhalten wurde. Die anderen 3 Primer ergaben Banden-Muster, die auf Agarosegelen nicht aufgelöst werden konnten, da zu viele PCR-Produkte erzeugt wurden. Innerhalb dieser zahlreichen PCR-Produkte herrschten immer einige Fragmente vor und wurden als Banden auf einem Hintergrund-Schmieren der anderen PCR-Produkte erkannt. Wahrscheinlich sind diese stärkeren Produkte in höheren Kopienzahlen auf dem Tomaten- Genom vorhanden oder amplifizieren effizienter als die anderen Produkte. Es wurde erwartet, dass Primer mit 3 selektiven Nukleotiden verwendet werden mussten, um ein klares Banden-Muster auf Agarosegelen zu erzeugen, wegen der Gesamtzahl an PstI-Fragmenten von genomischer DNA der Tomate (20 000 bis 100 000).
D) Analyse von amplifizierten Fragmente auf Southern-Blots
Die amplifizierten Fragmente wurden auf Southern-Blots untersucht, um zu verifizieren, dass diese Fragmente den Bona-fide-Restriktionsfragmenten der selben Größe entsprachen. Zu diesem Zweck wurden vier einzelne Fragmente, die mit dem Primer 4 erhalten wurden, aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Die DNA wurde aus diesen Gelstückchen mit Hilfe einer Absorption an Glas-Kügelchen (Gene Clean, Hersteller Bio 101) gereinigt, und ein Teil der gereinigten DNA wurde erneut amplifiziert, um etwa 1 μg von jedem der vier DNA-Fragmente zu erhalten. Die Reamplifikations-Reaktionen wurden nachfolgend auf einem 1,0%-igem präparativen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, und die gewünschten DNA-Fragmente wurden aufgereinigt. 200 ng von jedem Fragment wurden mit (α-32P)dATP unter Verwendung eines Zufalls-Hexamer-Markierungs-Kits gemäß den durch den Hersteller (Boehringer Mannheim) empfohlenen Arbeitsanweisungen markiert. Gesamt-Tomaten-DNA wurde mit PstI restringiert und auf einem 1,0%-igem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Vier klar getrennte Bahnen wurden verwendet, von denen jede etwa 3 μg restringierte DNA enthielt. Als nächstes wurde das Agarosegel auf eine Genescreen+ Hybridisierungsmembran, wie durch den Hersteller (New England Nuclear) angegeben, geblottet. Nach dem Blotten wurde das Gel in vier Stückchen geschnitten, wobei jedes eine Bahn der mit PstI restringierten Tomaten-DNA enthielt. Diese vier Stücke wurden jeweils an eine der vier DNA-Sonden entsprechend der Vorgehensweise, die von Klein-Lankhorst et al. (Theor. Apll. Genet. 81, 661–667) beschrieben wurde, hybridisiert. Von den hybridisierten Blots wurden während 40 Stunden unter Verwendung von Kodak XAR5-Filmen autoradiographische Aufnahmen gemacht. Die erhalten Ergebnisse zeigten, dass alle genomischen DNA-Fragmente, die durch die vier DNA-Sonden erkannt wurden, die gleiche Länge wie diese Sonden aufwiesen. Dies zeigte, dass die amplifizierten Fragmente, als Sonden verwendet, aus den Fragmenten hervorgegangen sind, die auf den Blots nachgewiesen wurden.
E) Selektive Amplifikation eines einzelnen Restriktionsfragments
Drei Sätze von Primern wurden für 3 entsprechende zufällige PstI-Fragmente aus Tomaten-Genom-DNA entworfen, von denen die Sequenz neben der PstI-Erkennungssequenz bekannt war. Es wurden Sätze von Primern mit 5 selektiven Nukleotiden, wie unten gezeigt, hergestellt.
Primer-Satz 1: Sequenz 1:
Primer-Satz 2: Sequenz 2:
Primer-Satz 3: Sequenz 1:
Tomaten-DNA wurde mit PstI verdaut, und Adaptoren wurden an die Enden der Restriktionsfragmente, wie oben beschrieben, ligiert. Diese DNA wurde als Matrize in PCRs mit den Primer-Sätzen 1 oder 2 oder 3 verwendet, wobei die Bedingungen verwendet wurden, wie sie in einem der vorangegangenen Abschnitte beschrieben worden sind. Die Reaktionsprodukte von jeder PCR wurden auf einem 1,0%-igem Agarosegel analysiert. Dieses Gel ist in der 12 gezeigt. Die 12 zeigt 13 Bahnen, von denen die Bahnen 1, 2, 12 und 13 DNA-Marker sind. Die Größen in Kilobasen dieser Marker sind auf beiden Seiten des Gels angegeben. Die Bahnen 3, 6 und 9 zeigen Plasmid-DNA mit jedem der drei PstI-Fragmente, die mit PstI restringiert worden sind, was das Vektor-Fragment, pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103–119), und das insertierte PstI-Fragment ergibt. Die Bahnen 4 und 5 zeigen eine Amplifikation mit dem Primer-Satz 1 von 5 fg der entsprechenden Plasmid-DNA bzw. 1 ng Gesamt-Genom-DNA. Die Bahnen 7 und 8 zeigen eine Amplifikation mit dem Primer-Satz 2 von Plasmid-DNA und Gesamt-Genom-DNA, und die Bahnen 10 und 11 zeigen eine Amplifikation mit dem Primer-Satz 3. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass es möglich ist, ein einzelnes PstI-Fragment aus einer Mischung von mindestens 20 000 Fragmenten unter Verwendung der Technik der selektiven Restriktionsfragment-Amplifikation mit Primern, die 5 selektive Nukleotide aufweisen, zu amplifizieren.
F) Identifizierung von DNA-Polymorphismen unter Verwendung von SRFA
In den vorangegangenen Abschnitten wurde klar gezeigt, dass es mit der Technik der selektiven Restriktionsfragment-Amplifikation möglich ist, Restriktionsfragmente zu amplifizieren, entweder zufällig oder spezielle Fragmente, wenn die Sequenzinformation zur Verfügung steht. Deshalb sollte es möglich sein, nach Restriktionsstellen-Polymorphismen zwischen zwei Individuen der gleichen Spezies zu suchen. Dies wird unten für zwei Tomaten-Linien beschrieben, welche sehr verwandt sind, sich aber in der Anwesenheit des Wurzelknoten-Nematoden-Resistenzgens, Mi, in einer der Linien unterscheiden. Dieses Mi-Gen stammt von Lycopersicon peruvianum, einer Spezies, die mit der essbaren Tomate L. esculentum entfernt verwandt ist. Es ist in die L. esculentum-Linie durch Kreuzung und nachfolgende 12-malige Rückkreuzung zum L. esculentum-Vorgänger und durch das Selektieren des Abkömmlings auf die Anwesenheit des Mi-Gens eingeführt worden. Daher unterscheiden sich die beiden Tomaten-Linien nur in einem kleinen Teil ihres genetischen Materials, d. h. dem Mi-Gen und die umgebende Region. Es wurde berechnet, dass die Mi-Region < 1% des Genoms dieser Linie ausmacht, wobei klassische genetische Verfahren verwendet wurden.
