JP5452021B2 - ハイスループットaflp系多型検出法 - Google Patents
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Description
1)内部配列に位置する多型は、殆どの(又は全ての)増幅された断片中に検出される。これによりPC毎のマーカー数がかなり増大する。
本発明によれば、複数のサンプルにおける1つ又は複数の遺伝子マーカーのハイスループットでの発見、検出及び遺伝子型決定のための方法であって、
(a)複数のサンプルに由来するDNAを提供する工程と、
(b)前記DNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を製造する、制限工程と、
(c)前記制限断片を加熱して、120bpよりも小さな制限断片を選択的に分離する加熱工程と、
(d)各サンプルに対して少なくとも一つのアダプターが夫々異なる識別子タグを付けられ、前記制限断片にアダプターをライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を製造する、ライゲーション工程と、
(e)前記タグ付けされたアダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、該プライマーのうち少なくとも1つが、前記アダプターの少なくとも一つの部分に相補的であり、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたライブラリーを製造する、増幅工程と、
(f)複数のサンプルから誘導された前記ライブラリーをプールするプーリング工程と、
(g)ハイスループットシークエンシング技術を使用して、前記ライブラリーをシークエンシングする工程と、
(h)前記ライブラリー間を区別するための前記タグを使用して、前記ライブラリー内又は前記ライブラリー間で遺伝子マーカーとして配列多型を同定する工程と、
(i)前記複数のライブラリーにおいて前記遺伝子マーカーの(共)優性遺伝子型をもとめる工程を含むことを特徴とする方法が得られる。
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
(a)核酸、特にDNA又はcDNAを1つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより対応する一連の制限断片へとDNAを断片化する、消化する工程と、
(b)このように得られた制限断片を、一末端が制限断片の一末端又は両末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションし、それによりアダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)開始DNAの制限断片を生成する、ライゲーションする工程と、
(c)アダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)制限断片を、ハイブリダイズする条件下で、その3’−末端で選択ヌクレオチドを含む1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
(d)プライマーとハイブリダイズされたアダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)制限断片を、プライマーがハイブリダイズする開始DNAの制限断片に沿ってハイブリダイズされたプライマーのさらなる伸長を引き起こすように、PCR又は同様の技術によって増幅する工程と、
(e)このように得られた増幅又は伸長したDNA断片を、検出、同定、又は回収する工程とを含む。
(水溶液)又は32℃(ホルムアミド溶液)未満のTmとなる場合、より高温を使用し得るようにSSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対しての広範な指針は、Tijssen著「生化学及び分子生物学における実験技法−核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridisation with Nucleic Acid Probes)」、第1部、第2章「ハイブリダイゼーション原理の概要と核酸プローブ分析の戦略(Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid probe assays)」、Elsevier, N. Y. (1993)、及び「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、第2章、Ausubel他編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)に見出される。
(a)1つ又は複数のサンプルに由来するDNAを提供する工程と、
(b)DNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を生成する、制限工程と、
(c)アダプターに制限断片をライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を生成する、ライゲーション工程と、
(d)任意選択で、アダプターにライゲーションされた制限断片を少なくともアダプターと相補的なプライマー対を用いて増幅させ、それにより前増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片を生成する、増幅工程と、
