CN103849617A - 用于基因组dna永久保存的接头及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了用于基因组DNA永久保存的接头及方法。本发明所述用于基因组DNA永久保存的接头序列两端带有硫代碱基修饰与DNA片段结合后可以有效的保护基因组DNA，防止降解。本发明所述基因组DNA永久保存的方法，按照构建DNA短片段文库的方法，将用于基因组DNA永久保存的接头与随机打断样品基因组DNA片段连接后扩增保存。本发明所述方法操作简便，适合于基因组DNA的永久保存，同时还可以实现全基因组扩增。

Description

用于基因组DNA永久保存的接头及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于基因组DNA永久保存的接头及方法。
背景技术
DNA是染色体的重要组成成分，是真核生物的遗传基本物质，含有物种个体的遗传信息，可用于构建基因文库、分离所需的基因和检测相关的分子标记等。由于DNA所含的遗传信息量大，并且容易获取，具有极其稳定的化学性质，是目前种质资源和遗传资源收集和保存的主要内容之一。DNA分子的序列结构具有三个重要特性：（1）不同个体序列不一样；（2）终生不变；（3）同一人体各不同部位细胞中的DNA序列相同，因此DNA分子本身具备档案的特性，即具有长期稳定性、信息属性、个体特异性和可以备查的属性。实际上，在疾病基因组学、药物基因组学、群体遗产学和进化等研究领域，DNA是最可靠的证据和研究过程的基本材料，被广泛应用。同时生命科学研究者日益认识到保存DNA对于今后系统生物医学的发展的重要性，各国纷纷开始保存DNA。世界上最早开始实施大规模DNA保存的是冰岛的Decode公司，全部DNA样本及其相关资料来自于将近1/3的冰岛成年人和90%以上的冰岛老年人。利用其建立的生物样本库。Decode找到了心肌梗塞等20多种疾病的致病基因。随后英国、美国、以色列等国家研究单位建立了类似的遗产资源样本库，并且以色列对外销售这些资料齐全的人的DNA样本。
基因组DNA的长期保存的主要挑战来源于核酸酶的污染。核酸酶通过分解水解核苷酸之间的磷酸二酯键使DNA降解。传统的DNA保存方法是使用无菌超纯水或TE洗脱基因组DNA，于-20℃保存，由于TE溶液中含有EDTA，可以和金属离子络合后降低核酸酶的活性，以此来尽可能的降低污染核酸酶的活性，延长基因组DNA保存的时间。有文章报道为了尽可能的降低酶活，用高浓度的酒精-20℃保存，使用时离心除去酒精，或者利用更低温度（-80度）保存。上述这些现有的在抽提完基因组DNA后保存在特定的溶液中的方法操作比较简单直观，但是并没有从根本上杜绝核酸酶的消化作用，而仅仅是尽可能的降低其活性，保存的效果有好有差。特别是由于核酸酶活性较强，很难灭活，在保存温度发生变化，DNA重复冻融的情况下，往往会出现较大范围的DNA降解。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对目前方法无法从根源上杜绝核酸酶的影响，导致DNA长期保存过程中降解的问题，提供用于基因组DNA永久保存的接头及方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
用于基因组DNA永久保存的接头，其特征在于，接头序列两端带有硫代碱基修饰。
优选的，所述接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
本发明还提供了一种基因组DNA永久保存的方法，按照构建DNA短片段文库的方法，将用于基因组DNA永久保存的接头与随机打断样品基因组DNA片段连接后扩增保存。
优选的，所述方法具体为随机打断样品基因组DNA为一定长度的片段，在每个片段上分别连接序列两端带有硫代碱基修饰的接头，利用与接头组匹配的引物在高保真酶体系中扩增后低温保存。
优选的，所述在片段连接带有硫代碱基修饰的接头前还包括片段末端补平和加A的步骤。
优选的，所述打断为物理打断或限制性内切酶酶切。
优选的，所述打断后的样品片段的长度为100bp-700bp。
优选的，所述序列两端带有硫代碱基修饰的接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
优选的，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DNA分子和核苷酸序列SEQ ID NO:6所示的DNA分子。
优选的，所述高保真酶为Phusion超保真DNA聚合酶。
优选的，所述低温保存为于1×TE缓冲液中-20℃保存。
本发明提供了用于基因组DNA永久保存的接头及一种基因组DNA永久保存的方法。本发明所述用于基因组DNA永久保存的接头序列两端带有硫代碱基修饰与DNA片段结合后可以有效的保护基因组DNA，防止降解。本发明所述基因组DNA永久保存的方法，按照构建DNA短片段文库的方法，将用于基因组DNA永久保存的接头与随机打断样品基因组DNA片段连接后扩增保存。本发明所述方法操作简便，适合于基因组DNA的永久保存，同时还可以实现全基因组扩增。
附图说明
图1示实施例7-80℃冻存保存效果检测图，其中泳道M为2000bp DNA分子量标记，泳道1-16为DNA样本；
图2示实施例7本发明所述方法保存效果检测图，其中泳道1为500bpDNA分子量标记，泳道7为2000bp DNA分子量标记，泳道2-6为DNA样本。
具体实施方式
本发明实施例公开了用于基因组DNA永久保存的接头及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了用于基因组DNA永久保存的接头，所述接头序列两端带有硫代碱基修饰。其中序列两端的硫代碱基可以有效的保护基因组DNA，防止降解。
在一些实施例中，所述接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。SEQ ID NO:1-4所示的DNA分子除了序列两端带有硫代碱基的修饰外，16bp以上的核苷酸序列较长，可以进一步保护基因组DNA，避免DNA降解。
本发明还提供了一种基因组DNA永久保存的方法，按照构建DNA短片段文库的方法，将用于基因组DNA永久保存的接头与随机打断样品基因组DNA片段连接后扩增保存。本发明所述方法将随机打断样品基因组DNA片段与序列两端带有硫代碱基修饰的接头连接可以有效的保护基因组DNA，防止降解，适合于基因组DNA的永久保存，同时还可以实现全基因组扩增。
