CN104152394A

CN104152394A - 一种定向激活原油中采油功能微生物的方法

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Publication number: CN104152394A
Application number: CN201410297655.XA
Authority: CN
Inventors: 聂勇; 李卫乐; 赵雅坤; 池昌桥; 来国莉; 蔚晓燕; 刘晓霞; 吴晓磊
Original assignee: BAOTOU RESEARCH INSTITUTE COLLEGE OF ENGINEERING PKU
Current assignee: BAOTOU RESEARCH INSTITUTE COLLEGE OF ENGINEERING PKU
Priority date: 2014-06-29
Filing date: 2014-06-29
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-06-29
Also published as: CN104152394B

Abstract

本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种通过数理统计方法筛选激活剂，将该激活剂和微生物的菌属相关联进行研究，来定向激活原油油相中特定的内源采油功能微生物的方法。包括以下步骤：A、激活剂营养因子筛选；B、内源微生物群落结构变化检测；C、营养因子与微生物的特定关系分析；D、调整激活剂营养因子配比，定向激活特定采油功能微生物。本发明的方法能从本质上体现激活剂种类与菌种的特定关系，从而能够实现油藏中微生物的定向激活，本发明的方法适用范围广，不针对某一特定油藏。

Description

一种定向激活原油中采油功能微生物的方法

技术领域

本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种通过数理统计方法筛选激活剂，将该激活剂和微生物的菌属相关联进行研究，来定向激活原油油相中特定的内源采油功能微生物的方法。

背景技术

原油中的微生物是在油田开发过程中随含有大量细菌的注入水进入油层的，经过自然选择的过程，在一定时期内在数量和种类上保持相对稳定。这些细菌通过自身调节而适应了恶劣的地层环境，能利用地层中有限的营养进行缓慢的生长和代谢。

原油中的微生物种类繁多，其营养类型和代谢方式各异，有些种类在其生长繁殖过程中，能产生诸如溶剂、酸类、气体、表面活性剂和生物聚合物等有效化合物，因而促进石油乳化。还有一类微生物群落，能利用碳源快速生长繁殖，抑制其他菌类生长，或者代谢过程产生一些有害物质，而影响在实际中的应用。

内源微生物在形成过程中，阻碍其大量繁殖的主要因素是缺乏足够的营养，激活原油中的微生物，是向原油中注入营养液，使得微生物快速繁殖和生长，而研究微生物生长发育的最佳条件，及分析激活剂种类与内源微生物群落结构的分布与变化之间的关系，可以达到定向激活的目的。

激活原油中的内源菌，是一个动态过程，过程中微生物菌系内部组成和结构都将发生变化，油藏本源是一个复杂的生态系统，不同油藏，同一油藏中也存在较大差异，定向激活原油中的微生物，专项针对目的功能菌群，一方面可以抑制有害的菌群的生长，还可以提高激活剂的利用率，降低成本投入。

天津亿利科能源公司发明一种定向调控油藏内源微生物驱油的方法，该方法通过向近井地带投加需氧激活剂定向激活了近井地带烃氧化菌，向油藏深部投加厌氧激活体系激活厌氧发酵菌(发明人为胡欣，申请号为201210367875.6，发明名称为“一种定向调控油藏内源微生物驱油的方法”)。

另外，有发明能定向激活油藏中产生物乳化剂的内源微生物，采用16S rDNA 测序分析确定产生物乳化剂的微生物种群，分析其关键代谢底物，利用正交试验优化激活剂配方体系（另外发明人为张邵东等，申请号为201310450633.8，发明名称为“一种激活油藏内源微生物产生物乳化剂的方法”）。

另外，包木太等用4中激活剂配方对沾３区块注入水中微生物群落进行了选择性激活，拟驱油实验。实验结果表明，所述4种激活剂配方能有效刺激有益菌的生长，同时对有害菌ＳＲＢ实现了较为有效抑制作用（包木太，王兵，袁长忠.胜利油田沾３区块内源微生物室内模拟激活实验研究。化工学报，2008，59(9)）。