DNA wurde aus den beiden Tomaten-Linien (Linie 83M-71392, Mi-sensitiv und Linie 83M-71398, Mi-resistent, die von De Ruiter Seeds, Bleiswijk, Niederlande, erhalten wurden) isoliert und anschließend mit PstI restringierten und mit Adaptoren, wie oben beschrieben, versehen. Eine große Zahl von Amplifikations-Reaktionen wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die sich in ihrer Erweiterung an selektiven Nukleotiden unterschieden. Es wurden drei selektive Nukleotide verwendet, und neben einzelnen Primern wurden auch Kombinationen von zwei verschiedenen Primern verwendet. Die Reaktionen wurden auf gemischten Polyacrylamid/Agarose-Gelen analysiert: 2,5% Polyacrylamid und 1,0% Agarose wurden verwendet, mit einem Verhältnis Acrylamid zu Bisacrylamid von 20:1. Die Gele wurden auf einer Protean II Geleinheit (Biorad) unter Verwendung von Abstandshaltern von 1,5 mm laufen gelassen. Insgesamt wurden 16 verschiedene Primer verwendet, was 16 Reaktionen mit einem einzelnen Primer und 120 Reaktionen mit allen möglichen Kombinationen von zwei Primern ergab. Ein typisches Beispiel eines Gels mit sechs von diesen Kombinationen ist in der 13 gezeigt. Die Bahnen 1 und 14 dieses Gels enthalten DNA-Marker, von denen die Größen in Kilobasen auf der rechten Seite des Gels angegeben sind. Die Bahnen 2 und 3, 4 und 5, 6 und 7 usw. enthalten Amplifikationen mit einem spezifischen Primer oder Primerpaar der beiden Tomaten-Linien. Das Screenen nach Restriktionsstellen-Polymorphismen ergab eine Anzahl von Fragmenten, von denen drei äußerst herausragend waren, und die in den Bahnen 9, 11 und 12 von 13 dargestellt sind (kenntlich gemacht durch einen kleinen Kreis). Es wurde erwartet, dass die polymorphen Banden in den Bahnen 9 und 11 die gleichen sind, da der gleiche Primer bei beiden Reaktionen vorhanden war (der Unterschied besteht in der Gegenwart eines zweiten Primers in der Bahn 11). Die beiden polymorphen Fragmente der Bahnen 11 und 12 wurden aus dem Gel ausgeschnitten, die Gelstücke wurden zerkleinert, indem sie durch eine Nadel von Maß 18 getrieben wurden, und die DNA wurde aus den Gelstücken durch eine Elution durch Diffusion in 200 μl 100 mM Tris.HCl pH-Wert 8,0, 10 mM EDTA eluiert. 2 μl wurden für eine erneute Amplifikation dieser Fragmente, wie oben beschrieben, verwendet. Bei 200 ng von jedem Fragment wurden, unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase, glatte Enden erzeugt, und sie wurden anschließend an 100 ng des Plasmidvektors pUC18 (Panisch-Perron et al., Gene 33, 103–119) ligiert, der mit SmaI restringiert worden war. Die Ligationsmischung wurde zu E. coli transformiert, und für jedes Fragment wurde ein rekombinanter E. coli-Klon für eine Sequenzanalyse ausgewählt. Alle diese Arbeitsvorgänge wurden unter Verwendung von Standard-Prozeduren durchgeführt, wie sie von Sambrook, Fritsch und Maniatis in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) beschrieben worden sind.
Zwei Sätze von Primern mit 6 selektiven Nukleotiden wurden auf der Grundlage der Sequenzen der beiden Fragmente, wie oben beschrieben, synthetisiert. Wir waren in der Lage, jedes Fragment unter Verwendung dieser Primer-Sätze spezifisch zu amplifizieren. Die Fragmente wurden nur aus der Tomaten-Linie amplifiziert, von der sie stammten. Deshalb wiesen diese Primer-Sätze den gleichen Polymorphismus auf, der am Anfang mit den Primern mit 3 selektiven Nukleotiden gefunden wurde, welche dazu verwendet wurden, diesen Polymorphismus aufzufinden.
BEISPIEL 2: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENT-AMPLIFIKATION VON TOMATEN-DNA MIT ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN
In Beispiel 1 ist das Prinzip der selektiven Restriktionsfragment-Amplifikation (SRDA) unter Verwendung von Tomaten-DNA und des Restriktionsenzyms PstI beispielhaft angegeben. In diesem Beispiel wird die SRFA unter Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen, PstI und MseI, veranschaulicht werden.
Isolierung und Modifizierung der DNA
Gesamt-Tomaten-DNA wurde aus jungen Blättern isoliert, wie es im Beispiel 1 beschrieben wurde. Zwei Paare von so genannten isogenen Linien wurden als Quelle der DNA verwendet, welche mit Gem^R und Gem^S bzw. GCR26 und GCR151 bezeichnet sind (Diese Linien sind in den folgenden Referenzen beschrieben: Denby und Williams, [1962], Can. J. Plant Sci. 42, 681–685, Smith und Ritchie, [1983], Plant Mol. Biol. Rep. 1, 41–45). Die beiden Individuen von jedem Paar der isogenen Linien sind genetisch sehr ähnlich, unterscheiden sich aber in der Gegenwart eines Merkmals, das eine Resistenz gegen das fungale Pathogen Verticillium alboatratum verleiht.
Der erste Schritt der Modifizierung der DNAs umfasste die Restriktion der DNAs mit den beiden Enzymen PstI und MseI. Die Restriktion der DNA und auch die anschließende Ligation der A daptoren an die DNA-Fragmente wurde im gleichen Puffer durchgeführt, der RL-Puffer (Restriktions-Ligations-Puffer) genannt wurde, und der enthielt: 10 mM Tris.HAc/10 mM MgAc/50 mM KAc/5 mM DTT, pH-Wert 7,5.
Restriktion der DNAs mit PstI und MseI