(e)(任意選択で前増幅された)アダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、プライマーのうち少なくとも1つがプライマーの5’末端に識別子タグを含有し、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたサブセットのライブラリーを生成する、増幅工程と、
(f)任意選択で、複数のサンプルに由来するライブラリーをプーリングする工程と、
(g)ハイスループットシークエンシング技術を使用して、ライブラリーをシークエンシングする工程と、
(h)識別子タグを使用して、ライブラリー毎に配列をクラスタリングする工程と、
(i)ライブラリー内部、ライブラリー間の少なくとも一方でクラスタリングされた配列を比較することによって遺伝子マーカーを同定する(identify)工程と、
(j)好ましくは全てのサンプル及び全ての同定されたマーカーについて、1つ又は複数のライブラリーにおいて遺伝子マーカーの(共)優性遺伝子型を決定する工程を含む方法に関する。
(1)シークエンシングアダプターにライゲーションされた断片をビーズにアニーリングする(各ビーズは単一の断片とアニーリングする)工程と、
(2)ビーズを油中水滴型マイクロリアクター内で乳化させる(各油中水滴型マイクロリアクターは単一のビーズを含む)工程と、
(3)エマルジョンPCRを実施し、それによりビーズの表面上でアダプターにライゲーションされた断片を増幅させる、実施工程と、
(4)増幅されたアダプターにライゲーションされた断片を含有するビーズを選択/濃縮する工程と、
(5)ビーズをウェルに充填する(各ウェルは単一のビーズを含む)工程と、
(6)ピロリン酸シグナルを生成する工程を含む。
方法を以下のように例示する:
1)AFLP鋳型は、制限工程とライゲーション工程との間に80℃で20分間の熱変性工程を含む、Vos他のプロトコルの変更形態により調製される。80℃で20分間のインキュベーション後、制限酵素消化物は室温に冷却され、DNAリガーゼが添加される。変性工程により、アダプターが末端にライゲーションしないように120bpまでの制限断片の相補的な鎖が解離する。結果として、120bpよりも小さい断片は増幅されないので、サイズ選択が達成される。
A)AFLPマーカー:これらはサンプル中に観察されるものもあれば、存在しないものもある配列である。
これは、遺伝子マーカーの最も興味深い(そして豊かな)カテゴリーである。本質は定常AFLP断片の内部配列に含有されるSNPマーカーが共優性SNPマーカーとしてスコアリングされることである。また、好ましくは、これは統計的閾値レベルを対立遺伝子の有無の正確な呼び出しに適用することを必要とする。断片ライブラリーの10倍のシークエンシング重複は十分であると予想されるが、各対立遺伝子配列の観察数に応じたSNPマーカー遺伝子型の精度の決定に統計的解析法が必要とされる。理論的根拠は、定常バンドがSNPを含有し、1つの対立遺伝子が例えば5回観察される一方、他の対立遺伝子(を含有する配列)が観察されない場合、サンプルは観察される対立遺伝子に対してホモ接合である可能性が非常に高いことである。結果的に、両対立遺伝子が観察される場合、その頻度とは無関係に、サンプルはSNPマーカーに対してヘテロ接合とスコアリングされる。
P(correct)=P(aa)+P(AA)+P(Aa)×[1−0.5n−1]
(式中、P(aa)は、遺伝子型aaを有する集団の分画である(同封のグラフ内、図9、0.25に設定)。P(AA)は遺伝子型AAを有する集団の分画である(0.25に設定)。P(Aa)は遺伝子型Aaを有する集団の分画である(図6及び下表、0.5に設定)。nは個体数に等しい。
コショウ系統PSP−11及びPI201234由来のDNAが、AFLP鍵遺伝子認識部位特異的プライマーを用いてAFLP産物を生成するために使用された(これらのAFLPプライマーは、例えば、特許文献1に記載の従来のAFLPプライマーと本質的に同一であり、概して認識部位領域、定常領域、及び選択領域における1つ又は複数の選択ヌクレオチドを含有する。)。
PSP−11の前増幅に用いられるプライマーセットI
制限混合物(40ul/サンプル)
DNA 6μl(±300ng)
ECoRI(5U) 0.1μl
MseI(2U) 0.05μl
5×RL 8μl
MQ 25.85μl
合計(Totaal) 40μl
37℃における1時間のインキュベーション
ライゲーション混合物(10μl/サンプル)
10mM ATP 1μl
T4 DNAリガーゼ 1μl
ECoRIアダプター(5pmol/μl) 1μl
MseIアダプター(50pmol/μl) 1μl
5×RL 2μl
MQ 4μl
合計 10μl
の添加
37℃における3時間のインキュベーション
EcoRIアダプター
前増幅(A/C):
RL混合物(10×) 5μl
EcoRIプライマー E01L(50ng/ul) 0.6μl
MseIプライマー M02K(50ng/ul) 0.6μl
dNTP(25mM) 0.16μl
Taqポリメラーゼ(5U) 0.08μl
10×PCR 2.0μl
MQ 11.56μl
1反応につき合計20μl
前増幅の温度プロファイル
選択的な前増幅を50μlの反応容量中で行なった。PCRをPE GeneAmp PCRシステム9700で行ない、20サイクルのプロファイルは、94℃30秒間の変性工程で開始した後、56℃、60秒間のアニーリング工程、及び72℃、60秒間の伸長工程を行なった。
PA+1/+1混合物(20×) :5μl
EcoRIプライマー :1.5μl
MseIプライマー :1.5μl
dNTP(25mM) :0.4μl
Taqポリメラーゼ(5U) :0.2μl