包木太等将PCR-DGGE技术应用在内源菌激活工程中，得到对优势菌群的群落结构分析结构（包木太，王兵，陈庆国等.PCR-DGGE技术在内源细菌选择性激活过程中的应用。环境科学，2009.30（6））。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，以往激活原油中微生物的技术致使采油功能微生物和非采油功能微生物均能大量繁殖，造成药剂大量浪费，驱油效果不明显等问题；特别是以往的技术以水相中的微生物为激活目标，忽视原油油相中也广泛存在的更具亲油性的内源采油功能微生物。为此，本发明提供一种具有工艺简单，定向激活，操作方便，成本低廉，经济适用，无毒无害，适用范围广的方法，该方法能够定向激活石油中具有采油功能的微生物，特别是能够有效定向激活原油油相中的采油功能微生物的方法。

本发明在普通实验室正交实验或相应面分析的基础上，通过引用如PCR-DGGE分子生物学手段，能够分析得到营养因子与微生物的特定关系，在此基础上，通过调整营养因子配比，来达到定向激活的目的。

具体来说，本发明提供如下技术方案：

一种定向激活原油中采油功能微生物的方法，包括以下步骤：

A、激活剂营养因子筛选；

B、内源微生物群落结构变化检测；

C、营养因子与微生物的特定关系分析；

D、调整激活剂营养因子配比，定向激活目标采油功能微生物。

优选地，前面所述方法中，其中，所述的微生物是存在于原油中的内源微生物；使用定向激活剂营养因子定向激活目标采油功能微生物。

优选地，前面所述方法中，其中，所述的微生物是存在于原油油相中的内源微生物。

优选地，前面所述方法中，采油功能微生物为假单胞菌属（Pseudomonas）和/或芽孢杆菌属（Bacillus）。

优选地，前面所述方法中，所述激活剂的营养因子是碳源、氮源和磷源。

优选地，前面所述方法中，其中，定向激活原油中的假单胞菌属（Pseudomonas）的定向激活剂营养因子为碳源、氮源和磷源中的任一种或两种以上；

优选地，前面所述方法中，其中，定向激活原油中的芽孢杆菌属（Bacillus）的定向激活剂营养因子为氮源。

优选地，前面所述方法中，激活剂营养因子碳源、氮源和磷源分别为使用清水和/或油藏注入水配置的糖蜜、NH₄Cl和K₂HPO₄ 。

优选地，前面所述方法中，其中，所述氮源为NH₄Cl。

优选地，前面所述方法中，使用清水和/或油藏注入水配置的糖蜜、NH₄Cl和K₂HPO4 的浓度分别为3mg/L以上。

优选地，前面所述方法中，所述NH₄Cl使用清水和或油藏注入水配置的浓度为3mg/L以上。

本发明的方法能从本质上体现激活剂种类与菌种的特定关系，从而能够实现油藏中微生物的定向激活，本发明的方法适用范围广，不针对某一特定油藏。

附图说明

图1是CCD实验组取样时间15天的DGGE结果图。

图2是图1的DGGE结果的清晰反映各泳道条带分布情况的模拟图。

图3是CCA各实验组样品菌种组成图。

图4是CCA分析图。

具体实施方式

本发明涉及一种定向激活微生物的方法，该方法在激活原油中微生物的基础上，分析激活剂营养因子与内源微生物群落结构的分布与变化之间的关系，以达到定向激活的目的，其主要过程包括： A、激活剂营养因子筛选；B、内源微生物群落结构变化检测；C、营养因子与微生物的特定关系分析；D、调整激活剂营养因子配比，定向激活特定采油功能微生物。