2,5 μg DNA
12,5 Einheiten PstI (Pharmacia, 10 Einheiten/μl)
12,5 Einheiten MseI (N. E. Biolabs, 4 Einheiten/μl)
5 μl 10 × RL-Puffer
H₂O auf 50 μl

Die Inkubation wurde bei 37°C 1 h lang ausgeführt.
Der nächste Schritt bei der Modifizierung der DNAs war die Ligation von Adaptormolekülen an den Enden der DNA-Fragmente. Zuerst mussten doppelsträngige Adaptormoleküle hergestellt werden.
Herstellung von Adaptoren
Zur Herstellung einer Lösung von 50 pMol/μl von diesem Adaptor wurden 8 μg (1430 pMol) des 16-mer 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 mit 7 μg (1430 pMol) des 14-mer 5-TACTCAGGACTCAT-3 in einem Gesamtvolumen von 28,6 μl H₂O gemischt.
Zur Herstellung einer Lösung von 5 pMol/μl von diesem Adaptor wurden 5,25 μg (715 pMol) des biotinylierten 21-mer 5-bio-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 mit 3,5 μg (715 pMol) des 14-mer 5-TGTACGCAGTCTAC-3 in einem Gesamtvolumen von 143 μl H₂O gemischt.
Ligation von den Adaptormolekülen
Zu der restringierten DNA wurde eine Mischung von 10 μl hinzugesetzt, die folgendes enthielt:
1 μl PstI – Bio-Adaptor (= 5 pMol)
1 μl MseI – Adaptor (= 50 pMol)
1,2 μl 10 mM ATP
1 μl 10 × RL-Puffer
1 Einheit T4 DNA-Ligase (Pharmacia, 5 Einheiten/μl) H₂O auf 10 μl
Die resultierende Reaktionsmischung von 60 μl wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Die Adaptoren wurden in einer solchen Weise entworfen, dass die Restriktionsstellen nach der Ligation nicht restauriert wurden Auf diese Weise wurde eine Fragment-an-Fragment-Ligation verhindert, da Fragmentkonkatamere restringiert wurden, und zwar weil die Restriktionsenzyme während der Ligationsreaktion immer noch aktiv waren. Eine Adaptor-an-Adaptor-Ligation war nicht möglich, da die Adaptoren nicht phosphoryliert waren (siehe ebenfalls Beispiel 1).
Auswahl von biotinylierten DNA-Fragmenten
Die Herstellung von Matrizen-DNA für die SRFA unter Verwendung von zwei Restiktionsenzymen involvierte im Allgemeinen einen Extraschritt, der nicht zur Anwendung kam, wenn SRFA mit einem einzelnen Enzym angewendet wurde. In diesem Schritt wurden die DNA-Fragmente, an welchen ein biotinylierter Adaptor ligiert worden war, von allen anderen Fragmenten abgetrennt.
Biotinylierte Fragmente wurden von nicht-biotinylierten Fragmenten (MseI-MseI-Fragmenten) in diesem Schritt abgetrennt, indem an paramagnetische Streptavidin-Kügelchen (Dynal) gebunden wurde. 10 μl an Kügelchen wurden einmal in 100 μl STEX (100 mM NaCl/10 mM Tris.HCl/1 mM EDTA/0,1% Triton X-100 pH 8,0) gewaschen und in 140 μl STEX erneut suspendiert. Die Kügelchen wurden anschließend zu der Ligationsmischung hinzugesetzt, wodurch man ein Endvolumen von 200 μl erhielt. Dieses wurde 30 Minuten lang mit einer sanften Bewegung bei Raumtemperatur inkubiert, um eine angemessene Bindung der biotinylierten DNA-Fragmente an den Kügelchen sicherzustellen. Die Kügelchen wurden gesammelt, indem die Röhrchen, welche die Kügelchen enthielten, in die Nähe eines Magnetes gehalten wurden. Dies verhinderte, dass die Kügelchen pipettiert wurden, wenn der Überstand zu einem anderen Röhrchen übertragen wurde. Die Kügelchen wurden einmal gewaschen und anschließend zu einem frischen Röhrchen überführt. Dann wurden die Kügelchen 3 mal mit 200 μl STEX gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen erneut in 200 μl T01.E (10 mM Tris/0,1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert und zu einem frischen Röhrchen überführt. Die DNA wurde bei 4°C gehalten.
Die DNAs, welche mit den Restriktionsenzymen restringiert wurden, mit Adaptoren versehen wurden, an die paramagnetischen Streptavidin-Kügelchen gebunden wurden und mit den MseI-MseI-Fragmenten, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, gereinigt wurden, werden in den nachfolgenden Schritten als Matrizen-DNAs bezeichnet.
Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten
Die Matrizen-DNA, welche wie oben beschrieben hergestellt werden, sollten alle PstI-MseI-Fragmente aus den erwähnten Tomaten-Linien und darüber hinaus eine kleine Menge an PstI-PstI-Fragmenten ohne interne MseI-Fragmente enthalten. In diesem Experiment wurde eine Vielzahlt von diesen PstI-MseI-Fragmenten durch Amplifizierung visualisiert, so wie es im Wesentlichen im Beispiel 1 beschrieben ist. Die Gelanalysen der Amplifizierungsprodukte wurde auf denaturierenden Acrylamidgelen durchgeführt (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560–564), da die Art von Fragmenten, welche durch die in diesem Beispiel beschriebene Prozedur erhalten worden war, viel kleiner war, als jene, die im Beispiel 1 beschrieben wurde. Darüber hinaus ermöglichten diese Typen von Gelen die Trennung von bis zu 100 Banden pro Bahn, was etwa zehn Mal mehr als die im Beispiel 1 beschriebenen Agarosegele war. Die Fragmente wurden sichtbar gemacht, indem einer der PCR-Primer an dem 5'-Ende mit (γ-³²P)-ATP und Polynukleotidkinase markiert wurde.
Markierung von dem PCR-Primer
Der für die Markierung ausgewählte Primer war das 19-mer 5-GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3, welches als MseI-Primer-1 bezeichnet wurde, und in welchem die selektiven Nukleotide mit kleinen Buchstaben angegeben sind. Die Markierung wurde folgenderweise durchgeführt:
3,0 μl 18-mer (aus einer Lösung von 50 ng/μl = 150 ng)
5,0 μl (γ-³²P)-ATP (aus einer Lösung von 10 μCi/μl = 50 μCi)
3,0 μl 250 mM Tris.HCl/100 mM MgCl₂/50 mM DTT, pH 7,5
0,5 μl T4-Kinase (Pharmacia 10 Einheiten/μl)
18,5 μl H₂O
Dies gab ein Gesamtvolumen von 30 μl, welches bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert wurde. Für jede PCR wurde 1 μl dieses 5'-markierten Primers hinzugesetzt.
Es wurden insgesamt 28 PCRs durchgeführt, wobei jede der 4 Matritzen-DNAs mit 7 Primerkombinationen amplifiziert wurden. Jede Primerkombination wies den gleichen MseI-Primer (MseI-Primer-1, wie oben beschrieben) auf, jedoch lag eine Variation in der Wahl des PstI-Primers vor. Insgesamt 7 unterschiedliche Primer wurden gewählt (wie bei dem MseI-Primer sind die selektiven Nukleotide mit kleinen Buchstaben angegeben):
Alle PCR-Primer wurden in H₂O bei einer Konzentration von 50 ng/μl gelöst.
Die Amplifizierungsreation
Die PCR-Mischung bestand aus:
2,0 μl Matrizen-DNA
1,0 μl 5'-markiertem MseI-Primer (5 ng)
0,5 μl nichtmarkiertem MseI-Primer (25 ng)
0,6 μl PstI-Primer (30 ng)
2,0 μl 100 mM Tris.HCl/15 mM MgCl₂/500 mM KCl, pH 8,5
0,8 μl 5 mM dNTPs
0,1 μl Taq-Polymerase (Cetus Perkin Elmer, 5 Einheiten/μl)
13,0 μl H₂O
Alle Komponenten der Reaktion wurden hinzugesetzt und gut gemischt, wobei eine wesentliche Komponente der PCR, im Allgemeinen das Enzym, zuletzt hinzugesetzt wurde. Anschließend wurde die Reaktion so bald wie möglich gestartet.
Die Amplifizierungen wurden auf einem Thermal Cycler 9600 von Perkin Elmer durchgeführt.