10×PCR :5μl
MQ :36.3μl
合計 :50μl
選択的な前増幅を50μlの反応容量中で行なった。PCRをPE GeneAmp PCRシステム9700で行ない、30サイクルのプロファイルは、94℃30秒間の変性工程で開始した後、56℃60秒間のアニーリング工程、及び72℃60秒間の伸長工程を行なった。
サンプルPSP11 :E01LKRS1/M15KKRS1
サンプルPI120234 :E01LKRS2/M15KKRS2
選択的な前増幅を20μlの反応容量中で行なった。PCRをPE GeneAmp PCRシステム9700で行なった。13サイクルのプロファイルは、94℃、30秒間の変性工程で開始した後、アニーリング温度が各々のサイクルにおいて0.7℃低下するタッチダウンフェーズを伴う、65℃、30秒間のアニーリング工程、及び72℃、60秒間の伸長工程を行なった。このプロファイルの後で、94℃、30秒間の変性工程、56℃、30秒間のアニーリング工程、及び72℃、60秒間の伸長工程を伴う、23サイクルのプロファイルを行なった。
EcoRI+3(AAC)及びMseI+3(CAG)
QIAquick(登録商標)スピンハンドブック(07/2002)第18頁に従って、AFLP産物をQIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。濃度はNanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計を用いて測定した。+1/+2 PSP−11 AFLP産物5μg及び+1/+2 PI201234 AFLP産物5μgの全てを共に投入し、TE 23.3μlに溶解した。最終的に、+1/+2 AFLP産物の濃度430ng/μlでの混合物を得た。
両コショウ系統からの混合増幅産物を、Margulies他によって説明されるような、454 Life Sciencesシークエンシング技術を用いて、ハイスループットシークエンシングした(Margulies他, Nature 437, pp. 376-380及びオンライン上の補足)。具体的には、Margulies及び共同研究者等によって説明されるように、エマルジョンPCR増幅及び続く断片シークエンシングを促進するために、AFLP PCR産物を最初に末端を平滑にし、続いてアダプターにライゲーションした。454のアダプター配列、エマルジョンPCRプライマー、配列プライマー及び配列の実行条件は、全てMargulies及び共同研究者等によって記載されるものであった。図1Aに例示されるように、454シークエンシング過程におけるセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョン−PCR断片中の機能要素の直線的な順序は、以下のとおりだった:
454PCRアダプター−454シークエンスアダプター−4bp AFLPプライマータグ1−選択ヌクレオチド(複数可)を含むAFLPプライマー配列1−AFLP断片内部配列−選択ヌクレオチド(複数可)を含むAFLPプライマー配列2、4bp AFLPプライマータグ2−454シークエンスアダプター−454PCRアダプター−セファロースビーズ
2つのハイスループット454シークエンスの実行は、454 Life Sciences(アメリカ合衆国コネチカット州ブランフォード)によって行なわれた。
1回の454シークエンスの実行に由来する配列データを、バイオインフォマティクスパイプライン(Keygene N.V.)を用いて処理した。具体的には、未処理の454ベースコールされた配列読み取りを、FASTAフォーマットで変換し、BLASTアルゴリズムを用いて、タグ付けされたAFLPアダプター配列の存在を検査した。既知のタグ付けされたAFLPプライマー配列への高い信頼性の一致に際して、配列をトリミングし、制限エンドヌクレアーゼ部位を回復し、適切なタグを割り当てた(それぞれ、サンプル1 EcoRI(ES1)、サンプル1 MseI(MS1)、サンプル2 EcoRI(ES2)、又はサンプル2 MseI(MS2))。次に、33塩基よりも長いトリミングされた配列の全てを、全体の配列相同性に基づくmegaBLAST手順を用いてクラスタリングした。次に、クラスターを、CAP3の多重アライメントアルゴリズムを用いて、1つのクラスター当たり1つ又は複数のコンティグ、シングルトンの少なくとも一方へアセンブリーした。1つ以上の配列を含むコンティグでは、推定上の多型を表わす配列ミスマッチを検査した。配列ミスマッチには、以下の基準に基づく品質スコアを割り当てた:
*コンティグ中の読み取りの数
*観察された対立遺伝子の分布
上の2つの基準は、各々の推定上のSNP/インデルに対応する、いわゆるQスコアのための根拠を成す。
両対立遺伝子が少なくとも2度観察された場合にのみ、Qスコア0.3が達成される。
(調整可能、3塩基以上のホモポリマーに位置する多型を回避するための初期設定)
*クラスター中のコンティグの数。
(調整可能、フランキング配列を調べる或る特定の型の遺伝子型決定分析にとって重要)
*サンプル1又はサンプル2で観察された対立遺伝子の関連のレベル;
推定上の多型並びにサンプル1及びサンプル2の対立遺伝子間で一貫して完全な関連が存在する場合には、多型(SNP)が推定上の「エリート」多型(SNP)として示される。エリート多型は、2つのホモ接合系統が発見過程で用いられた場合に、一意のゲノム配列又は低コピーのゲノム配列に位置する確率が高いと考えられる。反対に、サンプル起源との多型の弱い関連は、コンティグ中の非対立遺伝子配列のアライメントから生じる誤った多型を発見してしまうリスクが高い。