本发明能够从本质上体现激活剂种类与菌种的特定关系，从而能够实现油藏中微生物特别是原油油相中微生物的定向激活，本发明的方法适用范围广，不针对某一特定油藏。

本发明还提供一种采油功能微生物的激活剂，其特征在于，该激活剂的营养因子是碳源、氮源和磷源中的一种或两种以上。

优选地，所述采油功能微生物为假单胞菌属（Pseudomonas）和/或芽孢杆菌属（Bacillus）。

本发明还提供一种针对假单胞菌属（Pseudomonas）的激活剂，其特征在于，该激活剂的营养因子是碳源、氮源和磷源中的一种或两种以上。

其中，优选地，所述激活剂为使用清水和或油藏注入水配制的糖蜜、NH₄Cl和K₂HPO₄中的一种或两种以上。优选地，激活剂的浓度为3mg/L以上。

本发明还提供一种针对芽孢杆菌属（Bacillus）的激活剂，其特征在于，该激活剂的营养因子为氮源。

其中，优选地，所述激活剂为NH₄Cl，优选地，激活剂的浓度为3mg/L以上。

下面通过最佳实施例来详细说明本发明的方法，本发明的方法并不限于下述实施例所述的含微生物的原油。

实施例一

（1）激活剂营养因子单因素实验

样品取至长庆油田，只有原油油样，没有水样。根据油田之前测定的地层水中的矿化度及钙镁含量，使用清水按40g/L的NaCl、1g/L的CaCl₂、2g/L的MgCl₂配置模拟地层水。并选取玉米浆干粉、糖蜜、蔗糖为碳源，Na₂HPO₄、K₂HPO₄、(NH₄)₂HPO₄为磷源，NaNO₃、KNO₃、NH₄NO₃、NH₄Cl为氮源，分别进行单因素实验，确定最佳碳源、磷源和氮源。

具体实验过程如下：

在模拟地层水中分别添加0.4%的玉米浆干粉、糖蜜、蔗糖，121℃灭菌30min后，各加入4%的长庆原油油样。30℃，摇床120rpm/min，振荡培养。培养15天后测定不同碳源的培养体系中的原油乳化现象、排油圈大小及总菌浓OD₆₀₀。比较筛选出的碳源为糖蜜。其中，OD₆₀₀是指将洗涤重悬菌体稀释三倍于紫外分光光度仪600nm波长下测量得到的光密度值。

在模拟地层水中添加0.4%糖蜜，分成7份，每份各添加不同的单一磷源和氮源，分别为0.33% Na₂HPO₄、0.52% K₂HPO₄、0.3%(NH₄)₂HPO₄、0.2% NH₄NO₃、0.21% NaNO₃、0.25% KNO₃、0.25% NH₄Cl，121℃灭菌30min后，各加入4%的长庆原油油样。30℃，摇床120rpm/min，振荡培养。培养15天后测定不同碳源的培养体系中的原油乳化现象、排油圈大小及总菌浓OD₆₀₀。比较筛选出的效果好的磷源为K₂HPO₄；比较筛选出的效果好的氮源为NaNO₃和NH₄Cl。

（2）Plackett-Burman实验

对糖蜜、K₂HPO₄、NH₄Cl、NaNO₃、MgCl₂、CaCl₂六种因素作为激活剂成分进行全面的考察，另外还包括5个空项作为误差分析。采用实验次数N=12的实验设计法，每个因素取高、低两个水平，分别以“+1”和“-1”表示。因素水平设计及结果见下表1和表2。

表1 Plackett-Burman实验设计及结果

表2 Plackett-Burman试验设计的因素、水平及影响效果

由表1和表2可知，糖蜜(X₁)、K₂HPO₄ (X₄)、NH₄Cl (X₉)对菌群生长激活作用均有显著的影响，其影响表现为高水平正影响。

根据上述结果，取糖蜜、K₂HPO₄、NH₄Cl的起始量分别为1.5g/L，3.00g/L，2.40g/L，经计算基本步长分别为0.5g/L，0.32g/L，0.14g/L，设计了8组实验，实验设计与结果如表3所示：

表3 最陡爬坡实验设计和结果

选择微生物生长及原油乳化分散效果最好，且激活剂加量少、成本低的处理点为下一步CCD中心复合实验的中心点，即选择第四个处理点（原点+3△），糖蜜、K₂HPO₄、NH₄Cl的浓度分别为3.0 g/L、3.96 g/L、2.82 g/L。