Das Zyklusprofil war wie folgt.

1 Zyklus:	Denaturierung:	30 s bei 94°C
	Reassoziieren:	30 s bei 65°C
	Extension:	60 s bei 72°C

11 Zyklen:	Denaturierung:	30 s bei 94°C
	Erniedrige die Reassosziationstemperatur um 0,7°C für jeden Zyklus,

	64,3°C,	63,6°C,	62,9°C,	62,2°C,	61,5°C,	60,8°C,
	60,1°C,	59,4°C,	58,7°C,	58,0°C,	57,3°C.	Inkubiere 30
	Sekunden bei jeder Temperatur.
	Extension:	60 s bei 72°C

23 Zyklen:	Denaturierung:	30 s bei 94°C
	Reassoziieren:	30 s bei 56°C
	Extension:	60 s bei 72°C

Gelanalyse und amplifizierte Fragmente
Die Reatkionsprodukte wurden auf 4,5%-igen denaturierenden Polyacrylamidgelen analysiert. 50 × 38 cm große Gele wurden verwendet, wobei die Gelkassetten davon, um diese Gele herzustellen, von Biorad gekauft wurden. 100 ml einer Gellösung wurde verwendet, die 4,5% w/v Acrylamid/0,225% w/v Bisacrylamid/7,5 M Harnstoff/50 mM Tris/50 mM Borsäure/1 mM EDTA, pH 8,3 enthielt. 100 ml Gellösung wurde mit 500 μl 10%-igem Ammoniumpersulfat und 100 μl TEMED direkt vor dem Gießen des Gels gemischt. Es wurde ein Tris/Borsäure/EDTA-Puffer als Elektrophoresepuffer verwendet, und er enthielt: 100 mM Tris/100 mM Borsäure/2 mM EDTA, pH 8,3. Die Reaktionsmischungen wurden mit einem gleichen Volumen (20 μl) an 98% Formamid/10 mM EDTA/0,01% w/v Bromphenolblau/0,01% w/v Xylolcyanol gemischt. Die resultierenden Mischungen wurden 3 Minuten lang bei 95°C erhitzt und dann schnell auf Eis gekühlt. 2 μl jeder Probe wurde auf das Gel geladen. Gele wurde bei einer konstanten Leistung von 110 Watt laufen gelassen, um eine konstante Wärmentwicklung während der Elektrophorese zu erhalten. Unter diesen Bedingungen entsprach die Feldstärke der Gele 40 bis 50 Volt/cm.
Die Ergebnisse der SRFA-Reaktionen sind in der 14 gezeigt. Die Bahnen sind von 1 bis 28 nummeriert und enthalten jedes mal die vier Tomaten-Linien mit einer der 7 Primerkombinationen. Die Reihenfolge der Tomaten-Linien auf dem Gel ist: 1. GCR26, 2. GCR151, 3. Gem^R, 4. Gem^S. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten jene DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-1 amplifiziert wurden, die Bahnen 5 bis 8 enthalten jene DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-2 amplifiziert wurden, die Bahnen 9 bis 12 enthalten die DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-3 amplifiziert wurden, die Bahnen 13 bis 16 enthalten die DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-4 amplifiziert wurden, die Bahnen 17 bis 20 enthalten jene DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-5 amplifiziert wurden, die Bahnen 21 bis 24 enthalten jene DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-6 amplifiziert wurden, und die Bahnen 25 bis 28 enthalten jene DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-7 amplifiziert wurden. Das Gel enthält keine Größenmarker, jedoch entsprachen die sichtbar gemachten DNA-Fragmente ±200 Nukleotide am unteren Teil der Figur bis ±500 Nukleotide am oberen Teil.
BEISPIEL 3: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENT-AMPLIFIZIERUNG VON DNA VON VERSCHIEDENEN LACTUCA-SPEZIEN MIT ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN
Im Beispiel 2 wird das Prinzip der selektiven Restriktionsfragment (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen beispielhaft für Tomaten-DNA dargestellt. In diesem Beispiel veranschaulichen wir, dass ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von DNAs unterschiedlicher Lactuca-Spezien, wobei die gleichen zwei Restiktionsenzyme PstI und MseI verwendet werden, erhalten werden.
Isolierung und Modifizierung der DNA
DNAs wurden so isoliert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, und zwar unter Verwendung von jungem Blattmaterial verschiedener Lactuca-Spezien. Wie unten dargelegt, schließen diese Pflanzen eine kommerzielle Salat (L. sativa)-Varietät bzw. -Sorte und mehrere Individuen von zwei wilden Lactuca-Spezien, L. saligna und L. virosa ein. Die Pflanzen wurden willkürlich mit den folgenden Namen bezeichnet:

1. L. saligna, Nr. 21, Pflanze 1
2. L. saligna, Nr. 21, Pflanze 2
3. L. saligna, Nr. 22, Pflanze 1
4. L. saligna, Nr. 22, Pflanze 2
5. L. virosa, Nr. 01, Pflanze 1
6. L. virosa, Nr. 01, Pflanze 2
7. L. virosa, Nr. 02
8. L. virosa, Nr. 03, Pflanze 1
9. L. virosa, Nr. 03, Pflanze 2
10. L. sativa, eine kommerzielle Kopfsalat-Sorte