トウモロコシ系統のB73及びM017に由来するDNAを、AFLPの鍵遺伝子認識部位特異的プライマーの使用により、AFLP産物を生成するために用いた。(これらのAFLPプライマーは本質的に従来のAFLPプライマーと同じであり(例えば、特許文献1欧州特許第0534858号に記載されている)、認識部位領域、定常領域、及びその3’末端において1つ又は複数の選択なヌクレオチドを通常含むだろう。)。
本明細書において以前に記載されたように調製されたコショウ及びトウモロコシのAFLP断片サンプルは、以下に記載されるような454 Life Sciencesにより処理された(Margulies他, 2005「微細加工高密度ピコリッターリアクター中のゲノムシークエンシング(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors)」Nature 437 (7057) :376-80. Epub July 31, 2005)。
処理パイプライン:
入力データ
未処理配列データが各々の実行に対して受け取られた:
−200000〜400000の読み取り
−ベースコール(塩基呼び出し)品質スコア
トリミング及びタグ付け
これらの配列データを、読み取りの始め及び末端で、鍵遺伝子認識部位(KRS)の存在について解析する。これらのKRS配列はAFLPアダプター及びサンプルラベル配列の両方から成り、或る特定のサンプルの或る特定のAFLPプライマーの組合せに対して特異的である。KRS配列は、BLASTによって同定そしてトリミングされ、制限部位が回復される。読み取りは、KRS起源の同定のためのタグでマークされる。トリミングされた配列は、その後の処理を行なうために、長さ(最低33ヌクレオチド)で選択される。
MegaBlast解析は、相同配列のクラスターを得るために全てのサイズ選択、且つトリミングされた読み取りで行なわれる。引き続いて全てのクラスターは、アセンブリーされたコンティグをもたらすために、CAP3によりアセンブリーされる。両工程からの、他の読み取りと一致しない一意の配列の読み取りが同定される。これらの読み取りはシングルトンとしてマークされる。本明細書において以前に記述された工程を行なう処理パイプラインを図4の(A)に示す。
アセンブリー解析からの最終的なコンティグは、多型検出の根拠を成す。各々のクラスターのアライメントにおける各々の「ミスマッチ」は、可能性のある多型である。選択基準を、品質スコアを得るために定義する:
−1つのコンティグ当たりの読み取りの数
−1つのサンプル当たりの「対立遺伝子」の頻度
−ホモポリマー配列の発生
−近接多型の発生
閾値を超えた品質スコアにより、SNP及びインデルは、推定上の多型として同定される。SSR抽出については、MISA(MIcroSAtellite同定)ツール(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)を用いる。このツールはジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド及び化合物SSRモチーフをあらかじめ定められた基準により同定し、これらのSSRの発生を要約する。多型検索過程及び品質割当過程を図4の(B)に示す。
下記の表は、組み合わせたコショウのサンプルについて2回の454シークエンシングの実行、及び組み合わせたトウモロコシサンプルについて2回の実行から得られた配列を組み合わせた解析の結果を要約する。
実施例1において同定された推定上のA/G SNPを検証するために、このSNPのためのタグ付き配列部位(STS)解析を、隣接するPCRプライマーを用いて設計した。PCRプライマー配列は以下のとおりであった:
1つのPCR反応に対して、下記成分を混合した:
5μl 1/10に希釈したAFLP混合物(app.10ng/μl)
5μl 1pmol/μlプライマー 1.2f(500μMストックから直接希釈したもの)
5μl 1pmol/μlプライマー 1.2r(500μMストックから直接希釈したもの)
5μl PCR混合物 2μl 10×PCR緩衝液
1μl 5mM dNTP
1.5μl 25mM MgCl2
0.5μl H2O
5μl 酵素混合物 0.5μl 10×PCR緩衝液(Applied Biosystems)
0.1μl 5U/μl AmpliTaq DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)
4.4μl H2O
以下のPCRプロファイル:
サイクル1 2分間、94℃
サイクル2〜サイクル34 20秒間、94℃
30秒間、56℃
2分30秒間、72℃
サイクル35 7分間、72℃
∞、4℃
を使用した。
PSP11(配列1):(5’−3’)
Claims (18)
- 複数のサンプルにおける1つ又は複数の遺伝子マーカーのハイスループットでの発見、検出及び遺伝子型決定のための方法であって、
(a)複数のサンプルに由来するDNAを提供する工程と、
(b)前記DNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限し、それにより制限断片を製造する、制限工程と、
(c)前記制限断片を加熱して、120bpよりも小さな制限断片を選択的に分離する加熱工程と、
(d)各サンプルに対して少なくとも一つのアダプターが夫々異なる識別子タグを付けられ、前記制限断片にアダプターをライゲーションし、それによりアダプターにライゲーションされた制限断片を製造する、ライゲーション工程と、
(e)前記タグ付けされたアダプターにライゲーションされた制限断片をプライマー対を用いて増幅させる工程であって、該プライマーのうち少なくとも1つが、前記アダプターの少なくとも一つの部分に相補的であり、それにより各サンプルに対して、アダプターにライゲーションされた制限断片の、タグ付けされた増幅されたライブラリーを製造する、増幅工程と、