选择中心点实验数为6，星号臂长γ= 1.682。以菌群总菌浓OD600为响应值，糖蜜、K₂HPO₄、NH₄Cl分别自变量，设计相应法三因素五水平表，如表4所示。

表4 CCD实验设计及响应的预测值和实测值

根据实验数据进行模型拟合及统计分析，得到的二次模型，该二次模型模型显著，具有统计学意义，模型与实验值的差异性较小。方程中，自变量中，碳源对菌浓影响最显著，其他两项次之。

实施例二

（1）DNA提取

对CCD实验组样品进行PCR-DGGE实验，取CCD实验组样品1.5ml，离心菌体，弃上清，加入567μL TE缓冲液重悬。加入30μL 10% SDS(十二烷基硫酸钠)和3μL 20mg/ml蛋白酶K，充分混匀，37度温育1h；加入100μL饱和NaCl，充分混匀；加入80μL CTAB/NaCl溶液，充分混匀，65度温育10min；加入等体积24:1的氯仿/异戊醇，充分抽提，离心5min，将上清转入新试管；加入等体积25:24:1的酚/氯仿/异戊醇，充分抽提，离心5min，将上清转入新试管。加入0.6体积异丙醇，轻轻混合，室温离心，弃上清，加入70%乙醇洗涤。室温离心5min,弃上清，干燥DNA，加入40μL TE。

（2）PCR扩增

本实验扩增DNA片段为细菌16S的V3区域，所用引物为357F-GC-clamp（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。引物由上海生工合成，PCR仪型号为Bio-Rad公司的C1000 TouchTM Thermal Cycler，PCR程序选择降落PCR。PCR模版为上述DNA样品。

PCR体系组成如下表5所示，其中10×PCR Buffer、Taq酶和dNTP购买自宝生物工程（大连）有限生物，货号为R001CM(AM×12)：

表5 PCR体系组成

PCR反应程序：

利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测条带。

（3）DGGE

实验所用仪器为北京君意JY-TD331A凝胶电泳仪。

按照说明安装好制胶装置；利用40%的丙烯酰胺凝胶储备液配制2种胶浓度都为8%变性凝胶，其变性剂浓度分别为30%和60%，其中尿素为2.1mol/L、甲酰胺为12% (体积分数) 时的变性剂浓度为30%；尿素为4.2 mol/L、甲酰胺为24% (体积分数) 时的变性剂浓度为60%；向两种胶液中分别加入80μl 20%的过硫酸铵溶液，以及17μl N，N，N，N'－四甲基乙二胺（TEMED）；将配置好的2种胶分别加入灌胶系统中，打开开关开始灌胶，灌胶结束后将梯度胶放于光下聚合1~2h待胶完全聚合；取出制胶装置中的电泳核心，将整个装置放入加有8L 1×TAE电泳缓冲液的电泳仪中；接通控制器电源，启动缓冲液泵，温度设于60℃；当达到预设温度时，打开顶盖，按样品：上样缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，30% 丙三醇，10mM EDTA，0.02%溴酚蓝，0.02% 二甲苯青)为1：1的比例加样，上样量约200 ng；盖好顶盖，设置电压为80 V，时间为13 hr，开始运行；电泳完成后，在自来水中剥胶，在genefinder：1×TAE为1：10000浓度缓冲液中染色30 min，自来水冲洗1 min，利用紫外成像系统（Alpha innotech）对凝胶拍照记录。

DGGE实际电泳结果如图1所示，其模拟图如图2所示。图2可以较为清晰地反应出20个泳道条带分布情况，图2中横坐标的百分数是指以第2泳道为背景，其他泳道分别与之比较的条带相似度，其计算公式为Cs=2j/(a+b)×100%，其中j为泳道A和B的共有条带，a和b分别为样品A和B中各自的条带数。由图可见，泳道中条带粗细不一，总共有29差异条带，其中1,2,8,10,12, 13普遍存在于多数样品中，并在多数样品中条带比较粗，为特征性条带；5，9，15属于个别样品中的条带。