Das auf diese Weise analysierte genetische Material repräsentierte 6 unterschiedliche Pflanzentypen einschließlich zwei unterschiedlichen Individuen von 4 dieser Pflanzen.
Es wurde eine Modifizierung der Lactuca-DNAs in identischer Weise zu der im Beispiel 2 beschriebenen Prozedur durchgeführt, um die Matrizen für die SRFA zu erzeugen.
Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten
Die DNAs, welche wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden als Matrizen für SRFA-Reaktionen verwendet. Zwei Primerkombinationen wurden verwendet, wobei ein einzelner MseI-Primer und zwei unterschiedliche PstI-Primer zur Anwendung kamen. Diese Primer (selektive Nukleotide sind in kleinen Buchstaben dargestellt) waren:
Die Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten unter Verwendung der oben dargestellten Primer wurde exakt so durchgeführt, wie es im Beispiel 2 beschrieben worden ist, und die erzeugten Fragmente wurden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist, sichtbar gemacht. Die erhaltenen Bandenmuster sind in der 15 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 10 zeigen die DNAs 1 bis 10, amplifiziert mit dem MseI-Primer in Kombination mit PstI-Primer-1, die Bahnen 11 bis 20 zeigen die DNAs 1 bis 10, amplifiziert mit dem MseI-Primer in Kombination mit PstI-Primer-2. Größenmarker, (welche in dieser Figur nicht sichtbar sind) in Nukleotiden sind rechts von dem Gel angegeben. Die Unterschiede von den Bandenmustern reflektieren den Unterschied im Verwandtschaftsgrad der verschiedenen Pflanzen.
BEISPIEL 4: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPFLIFIZIERUNG VON KORN- BZW. MAIS-INZUCHTLINIEN MIT EINER VIELZAHL VON RESTRIKTIONSENZYMKOMBINATIONEN
In den Beispielen 2 und 3 wird das Prinzip der selektiven Restriktionsfragement (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen unter Anwendung von Tomaten-DNA bzw. Salat (Lactuca-Spezien)-DNAs beispielhaft dargelegt. In diesem Beispiel wird veranschaulicht, das ähnliche Ergebnisse mit Mais (Zea-Mais)-Linien erhalten werden. Darüber hinaus wird veranschaulicht, dass eine Vielzahl von Restriktionsenzymkombinationen zur Anwendung kommen kann, um DNA-Fingerprints von, in diesem Fall, Maislinien zu erhalten.
Isolierung und Modifizierung der DNA
Zwei Mais-Inzuchtlinien wurden verwendet, mit der Bezeichnung 1 und 2. Die Quelle dieser Linien ist irrelevant, da nach unserer Erfahrung jede ausgewählte Zelllinie gute DNA-Fingerprints unter Verwendung von SRFA ergab. DNA dieser Linien wurde aus jungem Blattmaterial isoliert, wie es von Saghai-Mahoof et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 8014–8018) beschrieben worden ist. Die folgenden Restriktionsenzymkombinationen (EKs) kamen zur Anwendung, um die Matrizen-DNA herzustellen: PstI/TaqI, EcoRI/TaqI, AseI/TaqI, Sse8387-I/TaqI. Alle Enzyme wurden von Pharmacia gekauft, außer AseI, welches von New England Biolabs gekauft wurde, und Sse8387-I, welches von Amersham gekauft wurde. Matrizen-DNAs wurden im Wesentlichen so hergestellt, wie es in den Beispielen 2 und 3 beschrieben worden ist, und zwar mit den folgenden Ausnahmen:
Die Restriktion der DNA wurde durchgeführt, indem zuerst mit TaqI bei 65°C eine Stunde lang inkubiert wurde und anschließend mit dem zweiten Enzym, PstI, AseI, EcoRI oder Sse8387-I, für eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert wurde. Die Ligation von Adaptoren war wie im Beispiel 2 beschrieben, und zwar unter Verwendung der folgenden Adaptoren:
Amplifizierung von Restriktionsfragmenten
Die Amplifizierung von Restriktionsfragmenten wurde so durchgeführt, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist. Die Primer, welche zur Markierung der Amplifizierungsprodukte ausgewählt wurden, waren die folgenden TaqI-Primer mit 3 selektiven Nukleotiden (angegeben durch kleine Buchstaben):
Diese 4 Primer wurden zum Nachweis von Amplifikationsprodukten mit allen vier Enzymkombinationen verwendet. Für jede Enzymkomtination wurden 4 Primer für das andere Enzym gewählt, um insgesamt 16 Kombinationen für jedes Enzym zu erhalten. Diese Primer sind unten angegeben (wobei selektive Nukleotide in kleinen Buchstaben angegeben sind). Für EcoRI und AseI wurden Primer mit 3 selektiven Nukleotiden gewählt, für PstI wurden Primer mit 2 selektiven Nukleotiden gewählt, und für SseI wurden Primer mit einem einzeln selektierten Nukleotid gewählt. Für Enzyme, die weniger häufig in der genomischen Mais-DNA schneiden, wurden Primer gewählt, die Extensionen mit weniger selektiven Nukleotiden enthalten.
Insgesamt wurden 128 PCRs durchgeführt (2 DNAs × 4 Enzymkombinationen × 16 Primerkombinationen), wobei man das in Beispiel 2 beschriebene Protokoll nachvollzog. Die Reaktionsprodukte von diesen PCRs wurden auf 3 Gelen (die 48 Bahnen/Gel enthielten) analysiert, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist. Alle Primerkombinationen ergaben DNA-Fingerprints von 50 bis 100 Banden pro Bahn, außer für die Kombination SseI/TaqI, welche nur 10 bis 15 Banden pro Bahn ergaben. Ein Beispiel von einem der Gele ist in der 16 gezeigt. Diese Figur zeigt einen Teil des Gels mit der Analyse von DNA-Fingerprints, der mit den Enzymkombinationen PstI/TaqI und EcoRI/TaqI erhalten wurde. Die Bahnen 1 bis 8 zeigen DNA-Fingerprints der Mais-DNAs, die mittels SRFA mit TaqI-Primer-3 und PstI-Primer-1, -2, -3 bzw. -4 erhalten wurden, die Bahnen 9 bis 16 zeigen DNA-Fingerprints der zwei Mais-DNAs, der mittels SRFA mit TaqI-Primer-4 bzw. den PstI-Primer-1, -2, -3 und -4 erhalten wurden, die Bahn 17 zeigt den Lambda-DNA-Größenmarker, restringiert mit PstI, von dem die Größen von einigen der Fragmente in Nukleotiden rechts angegeben sind, und die Bahnen 18 bis 25 zeigen DNA-Fingerprints der zwei Mais-DNAs, die durch SRFA mit dem TagI-Primer-1 und dem EcoRI-Primer-1, -2, -3 bzw. -4 erhalten wurden.
BEISPIEL 5: SELEKTIVES RESTRIKTIONSFRAGMENT VON BAKTERIELLEN DNAs
Im Beispiel 2, 3 und 4 wird das Prinzip der selektiven Restriktionsfragment (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen für Tomaten-, Salat (Lactuca-Spezien)- bzw. Mais-DNAs beispielhaft dargestellt. In diesem Beispiel wird veranschaulicht, dass diese Technik ebenfalls verwendet werden kann, um bakterielle DNAs zu charakterisieren. Eine Vielzahl von Xanthomonas campestris-Stämmen wurde aus dem Labor für Mikrobiologie in Gent, Belgien, erhalten, um die Brauchbarkeit der Technik bei Bakterien darzulegen.
Isolierung und Modifizierung der DNA

Alle DNAs wurden aus Xanthomonas campestris-Stämmen, die aus einer Vielzahl von Quellen, hauptsächlich infizierten Pflanzen, isoliert worden waren, hergestellt. Diese Stämme, welche von 1 bis 26 durchnummeriert wurden, sind unten aufgelistet, und sie können aus dem Labor für Mikrobiologie in Gent, Belgien, erhalten werden.

