CN102559551B - 一株施氏假单胞菌及其培养方法与应用 - Google Patents

一株施氏假单胞菌及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株施氏假单胞菌菌株DP1CGMCCNo.5241及其培养方法与应用。施氏假单胞菌DP1的培养方法是将施氏假单胞菌DP1接种到专用培养基，50℃下，摇床转速120转/分，培养72小时；专用培养基的配方为：种子瓶：葡萄糖、玉米浆、淀粉、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钙；发酵瓶：葡萄糖、玉米浆、淀粉、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化钙。本发明应用于低渗透性油田的三次开发，利用微生物生长繁殖及代谢过程中产生的气体、生物聚合物和无机盐沉淀形成生物膜的作用，改善层间油水运动状况，达到调剖堵水提高采收率的目的。

Description

一株施氏假单胞菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株菌种及其培养方法与应用，具体涉及一株施氏假单胞菌及其培养方法与应用。
背景技术
聚合物生产菌株在采油上的应用主要在微生物调剖方面，微生物调剖（Microbial plugging）技术，是通过注入微生物或激活地层本源微生物，利用微生物生长繁殖及代谢过程中产生的气体、生物聚合物和无机盐沉淀形成生物膜的作用，调整注入井吸水剖面，达到调剖堵水提高采收率的目的，而目前的现有技术中，缺少优秀的生物聚合物生产菌株应用于微生物采油现场，限制了生物聚合物生产菌株的在采油作业中作用的发挥。
发明内容
本发明的目的是提供一株能发酵生成生物聚合物、调剖堵水提高采收率的施氏假单胞菌及其培养方法与应用。
本发明所采用的技术方案是：
一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241，其16S rDNA基因序列为：
CGAGCTACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGACGGTACCACG；
上述16S rDNA基因序列的长度为1417个核苷酸。
一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241的培养方法，是将施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241接种到专用培养基，在50℃的培养温度下，摇床转速120转/分，培养72小时；
所述的专用培养基的配方为：
种子瓶： 葡萄糖2.0g、玉米浆0.8g、淀粉1.0g、硝酸钠0.3g、磷酸氢二钠0.1g、磷酸氢二钾0.1g、磷酸二氢钾0.05g、硫酸镁0.05g、氯化钠0.1g、氯化钙0.005g、pH值7.3；
发酵瓶：葡萄糖6.0g、玉米浆1.8g、淀粉3.0g、硝酸钠0.5g、磷酸氢二钠0.15g、磷酸氢二钾0.1g、磷酸二氢钾0.05g、硫酸镁0.05g、氯化钠0.5g、氯化钙0.005g、pH值7.3。
所述的一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241在提高油田采收率中的应用。
所述的一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241在制备油田开发生物解堵剂中的应用。
本发明具有以下优点：
本发明提供的施氏假单胞菌株，可应用于低渗透性油田的三次开发，通过注入微生物，利用微生物生长繁殖及代谢过程中产生的气体、生物聚合物和无机盐沉淀形成生物膜的作用，菌体细胞及其代谢产出的生物聚合物对高渗透层带起较好的选择性封堵作用，从而改善层间油水运动状况，扩大波及区域，调整注入井吸水剖面，达到调剖堵水提高采收率的目的。应用光学和电子显微镜对聚合物进行了观察，发现生物聚合物是一种水不溶性的相互缠绕的网状结构；利用纸层析分析其酸水解产物是葡萄糖，推断生物聚合物为纤维素类物质。此外，该菌培养方法简单易操作，生长繁殖迅速，具有扩大化生产的可行性，具有较高的研究、应用及市场价值。 
附图说明
图1为不同温度条件下施氏假单胞菌菌株DP1的生长曲线。
图2为不同培养时间施氏假单胞菌菌株DP1的生长曲线。
图3为岩心1中0.1PV施氏假单胞菌菌株DP1的采收率与压力曲线。
图4为岩心2中0.3PV施氏假单胞菌菌株DP1的采收率与压力曲线。
图5为岩心3中0.5PV施氏假单胞菌菌株DP1的采收率与压力曲线。
图6为岩心4中0.7PV施氏假单胞菌菌株DP1的采收率与压力曲线。
图7为不同岩心即不同渗透率模型中施氏假单胞菌菌株DP1的采收率曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1，已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5241。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
一、施氏假单胞菌菌株（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241的分离筛选与纯化：
1、培养基
种子瓶：糖2.0g，玉米桨0.6g，硝酸钠0.2g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钾0.2g，氯化钙0.005g，pH 7.2