实施例三

（1）DGGE条带回收

将DGGE条带上的特异性条带逐一切下，将目的条带置于1.5ml离心管中，加入40μl TE，4℃过夜。取上清为模板，进行PCR。PCR引物为357F-338R(不带GC夹)，PCR体系同上。

PCR程序

利用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测条带。

（2）克隆测序

采用TIANGEN公司的 pGM-T 载体连接试剂盒对PCR产物进行连接，该过程采用无菌操作。按以下方法建立连接反应。16℃，连接过夜。

连接体系（总体积10μl）如表6所示：

表6 连接体系

从-80℃冰箱取出TIANGEN公司的TOP10感受态细胞，放在冰上待刚一融化，取部分连接产物加到50-100μl感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。将离心管放入恒温至42 oC的循环水浴中，放置90s热激。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，其间不要摇动离心管。每管加入250-500μl 37℃预热的LB培养基（提前备好，放于4℃待用），将离心管转移到37 oC摇床上，150rpm，温育45min，使细菌复苏并表达pGM-T质粒编码的抗生素标记基因。将离心管的菌液均匀，吸取100μl加到固体LB/Amp/X-Gal/LPTG培养基上，用无菌弯头玻璃棒均匀涂布，待平板干燥后，倒置，37℃培养12-16h后可出现菌落。取出培养板于4 oC放置数小时使之显色。使用引物T7（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）和引物SP6（5’-ATTTAGGTGACACTATAG-3’）进行菌液 PCR并进行电泳检测克隆是否阳性，阳性克隆放入装有 500 μl 液体含有氨苄青霉素的 LB 培养基的离心管中，摇床培养。将菌液（或质粒）送至北京迈奥德恩公司进行测序。

（3）系统进化树分析

利用mega软件，用Neighbor-Joining Tree构建系统进化树。根据进化树结果可知，上述DGGE条带属于8个属。其中17个序列属于假单胞菌属（Pseudomonas），20个属于芽孢杆菌属（Bacillus）。1个属于埃希氏杆菌属（Escherichia），1个属于柠檬酸杆菌属（Citrobacter），2个属于阴沟肠杆菌（Enterobacter），2个属于薄壁芽孢杆菌属（Gracilibacillus），2个属于海生乳杆菌属（Marinilactibacillus），经比对同源性大于99%，甚至100%。

（4）图谱分析

对DGGE图谱进行分析，得到条带的灰度值，计算条带的相对含量。对各个条带所代表的菌种进行辨识，计算样品中各菌属所占相对组成，如图3所示，其中各菌种的数量含量分别如下表7所示。

表7 各菌种的数量含量

（5）CCA分析

CCA（Canonical Correlation Analysis，典型关联分析）分析要求有两个数据矩阵，一个是物种数据矩阵，一个是环境数据矩阵。由于物种中存在一些稀有种或者偶然种，因此需要对物种数据进行筛选，物种站点出现率>85%,丰度比例>1%。本文以碳源（C），氮源（NH₄Cl）,磷源（K₂HPO₄）为环境因子，察其与生物群落的关系。结果如图4所示：

图4中箭头表示环境因子，从原点到箭头的线段长度代表环境因子与研究对象分布程度的大小，连线越长，代表这个环境因子对研究对象的分布影响越大。箭头间夹角的余弦值代表环境因子间相关性大小。由图3可知，三个环境因子间相关性较小，碳源（C），氮源（NH₄Cl），磷源（K₂HPO₄）均对微生物有着较大的相关性。

不同细菌间距离较远分布较分散，表明其相对丰度分布差异较大。假单胞菌属（Pseudomonas）靠近原点，说明C源、K₂HPO₄和NH₄Cl均对它有显著影响；芽孢杆菌属（Bacillus）与NH₄Cl正相关，与C源、K₂HPO₄负相关；薄壁芽孢杆菌属（Gracilibacillus）主要与C源、NH₄Cl正相关，与K₂HPO₄负相关；柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、埃希氏杆菌属（Enterobacter）、海生乳杆菌属（Marinilactibacillus）与C源、K₂HPO₄正相关，与NH₄Cl负相关。