DNA	Subspezies	Pathovar	Isolat
1.	albilineans		494
2.	fragariae		708
3.	oryzae	oryzae	5047
4.	oryzae	populi	5743
5.	maltophilia		958
6.	campestris	campestris	568
7.	campestris	alfalfae	497
8.	campestris	coracanae	686
9.	campestris	citri	8655
10.	campestris	citri	9658
11.	campestris	citri	9181
12.	campestris	citri	8657
13.	campestris	citri	8654
14.	campestris	citri	8650
15.	campestris	citri	682
16.	campestris	citri	681
17.	campestris	citri	9325
18.	campestris	citri	9321
19.	campestris	citri	9176
20.	campestris	citri	9671
21.	campestris	citri	9665
22.	campestris	citri	9182
23.	campestris	citri	568
24.	campestris	citri	9167
25.	campestris	citri	9175
26.	campestris	citri	9160

Die DNA dieser bakteriellen Stämme wurde so isoliert, wie es von Mamur (J. Mol. Biol. 3, 208–218) beschrieben worden ist. Die DNAs wurden im Wesentlichen so restringiert, wie es in Beispiel 4 beschrieben worden ist, mit der Ausnahme, dass TaqI und ApaI als Restriktionsenzyme gewählt wurden. Die Ligation von Adaptoren geschah wie im Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung der folgenden Adaptoren:
Amplifizierung von Restriktionsfragmenten
Die Amplifizierung von Restriktionsfragmenten wurde so durchgeführt, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die für die SRFA selektierten Primer waren der TaqI-Primer 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 (mit einem selektiven Nukleotid, das in kleinen Buchstaben angegeben ist) und der ApaI-Primer 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3 (mit einem selektiven Nukleotid, welches als kleiner Buchstabe angegeben ist). Der ApaI-Primer wurde am 5'-Ende zum Nachweis der amplifizierten Fragmente markiert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
Jede der 26 DNAs wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Primersatzes amplifiziert. Amplifikationsbedingungen waren wie im Beispiel 2 beschrieben, außer dass die letzten 9 Zyklen der PCR weggelassen wurden, und zwar auf Grund der niedrigeren Komplexität der DNAs im Vergleich zur Pflanzen-DNA in den Beispielen 2, 3 und 4.
Die DNA-Fingerprints, welche mit den bakteriellen DNAs erhalten worden waren, wie in diesem Beispiel beschrieben, sind in der 17 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 26 repräsentieren die bakteriellen DNAs 1 bis 26. Die Größen der Marker-DNAs (nicht auf dem Gel sichtbar) in Nukleotiden sind auf der rechten Seite des Gels angegeben. Diese Zahlen zeigen deutlich, dass der Verwandtschaftsgrad der bakteriellen Stämme durch die Ähnlichkeit der Bandenmuster reflektiert wird.
BEISPIEL 6: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNGEN VON DNA VON VERSCHIEDENEN TIEREN MIT ZWEI RESTIKTIONSENZYMEN
In den vorhergehenden Beispielen wurde eine selektive Restriktionsfragmentenamplifizierung (SRFA) für Pflanzen-DNA verschiedener Quellen beispielhaft dargelegt. Hier veranschaulichen wir die Effizienz der Prozedur unter Verwendung von zufälligen Proben von DNA, welche von verschiedenen domestizierten Tieren erhalten wurden. Die getesteten Tierspezies sind: Gallus domesticus (Huhn); Susscrofa domestica L. (Schwein); Bos taurus (Kuh); Equus caballus (Pferd). Die verwendeten Restriktionsenzyme sind Sse8387I und MseI.
Isolierung und Modifizierung der DNA
DNAs wurden aus Blutproben isoliert, wobei man Prozeduren nachvollzog, die von Maniatis et al. (1982) beschrieben wurden. Die DNA-Proben 1 bis 3 (Hühnchen), 4 bis 7 (Schwein), 8 bis 11 (Kuh) und 12 bis 15 (Pferd) wurden durch die Restriktionsenzyme Sse8387I und MseI verdaut. Die DNA-Fragmente wurden an Adaptoren ligiert, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist. Da die Restiktionsenzyme Sse8387I und PstI kompatible 3'-Überhänge erzeugen, konnten wir den im Beispiel 2 beschriebenen PstI- und MseI-Adaptor verwenden.
Amplifizierung von Restriktionsfragmenten
Matrizen-DNAs, die oben bezeichnet sind und die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden waren, dienten als Matrizen in SRFA-Reaktionen. Die verwendeten Primerkombinationen bestanden aus einem einzelnen MseI-Primer und unterschiedlichen SseI-Primern:
Die Amplifizierung von Sse837I-MseI-Fragmenten unter Verwendung von oben beschriebenen Primerpaaren wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Protokolls durchgeführt. Reaktionsprodukte wurden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen laufen gelassen, die ebenfalls im Beispiel 2 beschrieben sind. Ein Autoradiograph, der Fingerprints der oben angegebenen Proben zeigte, ist in der 18 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 15 zeigen Fingerprints von den DNAs 1 bis 15, die mit dem MseI-Primer gepaart mit dem Sse8387I-Primer-1 amplifziert wurden, die Bahnen 16 bis 30 zeigen ähnliche Muster, die mit dem MseI-Primer kombiniert mit dem Sse8387I-Primer-2 erhalten wurden. Unterschiede in Fingerprints zwischen Tieren von einer Spezies reflektieren Heterogenität in Tierpopulationen; Gesamtmuster sind charakteristisch für eine spezifische Spezies.
In einer besonderen Ausführung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontrollierten Amplifizierung von mindestens einem Teil einer Ausgangs-DNA, welche eine Vielzahl von Restriktionsstellen für eine bestimmte spezifizierte Restriktionsendonuklease enthält, und von welcher mindestens ein Teil ihrer Nukleinsäuresequenz unbekannt ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Verdau der Ausgangs-DNA mit der spezifischen Restruktionsendonuklease, um sie in die entsprechende Serie von Restriktionsfragmenten zu fragmentieren, welche jeweils 5'-Enden und 3'-Enden umfassen;
(b) Wenn nicht die 5'- und 3'-Adaptoren, die nachfolgend definiert sind, bereits in separaten Formen vorliegen, ebenfalls Verdau mit der spezifischen Endonuklease eines bestimmten doppelsträngigen Oligonukleotidlinkers, der selbst eine einzelne Stelle innerhalb seiner eigenen Nukleotidsequenz für die spezifische Endonuklease einschließt, um dadurch den Linker in solchen 5'- bzw. 3'-Adaptoren zu spalten;
