CN102864498B

CN102864498B - 一种长片段末端文库的构建方法

Info

Publication number: CN102864498B
Application number: CN201210357019.2A
Authority: CN
Inventors: 陈祖耕; 姜楠; 王萍; 暴云娟; 刘桂友; 陈晓云
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-09-24
Also published as: CN102864498A

Abstract

本发明涉及一种长片段末端文库的构建方法，包括：1）DNA随机打断、末端缺口补齐修复；2）制成A-Fragment步骤；3）将A-Fragment与LMP Adaptor进行粘性末端的连接；4）将LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化；5）将获得的酶消化文库中的片段再次进行环化；6）将纯化后的环状分子用LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。本发明的建库方法，只需要合成两条63 bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。

Description

一种长片段末端文库的构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学测序技术领域，具体涉及一种长片段末端文库（Long Mate Pair，LMP）的构建方法，以及该方法在基因组序列拼接，特别是 de novo 测序与组装中的有效应用。

背景技术

目前，二代测序方法已广泛的应用于基因组de novo拼接中，由于测序数据巨大且测序长度短，影响拼接质量的关键因素是基因组的重复序列（如微卫星序列，核糖体RNA序列，转座子序列等），重复单元的长度在几bp到几kb不等。构建多种不同长度插入片段的文库进行测序，可以跨越不同长度的重复序列，有效地改善基因组的拼接完整性和准确性。LMP基于基因组中较大跨度（2~10kb）片段两端序列的测序，解决大基因组和复杂基因组的组装问题，纠正重复序列造成的拼接错误，并能够发现基因组的结构变异，特别适用于新基因组测序（Denovo sequencing）。目前，几种(long mate pair文库构建的方法存在效率较低，实验过程复杂，不易控制，错误率较高，嵌合分子以及低文库复杂性等缺点。因此，简单有效的LMP方法对于新一代测序技术的发展与应用具有重要作用，但是目前仍然处于改善与探索的过程中。

发明内容

本发明的目的是提供一种长片段末端文库构建的方法，可以有效的减少文库构建的步骤，缩短文库构建的时间，提高文库构建的效率，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，其步骤如下：

1）首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；

2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment；

3）将制成A-Fragment与3′端带有突出的脱氧胸甘酸T的 LMP Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment；

4）将去除了未环化的线性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库；

5）将步骤4）获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3）再次进行环化；

6）将步骤5）获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。

上述步骤1）将打断的DNA进行末端缺口补齐修复是用T4 DNA polymerase来进行的；

步骤4）中所述的识别四个碱基的限制性内切酶为Hha I、Nla III、Hpa II、Mse I或MluC I。

步骤6）中所述的LMP Adaptor的引物的序列为SEQ ID NO:1和2。

本发明的建库方法，只需要合成两条63 bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。整个过程成本低，步骤简单，易于操作，重现性好。

具体实施方式

现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1 LMP文库的构建

首先将提取的基因组DNA用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，Qubit（Invitrogen）进行定量定性分析，保证DNA的高质量，包括完整性和纯度。然后，取120 μl基因组DNA（20-35 ng/μl），用CovarisS220进行片段打碎，具体条件如下：7℃，mini blue tube，Duty Factor 20%，Peak Incident Power 3W，cycles per Burst 1000，900秒。超声打碎完成后，用1.2%琼脂糖凝胶电泳对2 Kb目的区域进行回收，对回收片段用T4 DNA polymerase进行末端修复， 200 μl体系包含如下的组分：100 μl 回收的2 Kb DNA片段，10 mM dNTP 8 μl, T4 DNA polymerase （3 U/μl）5 μl, PNK (poly nucleotide kinase) （10 U/μl） 1.5 μl； Klenow 片段（5 U/μl）3 μl，10 mM ATP 20μl，1×PNK缓冲液，20℃，反应30分钟，修复完成后的产物用Qiagen PCR cleanup kit进行纯化；