在一些实施例中，所述方法具体为随机打断样品基因组DNA为一定长度的片段，在每个片段上分别连接序列两端带有硫代碱基修饰的接头，利用与接头组匹配的引物在高保真酶体系中扩增后低温保存。
本发明所述基因组DNA永久保存的方法在片段连接带有硫代碱基修饰的接头前还包括片段末端补平和加A的步骤。所述末端补平是指通过连接反应将DNA的粘末端补平，用于后续的平端连接，通常借助DNA聚合酶(如Klenow片段或T4DNA聚合酶)5′→3′DNA聚合酶活性加入核苷酸。而末端加A是指通过连接反应在DNA平末端上加一个腺嘌呤碱基“A”。
在一些实施例中，本发明所述基因组DNA永久保存的方法利用NEWENGLAND BioLabs公司的T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4磷酸激酶将片段化产生的DNA片段末端补平。
Klenow片段（Klenow Fragment），是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNApolymerase I)的大片断。Klenow片段保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。Klenow片段的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性。Klenow片段对于5'突出或3'突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。Klenow片段可以将双链DNA5'突出末端的补平，双链DNA3'突出的打平(也称削平)，同时用于5'突出末端的标记，随机引物法进行DNA标记，Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。
在一些实施例中，本发明所述基因组DNA永久保存的方法利用Klenow片段（3'→5'exo-）在已补平末端的DNA片段3'端加上一个腺嘌呤（A）。Klenow片段(3'→5'exo-)是大肠杆菌DNA聚合酶I的蛋白水解产物，同大肠杆菌DNA聚合酶I一样，具有5'→3'的DNA聚合酶活性，但失去了5'→3'外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A,E357A)去除了其3'→5'的外切核酸酶活性，所以不适用生成平末端的反应。
本发明所述基因组DNA永久保存的方法中所述打断为物理打断或限制性内切酶酶切。即通过物理或限制性内切酶将基因组DNA打断为带有粘性末端的若干DNA片段。其中，所述物理打断包括但不限于使用Nebulizer、Bioruptor、Hydroshear和Covaris。
本发明所述基因组DNA永久保存的方法中所述打断后的样品片段的长度优选为100bp-700bp。
在一些实施例中，序列两端带有硫代碱基修饰的接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
在一些实施例中，与接头匹配的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:5的引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的引物2。其中引物1与接头1匹配，引物2与接头2匹配。采用上述引物进行PCR扩增时，对于基因组DNA不存在选择性，不会造成不同区域扩增效率差异大的问题。
本发明所述基因组DNA永久保存的方法中选择在高保真酶体系中进行扩增。高保真酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。所述高保真酶包括但不限于使用Taq、Pfu和Phusion超保真DNA聚合酶
在一些实施例中，所述高保真酶为Phusion超保真DNA聚合酶。Phusion超保真DNA聚合酶是由NEB公司生产超保真DNA聚合酶，因其在具有校读功能的聚合酶上融合了一段特殊的DNA结合域，大大提高了聚合能力和扩增速度，从而使其拥有了同类产品难以媲美的优点。其中，Phusion超保真DNA聚合酶的超高保真性高于常规商业化耐热聚合酶Taq的50倍；Phusion超保真DNA聚合酶的超快速度极大缩短延伸时间，是Pfu的10倍，Taq的2倍；Phusion超保真DNA聚合酶的超强扩增能力，使极少的优化即可获得最佳的扩增效果，成功率高；Phusion超保真DNA聚合酶具有超高产量，用极少的酶即可获得极高产量，节省扩增成本；Phusion超保真DNA聚合酶的还具有超强特异性，在热启动及热启动Master Mix模式中，可以精确定位模板。
本发明所述基因组DNA永久保存的方法在扩增后将DNA进行低温保存，所述低温保存为于1×TE缓冲液中-20℃保存。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：样品打断
采用雾化法（Nebulizer）打断样品，可将样品DNA打碎至100～700bp范围的片段。具体方法如下：
1)从nebulizer kit中取出一个nebulizer，拧开蓝色的盖子，从另外一个包装袋中取出一个乙烯树脂管，套在中心喷雾管上面，将树脂管用力上推，直至与蓝盖的内表面严丝合缝为止；
2）取样品5μg-10μg左右（用TE或超纯水补足到50μL）＋700μLNebulization buffer（50%甘油＋1×TE）充分混合，然后将液体移入nebulizer中，拧紧盖子并将nebulizer埋入冰中；
3）将nebulizer的上部接口连上氮气管，慢慢的先拧开氮气瓶的主阀门，确认瓶中有氮气后，拧开副阀门，将输出压力调至0.3Mpa，nebulizer6min，然后首先关闭主阀门，待输出压力为0后，关闭副阀门；
4）将nebulizer放于吊篮上，450g，离心2min，一般情况应剩下400～600μL左右的液体，且比较黏稠，
5)用QIAquick PCR Purification Kit（货号28106）进行回收，用1个离心纯化柱进行DNA的纯化，溶于27μL的溶解缓冲液（EB）中。
实施例2：补平随机DNA文库末端