实施例四

（1）对于芽孢杆菌属（Bacillus），其生长与NH₄Cl正相关，与C源、K₂HPO₄负相关的进一步验证。

在长庆油田原油油样中激活该菌，则应在保证其正常生长的条件下，适当提高NH₄Cl含量，降低与C源与K₂HPO₄的含量。

采用摇瓶实验，向150ml三角瓶中加入100mL激活剂溶液。每组做三平行样，121℃灭菌30min后，加入4g原油，30℃，摇床120rpm/min，振荡培养，培养时间15天。

实验组1：糖蜜浓度为2mg/L, K₂HPO₄为2.5 mg/L，NH₄Cl为3mg/L，经过培养，OD₆₀₀为0.50，其中芽孢杆菌属（Bacillus）含量为55%。

实验组2：糖蜜浓度为2mg/L, K₂HPO₄为4 mg/L，NH₄Cl为1.66mg/L，经过培养，OD₆₀₀为0.60，其中芽孢杆菌属（Bacillus）含量为9%。

因此，由上面的实验结果可以得到确认，本发明的方法可以筛

选出氮源类型的激活剂例如NH₄Cl可以定向激活原油油样中的目标微生物芽孢杆菌属（Bacillus），从而能够充分利用该微生物实现驱油。

（2）对于假单胞菌属（Pseudomonas），其生长与C源、NH₄Cl、K₂HPO₄均相关的进一步验证。

在长庆油田原油油样中激活该菌，分别加入C源、NH₄Cl和K₂HPO₄。

实验组1：不添加任何额外物质，只加入100ml去离子水灭菌后加入4g原油，经过培养，取样稀释涂布，假单胞菌属（Pseudomonas）的CFU为0。

实验组2：只额外添加糖蜜，糖蜜浓度为3g/L，经过培养，取样稀释涂布，假单胞菌属（Pseudomonas）的CFU（菌落总数）为2.5×10⁴个/ml。

实验组3：只额外添加K₂HPO₄，K₂HPO₄浓度为6.5g/L，经过培养，取样稀释涂布，假单胞菌属（Pseudomonas）的CFU为4.6×10³个/ml。

实验组4：只额外添加NH₄Cl，NH₄Cl浓度为2.8g/L，经过培养，取样稀释涂布，假单胞菌属（Pseudomonas）的CFU为1.9×10³个/ml。

出的激活剂例如糖蜜、K₂HPO₄、NH₄Cl可以定向激活原油油样中的目标微生物菌假单胞菌属（Pseudomonas），从而能够充分利用该微生物实现驱油。

Claims

1.一种定向激活原油中采油功能微生物的方法，包括以下步骤：

A、激活剂营养因子筛选；

B、内源微生物群落结构变化检测；

C、营养因子与微生物的特定关系分析；和

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的微生物是存在于原油中的内源微生物；使用定向激活剂营养因子定向激活目标采油功能微生物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的微生物是存在于原油油相中的内源微生物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，采油功能微生物为假单胞菌属（Pseudomonas）和/或芽孢杆菌属（Bacillus）。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述激活剂的营养因子是碳源、氮源和磷源中的任一种或两种以上。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，定向激活原油中的假单胞菌属（Pseudomonas）的定向激活剂营养因子为碳源、氮源和磷源中的任一种或两种以上。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，定向激活原油中的芽孢杆菌属（Bacillus）的定向激活剂营养因子为氮源。

8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，激活剂营养因子碳源、氮源和磷源分别为使用清水和/或油藏注入水配置的糖蜜、NH4Cl和K2HPO4中的一种或两种以上。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述氮源为NH4Cl。

10.根据权利要求8所述的方法，使用清水和/或油藏注入水配置的糖蜜、NH4Cl和K2HPO4 的浓度分别为3mg/L以上。

11.根据权利要求9所述的方法，所述NH4Cl使用清水和或油藏注入水配置，优选其浓度为3mg/L以上。