发酵瓶： 糖10g，玉米桨1.8g，硝酸钠0.6g，磷酸氢二钠0.2g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钾1.0g，氯化钙0.05g，pH7.2
2、培养条件
培养温度50℃，摇床转速120转/分。通过显微镜观察菌株的生长情况。图1为不同温度条件下施氏假单胞菌菌株DP1的生长曲线，图2为不同培养时间施氏假单胞菌菌株DP1的生长曲线。
施氏假单胞菌菌株DP1在50℃条件下培养，测定72小时内发酵液黏度，见表1。
表1 发酵液粘度随培养时间变化     
Figure 201210001458X100002DEST_PATH_IMAGE001
从表1可以看出，施氏假单胞菌菌株DP1在实验条件下，能够产生生物聚合物，培养72小时后，发酵液黏度大于25mPa·s。
3、 培养基的优化
（1）配方一
种子瓶：蔗糖2.0g，玉米浆0.8g，硝酸钠0.3g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.1g，氯化钙0.005g，pH值7.3
发酵瓶：蔗糖6.0g，玉米浆1.8g，硝酸钠0.5g，磷酸氢二钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钙0.005g，pH值7.3
（2）配方二
种子瓶：蔗糖2.0g，玉米浆0.8g，硝酸铵0.3g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.1g，氯化钙0.005g，pH值7.3
发酵瓶：蔗糖6.0g，玉米浆1.8g，硝酸铵0.5g，磷酸氢二钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钙0.005g，pH值7.3
（3）配方三
种子瓶：葡萄糖2.0g，玉米浆0.8g，硝酸钠0.3g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.1g，氯化钙0.005g，尿素0.2g，pH值7.3
发酵瓶： 葡萄糖6.0g，玉米浆1.8g，硝酸钠0.5g，磷酸氢二钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钙0.005g，尿素0.5g，pH值7.3
（4）配方四
种子瓶：葡萄糖2.0g，玉米浆0.8g，淀粉1.0g，硝酸钠0.3g，磷酸氢二钠0.1g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.1g，氯化钙0.005g，pH值7.3
发酵瓶：葡萄糖6.0g，玉米浆1.8g，淀粉3.0g，硝酸钠0.5g，磷酸氢二钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，磷酸二氢钾0.05g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.5g，氯化钙0.005g，pH值7.3
选定的四种不同培养基配方，分别在相同的温度、不同的给氧条件下，研究产生生物聚合物菌株的生长情况及代谢产物pH 值和粘度变化。
实验结果见表2、3、4、5。
表2  40℃摇床转速80转/分菌菌体生长情况
表3  40℃摇床转速80转/分菌液pH、黏度
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表4   40℃摇床转速120转/分菌菌体生长情况（个/ml）
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表5   40℃摇床转速120转/分菌液pH、黏度
由以上实验可以看出，菌种DP1在培养基配方四条件下产物粘度比较大，说明在此条件下代谢产物较多，聚合物菌种确定为DP1，培养基配方确定为培养基配方四。
二、施氏假单胞菌菌株（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241的培养方法：
培养基：
种子瓶： 葡萄糖2.0g、玉米浆0.8g、淀粉1.0g、硝酸钠0.3g、磷酸氢二钠0.1g、磷酸氢二钾0.1g、磷酸二氢钾0.05g、硫酸镁0.05g、氯化钠0.1g、氯化钙0.005g、pH值7.3
发酵瓶：葡萄糖6.0g、玉米浆1.8g、淀粉3.0g、硝酸钠0.5g、磷酸氢二钠0.15g、磷酸氢二钾0.1g、磷酸二氢钾0.05g、硫酸镁0.05g、氯化钠0.5g、氯化钙0.005g、pH值7.3
培养方法：培养温度50℃ ，摇床转速120转/分，培养72小时。
三、施氏假单胞菌菌株（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241的鉴定：
1、菌落特征
该菌株为革兰氏阴性菌株，杆状、有芽孢。
2、生理生化特性（见表6）
表6   施氏假单胞菌菌株DP1生理生化特性表
Figure DEST_PATH_IMAGE007
3、施氏假单胞菌菌株（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241的核苷酸序列
施氏假单胞菌菌株DP1 16S rDNA基因序列测定结果：
CGAGCTACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGACGGTACCACG
四、施氏假单胞菌菌株（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241在应用领域的具体效果：
1、施氏假单胞菌菌株DP1驱油室内物理模型实验
1.1 实验材料
实验用水：按照油田地层水矿化度（4000－80000mg/l）配制的模拟水。
实验岩心：延长油田天然岩心。
实验用微生物：施氏假单胞菌菌株DP1，其浓度指数为106～109个/mL；不同的浓度及用量对天然岩心进行驱油实验。
1.2 实验方法
水驱含水98%后，研究浓度为4%～10%的施氏假单胞菌菌株DP1用量为0.1、0.3、0.5、0.7PV时在物理模型中的驱油效果，给出其合理用量。
1.3 实验结果
实验结果如下表6、图3～7：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
如图3～7中的压力曲线所示，在模型渗透率相同的条件下，随着施氏假单胞菌菌株DP1用量的增大，后续水驱的压力不断的增大。随着施氏假单胞菌菌株DP1用量的增大，微生物驱采收率不断的增大，当施氏假单胞菌菌株DP1的用量为0.5PV时，采收率的增幅开始减小。从投入产出比的角度考虑，施氏假单胞菌菌株DP1的最佳用量为0.5PV，提高采收率可达到8%以上。
从以上可知，模型渗透率、施氏假单胞菌菌株DP1用量相同的条件下，随着施氏假单胞菌菌株DP1用量的增大，这一规律表现的越明显。说明油层温度和水质更有利于施氏假单胞菌菌株DP1在岩心高渗透区生长繁殖及产生更多的生物聚合物，有选择性地堵塞大孔道，改善流度比，较大幅度的提高采收率。
                         SEQUENCE LISTING 
<110>  陕西延长石油（集团）有限责任公司研究院 
<120>  一株施氏假单胞菌及其培养方法与应用 
<130>  2012-2 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1417
<212>  DNA
<213>  施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）
 
<400>  1
cgagctacca tgcagtcgag cggatgaaga gagcttgctc tccgattcag cggcggacgg     60
 
gtgagtaatg cctaggaatc tgcctggtag tgggggacaa cgtttcgaaa ggaacgctaa    120
 
taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct atcagatgag    180
 
cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta aaggctcacc aaggcgacga tccgtaactg    240
 
gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc    300
 
agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa    360
 
gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcagtaag ctaatacctt    420
 
gctgttttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta    480
 
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ttaagttgga tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccaaaa ctggcgagct    600
 
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tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca   1380
 
gaagtagcta gtctaacctt cgggggacgg taccacg                            1417
 
 

Claims (3)

1.一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其16S rDNA基因序列为：
CGAGCTACCATGCAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGACGGTACCACG；
上述16S rDNA基因序列的长度为1417个核苷酸。
2.权利要求1所述的一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241在提高油田采收率中的应用。
3.权利要求1所述的一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）DP1 CGMCC No.5241在制备油田开发生物解堵剂中的应用。
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