利用T4DNA聚合酶（购于NEW ENGLAND BioLabs公司，货号M0203S）、Klenow片段（购于NEW ENGLAND BioLabs公司，货号M0210S）和T4磷酸激酶（购于NEW ENGLAND BioLabs公司，货号M0210S）将片段化产生的DNA文库片段末端补平。
末端补平反应体系为：
Figure BDA0000439013400000071
末端补平反应条件为20℃、30min。反应完成后同样利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification kit（货号28004）进行纯化，并洗脱到27μL的保存体系（1×TE）中。
实施例3：在随机DNA文库的3'末端加上A尾
利用NEW ENGLAND BioLabs公司Klenow片段（3'→5'exo-）（货号M0212S）在已补平末端的DNA片段3'端加上一个腺嘌呤（A）。
加A尾反应体系为：
Figure BDA0000439013400000072
加A尾反应条件为：37℃、30min。反应完成后同样利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification kit（货号28004）进行纯化，并洗脱到27μL的保存体系（1×TE）中。
实施例4：随机DNA文库加上接头序列
利用T4DNA连接酶（NEW ENGLAND BioLabs公司，货号M202S）将接头1或接头2连接到具有A尾的随机DNA文库上。
接头制作是将正反链以等摩尔数混合并稀释到10μM，加热至95℃3min，随后降至常温，使正反链复性成为双链的结构。
接头连接反应体系为：
Figure BDA0000439013400000081
连接反应条件为：16℃、1小时。
其中，接头1和接头2的序列如表1所示。
表1接头序列
Figure BDA0000439013400000082
实施例5：割胶回收
在连接接头反应完成后将所有连接产物进行琼脂糖凝胶（1%琼脂糖）电泳，并割胶选择500-1000bp的片段。利用QIAGEN公司的MinElute GelExtraction Kit（货号28604）进行胶纯化，并洗脱到25μL的保存体系（1×TE）中。
实施例6：PCR扩增
利用Phusion超保真DNA聚合酶（NEW ENGLAND BioLabs公司，货号F-530S）、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的PCR引物扩增回收后的片段。
PCR扩增反应体系为：
其中，引物1和引物2的序列如表2所示。
表2引物序列
引物名 序列(5'to3')
引物1 TGTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO:5
引物2 CAGGAAACAGCTATGACCT SEQ ID NO:6
PCR扩增循环条件为：
Figure BDA0000439013400000092
反应完成后利用QIAGEN公司的MinElute PCR Purification kit（货号28004）进行纯化，并洗脱到30μL的保存体系（1×TE）中，-20℃保存。
实施例7：保存效果验证
提取同一样品基因组DNA，随机分为两份，一份-80℃冻存，另一份按照本发明所述方法-20℃保存，一年后琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖）检测保存效果，结果见图1和图2。
由图1和图2结果可见，-80℃冻存一年后，基因组DNA发生明显降解，而经本发明所述方法保存一年后，基因组DNA保存良好没有降解。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
Figure DEST_PATH_IDA0000484866750000011

Claims (10)

1.用于基因组DNA永久保存的接头，其特征在于，接头序列两端带有硫代碱基修饰。
2.根据权利要求1所述接头，其特征在于，所述接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQID NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
3.一种基因组DNA永久保存的方法，其特征在于，按照构建DNA短片段文库的方法，将用于基因组DNA永久保存的接头与随机打断样品基因组DNA片段连接后扩增保存。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述方法具体为随机打断样品基因组DNA为一定长度的片段，在每个片段上分别连接序列两端带有硫代碱基修饰的接头，利用与接头组匹配的引物在高保真酶体系中扩增后低温保存。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述在片段连接带有硫代碱基修饰的接头前还包括片段末端补平和加A的步骤。
6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述打断为物理打断或限制性内切酶酶切。
7.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述打断后的样品片段的长度为100bp-700bp。
8.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述序列两端带有硫代碱基修饰的接头包括接头1和接头2，其中所述接头1包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述接头2包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的DNA分子。
9.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的DNA分子和核苷酸序列SEQ ID NO:6所示的DNA分子。
10.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述高保真酶为Phusion超保真DNA聚合酶。
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