2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment；

将纯化后的修复片段的′端加单个“A”碱基，100 μl体系：10 mM dATP 1.5 μl , Klenow polymerase (exo-)（5 U/μl）2 μl，1×NEB Buffer 2，37℃温育30 min，随后用Qiagen PCR cleanup kit进行纯化，获得2kb Fragment-A基因文库；

将Fragment-A基因组文库与带有3′端T突出的LMP Adaptor用T4 DNA连接酶于12℃孵育过夜，再用Qiagen PCR cleanup kit进行片段纯化，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment文库，其中LMP Adaptor的正反序列如下：

5′pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

3′TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAG-p-5’

4）将去除了未环化的线性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库：

将获得的环状LMP-Adaptor-Fragment文库先后用T7核酸外切酶（T7exonuclease）和S1核酸酶（S1 nuclease）进行消化，除去未环化的线性分子，具体步骤如下：环状的LMP-Adaptor-Fragment文库100 μl（~500 ng），T7 exonuclease（10 U/μl）6 μl,1×反应缓冲液25 μl，总体积250 μl，37℃消化30分钟，70℃热激20分钟使酶失活，立刻冰浴；接着，T7 exonuclease消化后的DNA片段250 μl，3M NaCl 8.25 μl，S1 nuclease（25 U/μl）10 μl，37℃消化30分钟，Qiagen PCR cleanup kit进行片段纯化;

将纯化后的环状分子均分为两份，分别用Hpa II和Mse I两种限制性内切酶37℃消化2小时，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得片段主要集中1kb以下，Caliper LabChip XT DNA750 Kit进行300~500bp区域回收;

5）将步骤4）获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3）进行环化；

将步骤4）回收的纯化片段分别用T4 DNA快速连接酶室温（25℃）作用5分钟，进行DNA粘性末端环化，并除去未环化的线性分子，去除未环化的线性分子的方法参照步骤4）进行。

最后，将两份纯化好的环状分子混合作为模板，MP PCR1.0（核苷酸序列为SEQ ID No：1）和MP Index 1（核苷酸序列为SEQ ID No：2）为引物，高保真DNA聚合酶（Thermo Scientific PhusionHotStart II High-Fidelity DNA polymerase）进行PCR扩增：预变性98℃ 30s；98℃ 10s, 65℃ 10s，72℃ 30s，16个循环；后延伸72℃ 5min。PCR产物用Caliper LabChip XT DNA750 Kit进行400~600bp区域回收，最终获得LMP文库。 .

本发明方法构建的LMP文库的测序及其数据分析：

将上述LMP文库进行2x150bp的pair-end二代测序，利用cutadapt软件（http://code.google.com/p/cutadapt/）在测序read中寻找（2）中使用的限制性酶切位点，去掉该位点碱基，并筛除数据中长度较短（如<30 bp）的read对。结合其他插入片段较短（~200-600bp）文库二代测序的数据，利用velvet软件进行de novo基因组拼接。使用本发明的方法对嗜盐菌（Bacillus agargdhaerens）的基因组进行了长片段末端文库的构建，结果显示，本发明方法构建的LMP文库的加入可以有效地解决重复序列引起的拼接困难，纠正重复序列造成的拼接错误，构建更大的scaffold，将大基因组或复杂基因组组装的更为完整。基因组大小约为4M的菌株，仅用paired-end文库测序数据进行拼接得到136个contigs，加入LMP文库测序数据后，contigs减少到32个，完整性大大提高。

Claims

1.一种长片段末端文库的构建方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：

2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment；

3）将制成的A-Fragment与3′端带有突出的脱氧胸苷酸T的LMPAdaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment；

所述的LMP Adaptor的正反序列如下：

5′-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′

3′-TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAG-p-5′；

6）将步骤5）获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成长片段末端文库的构建；

所述的步骤1）将打断的DNA进行末端缺口补齐修复是用T4DNApolymerase来进行的；

所述的步骤4）中所述的识别四个碱基的限制性内切酶为Hha I、Nla III、Hpa II、Mse I或MluC I。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的步骤6）中的LMPAdaptor的引物的序列为SEQ ID NO:1和2。