(f)複数のサンプルから誘導された前記ライブラリーをプールするプーリング工程と、
(g)ハイスループットシークエンシング技術を使用して、前記ライブラリーをシークエンシングする工程と、
(h)前記ライブラリー間を区別するための前記タグを使用して、前記ライブラリー内又は前記ライブラリー間で遺伝子マーカーとして配列多型を同定する工程と、
(i)前記複数のライブラリーにおいて前記遺伝子マーカーの(共)優性遺伝子型をもとめる工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記遺伝子マーカーがAFLPマーカー又はSNPマーカーであることを特徴とする方法。
- 請求項1又は2に記載の方法において、前記シークエンシングが合成によるシークエンシングに基づくことを特徴する方法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法において、前記シークエンシングが固体支持体上で実施されることを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法において、
前記シークエンシングが、
増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片をビーズにアニーリングするとともに、各ビーズは単一のアダプターにライゲーションされた断片とアニーリングする工程と、
前記ビーズを、各々が単一のビーズを含む油中水滴型マイクロリアクター内で乳化させる工程と、
エマルジョンPCRを実施し、それにより前記ビーズの表面上で前記アダプターにライゲーションされた制限断片を増幅させる、実施工程と、
前記ビーズを、夫々が単一のビーズを含むように、ウェルに充填する工程と、
ピロリン酸シグナルを生成する工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法において、
前記タグ付けされ増幅されたアダプターにライゲーションされた制限断片の平均重複が少なくとも6であることを特徴とする方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法において、
各アダプターにライゲーションされた制限断片の配列が少なくとも6倍測定されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法において、
エンドヌクレアーゼ制限とアダプターライゲーションとの間でサイズ選択が変性工程によって実施されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法において、
前記DNAがゲノムDNA、RNA、cDNA、BAC、YAC、全ゲノム増幅DNA、PCR産物から成る群から選択されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法において、
前記アダプターが、前記制限断片の一端又は両端と適合性がある一端を有する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターであることを特徴とする方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法において、
前記DNAが2つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて制限されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法において、
前記DNAが2つの制限エンドヌクレアーゼを用いて制限されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法において、
前記制限エンドヌクレアーゼのうち少なくとも1つがレアカッターであることを特徴とする方法。 - 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法において、
前記制限エンドヌクレアーゼのうち少なくとも1つがフリークエントカッターであることを特徴とする方法。 - 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法において、
前記プライマーが1〜10の選択ヌクレオチドを含有することを特徴とする方法。 - 請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法において、
前記DNAが3つ以上の制限エンドヌクレアーゼの組合せを使用して制限されることを特徴とする方法。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法の使用であって、
AFLPマーカー配列、SNPマーカー配列の少なくとも一方の共優性スコアリングのためであることを特徴とする使用。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法における、多型検出のためのハイスループットシークエンシング方法を使用して、遺伝子マッピング、QTLマッピング、遺伝子/形質の精細マッピング、連鎖不平衡(LD)マッピング、マーカー利用戻し交配、遺伝距離解析、形質又は表現型と繋がりのあるマーカーの発見、親サンプルの診断用遺伝子型決定を含む遺伝子型の決定をすることを特徴とする使用。
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