(c) Ligieren der aus der Ausgangs-DNA erhaltenen Restriktionsfragemente an ihren 5'- und 3'-Enden mit den 3'- bzw. 5'-Adaptoren, um dadurch mit einem „Tag" versehene Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA herzustellen, wobei die Fragmente dann an ihren jeweiligen 5'- und 3'-Enden „Tags" umfassen, deren Nukleotidsequenzen dann jene der 3'- und 5'-Adaptoren umfassen, einschließlich der in der spezifischen Restriktionsstelle involvierten Nukleotide;
(d) Wenn nicht, sofern angemessen zur Bereitstellung von geeigneten Matrizen für Primer, die 5'- und 3'-Adaptoren vor der vorausgehenden Ligation durch Hinzusetzen von Oligonukleotidsegmenten von bestimmten konstanten Sequenzen an ihren jeweiligen 5'- und 3'-Enden verlängert wurden, Verlängern, sofern für den gleichen Zweck angemessen, der entsprechenden Enden der mit einem „Tag" versehenen Restriktionsfragmente mit den Oligonukleotidsegmenten, wodurch mit einem „Tag" versehe ne Restriktionsfragmente erhalten werden, die an beiden Enden mit den konstanten Segmenten verlängert sind;
(e) Kontaktieren der mit einem „Tag" versehenen oder, sofern angemessen, verlängerten Restriktionsfragmente unter Hybridierungsbedingungen mit zwei Oligonukleotidprimern;
(f) Wobei die Primer Sequenzen mit der gleichen Nukleotidsequenz wie die terminalen Teile der Stränge der 5'- und 3'-Enden der mit einem „Tag" versehenen oder, sofern angemessen, verlängerten Restriktionsfragmente einschließen, welche selbst komplementär zu den Strängen sind, die als Matrizen für die Primer wirken, wobei die Primer jeweils die Nukleotide einschließen, welche zu denen komplementär sind, die in der Bildung der Stelle für die bestimmte spezifische Endonuklease in dem Matrizenstrang involviert ist;
(g) Amplifizieren der verlängerten Restriktionsfragmente, die mit den Primern hybridisiert sind, durch PCR oder ähnliche Techniken in Gegenwart der erforderlichen Nukleotide und Polymerase, um eine weitere Verlängerung der hybridisierten Primer entlang jenen Restriktionsfragmenten der Ausgangs-DNA zu verursachen, an welche die Primer anfänglich an ihrer gesammten Länge hybridisierten, und
(h) Identifizieren oder Gewinnen der zuletzt erwähnten Restriktionsfragmente.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens entspricht das terminale Nukleotid von mindestens einem der Primer in Richtung der angedachten Verlängerung dem letzten der Nukleotide, die in der Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease involviert sind, und wobei das Verfahren das Identifizieren und Gewinnen der Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA, welche amplifiziert worden ist, umfasst.
In einer anderen besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens schließt mindestens einer der Primer eine ausgewählte Sequenz ein, welche eine bestimmte Anzahl (ein oder mehrere Nukleotide) umfasst, die sich jenseits des letzten der Nukleotide erstrecken, die in der Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease in Richtung ihrer eigenen Verlängerung innerhalb der entsprechenden Restriktionsfragmente involviert sind, und zwar während des Amplifizierungsschrittes.
In einer spezifischen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens enthält der doppelsträngige DNA-Linker mehrere Stellen für unterschiedliche spezifische Endonukleasen, welche sich alle voneinander unterscheiden, wobei die Verfahren das Wiederholen der Schritte des oben definierten Verfahrens bei der gleichen Ausgangs-DNA mit einem dieser Restriktionsendonukleasen, jedoch mit einer anderen der distinkten spezifischen Endonukleasen umfasst, und unter Verwendung von Primern, deren Nukleotidsequenzen gewählt werden, wie es in der obigen Beschreibung definiert ist, jedoch in Bezug zu der anderen spezifischen Endonuklease.
Das oben beschriebene Verfahren oder von dem Oligonukleotid der Erfindung ist geeignet für die Identifizierung von Polymorphismen in bestimmten DNAs, die ihren Ursprung in den gleichen lebenden Spezies haben, z. B. genomischen DNAs von Mikroben, Pflanzen oder einem Tier, einschließlich Menschen, oder von Fragmenten davon, entweder untereinander oder in Bezug zu einem entsprechenden bestimmten DNA-Standard, wobei die Verwendung das Unterziehen der in der Untersuchung befindlichen DNAs dem Verfahren oder dem Kontakt des Oligonukleotids bei Bedingungen, die eine Amplifikations- oder Verlängerungsreaktion ermöglichen, das Vergleichen der Restriktionsmuster, die ausgehend von jeder der DNAs und, gegebenenfalls der Standard-DNA erhalten werden, und in Bezug setzen der Existenz und, wo angemessen, der Lokalisation von dem DNA-Polymorphismus zu den zwischen den Größen der Restriktionsfragmente der unterschiedlichen DNAs festgestellten Unterschiede.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine fragmentierte DNA, deren unterschiedliche Fragmente Sequenzen besitzen, welche alle anfänglichen Verdaus der unfragmentierten Ausgangs-DNA entsprechen, von der sie erzeugt wurden mit einer gleichen bestimmten spezifischen Endonuklease, dadurch gekennzeichnet, dass alle der Fragmente an ihrem 5'- bzw. 3'-Ende mit einem „Tag" versehen waren, und zwar durch bestimmte 3'- und 5'-Adaptoren, die dem gespaltenen Teil eines gleichen Ausgangs-DNA-Linkers entsprachen, welcher anfänglich eine einzelne Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease einschloss, und gegebenenfalls verlängert mit bestimmten konstanten Sequenzen. Die fragmentierte DNA kann in Form eines Musters von Migrationsbanden auf einem geeigneten Träger, z. B. Gelträger, vorliegen, in dem erreicht worden war, dass ihre Fragmente anfänglich unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes wandern.
Die fragmentierte DNA kann ebenfalls Endbereiche umfassen, einschließlich Oligonukleotid, gekennzeichnet durch die folgende Zusammensetzung, ausgehend von dem 5'-Ende:

(i) Eine Nukleotidsequenz (konstante Sequenz) von mindestens 10 Basen, jedoch nicht länger als 30 Basen, komplementär zu einer bestimmten DNA Sequenz, die als Adaptor verwendet wird, direkt gefolgt von;
(ii) einer Nukleotidsequenz, die zu der Zielstelle einer im Schritt (a) verwendeten spezifischen Restriktionsendonuklease komplementär ist, insofern als das die Nukleotidsequenz oder ein Teil davon nicht in (ii) beinhaltet ist, direkt gefolgt von:
(iii) einer gewählten Nukleotidsequenz von mindestens einem Nukleotid, jedoch kürzer als 10 Nukleotiden, z. B. welche 1 bis 5 Nukleotide lang ist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Kit für die Fragmentierung von bestimmten DNAs durch mindestens eine spezifische Restriktionsendonuklease zu Fragmenten und die Analyse dieser Fragmente, was folgendes umfasst:

– Die spezifische Restriktionsendonuklease;
– Einen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Linker, welcher selbst eine einzelne Stelle innerhalb seiner eigenen Nukleotidsequenz für die spezifische Endonuklease einschließt, um dadurch den Linker in entsprechende 5'- bzw. 3'-Adaptoren zu spalten, wobei der doppelsträngige DNA-Linker eine ausreichende Größe hatte, um 5'- und 3'-Teile bereitzustellen, welche später Matrizen für die PCR-Primer dieses Kids vorsehen können;
– PCR-Primer, welche jeweils auf der anderen Seite die gleichen Sequenzen wie die Stränge der 5'- und 3'-Adaptoren umfassen, komplementär zu den Strängen, die anschließend als Matrizen für die Primer wirken, wobei die Primer ferner die Nukleotide einschließen, welche komplementär zu jenen sind, welche in der Bildung der Stelle für die bestimmte spezifische Restriktionsendouklease in den Matrizensträngen involviert sind;
– Sofern angemessen, Oligonukleotidsegmente von bestimmten (konstanten) Sequenzen zur Erzeugung von Stellen mit ausreichender Länge zur Hybridisierung mit den Primern, für die Verlängerung der 5'-Enden der 5'-Adaptoren oder der 3'-Enden der 3'-Adaptoren oder beiden, und zwar vor dem Verdau des Linkers durch die spezifische Restriktionsendonuklease, um die 5'- bzw. 3'-Adaptoren zu erzeugen, oder alternativ für die Verlängerung der erhaltenen mit „Tags" versehenen Fragmenten im Anschluss an die Ligation der 5'- und 3'-Adaptoren an den Enden der Fragmente der Ausgangs-DNA;
– Gegebenenfalls ein fragmentierter DNA-Standard, welcher der bestimmten DNA, die eine Fragmentierungsuntersuchung erfährt, entspricht, wobei die Fragmente des DNA-Standards erhalten wurden, indem sie mit der spezifischen Endonuklease verdaut wurden.

Eine besondere Ausführungsform dieses Kits ist dergestalt, dass die Oligonukleotidsegmente die Verlängerung von beiden der 5'- und 3'-Adaptoren oder der 5'- und 3'-Enden der mit „Tags" zu versehenen DNA-Fragmente identische Nukleotidsequenzen besitzen.
In einer anderen Ausführungsform enthält der Linker des Kits mehrere jeweilige einzigartige Stellen für spezifische Endonukleasen, welche alle unterschiedlich voneinander sind, wobei das Kit ferner Primer einschließt, welche zu jedem der 3'- und 5'-Adaptoren entsprechend sind, gebildet durch die Spaltung des Linkers mit den unterschiedlichen spezifischen Endonukleasen, wobei die Primer jeweils wie im Anspruch 8 definiert sind, und zwar im Bezug auf die 3'- und 5'-Adaptoren, welche in dem Linker durch die Spaltung davon durch jede der spezifischen Endonukleasen erzeugt werden.
Ebenfalls kann das Kit in einer besonderen Ausführungsform fragmentierte DNA-Standards, wie oben definiert, in Bezug auf die entsprechenden spezifischen Restriktionsendonukleasen, umfassen, wobei jeder der fragmentierten DNA-Standards sich in Bezug zu jedem der bestimmten spezifischen Restriktionsenzyme befindet.

Claims

Kit, welches zur selektiven Amplifikation einer zufälligen Teilmenge von Restriktionsfragmenten, die aus einer Ziel-DNA unter Verwendung von mindestens einer Restriktionsendonuklease erhalten wurden, geeignet ist, wobei das Kit folgendes umfasst: – mindestens ein doppelsträngiges synthetisches Oligonukleotid, das "Adaptor" bzw. „DNA-Linker" genannt wird, wobei ein Ende des DNA-Linkers so entworfen ist, dass es an ein oder an beide Enden der Restriktionsfragmente legiert werden kann, die mit der bzw. den Restriktionsendonuklease(n) erzeugt wurden, wobei das andere Ende des DNA-Linkers so entworfen ist, dass es nicht an das Restriktionsfragment legiert werden kann; – mindestens einen Oligonukleotidprimer, der die folgende Struktur umfasst: 5'-Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der DNA-Linker-Sequenz komplementär ist – Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der Restriktionsstelle der Restriktionsendonuklease komplementär ist – selektive Nukleotidsequenz-3', wobei die selektive Nukleotidsequenz aus 1 bis 10 selektiven Nukleotid(en) besteht, welche(s) die Selektion einer zufälligen Teilmenge der Restriktionsfragmente, die aus der Ziel-DNA erhalten wurden, zur selektiven Amplifikation erlaubt.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Primer 10 bis 50 Nukleotide umfasst, und wobei die Zielsequenz der Restriktionsendonuklease 4 bis 8 Nukleotide umfasst.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Sequenz des Primers, welcher aus der Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der DNA-Linker-Sequenz komplementär ist, und der Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der Restriktionsstelle der Restriktionsendonuklease komplementär ist, aufgebaut ist, 10 bis 30 Nukleotide umfasst.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Primer 1, 2 oder 3 selektive Nukleotid(e) umfasst, welche(s) die Selektion einer zufälligen Teilmenge von Restriktionsfragmenten aus der Ziel-DNA zur selektiven Amplifikation erlaubt.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Primer markiert ist.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, welches mindestens zwei Primer mit einer unterschiedlichen Nukleotidsequenz umfasst.
Kit gemäß Anspruch 6, wobei die selektive Nukleotidsequenz, welche die Selektion einer zufälligen Teilmenge von DNA-Fragmenten von der Ziel-DNA zur selektiven Amplifikation ermöglicht, sich für jeden der mindestens zwei Primer unterscheidet.
Kit gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei in dem Primer die Nukleotidsequenz, welche aus der Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu mindestens einem Teil der DNA-Linker-Sequenz, welche gebunden ist an ein oder an beide Enden des Restriktionsfragmentes, und der Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der Restriktionsstelle von der Restriktionsendonuklease komplementär ist, aufgebaut ist, sich für jeden der mindestens zwei Primer unterscheidet.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der DNA-Linker in solch einer Weise entworfen ist, dass die Restriktionsstelle des Restriktionsfragmentes nicht restauriert wird nach der Ligasierung des DNA-Linkers an ein von beiden Enden des Restriktionsfragmentes.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, welches mindestens zwei DNA-Linker mit einer unterschiedlichen Nukleotidsequenz umfasst.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, welcher ferner die spezifische(n) Restriktionsendonuklease(n) umfasst.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, welches ferner DNA-Polymerase, insbesondere Taq-Polymerase und/oder dNTP's, und/oder Pufferlösungen enthält.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 zur genetischen Analyse, z. B. für die forensische Typisierung beim Menschen.
Kit gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12 zur genetischen Analyse, z. B. zum Detektieren der Vererbung von bestimmten Merkmalen bei Tieren oder von agronomischen Merkmalen bei Pflanzen.
Verwendung eines Kits gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14 zur selektiven Amplifikation einer zufälligen Teilmenge von Restriktionsfragmenten, die durch Verdau einer Ziel-DNA mit mindestens einer Restriktionsendonuklease erhalten wurden.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der bzw. die DNA-Linker und der bzw. die Oligonukleotidprimer unter den folgenden Gruppen (i) bis (vii) gewählt werden: