CN115433694A - 耐辐射甲基杆菌l321在降解邻苯二甲酸酯以及促生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了耐辐射甲基杆菌L321在降解邻苯二甲酸酯以及促生长中的应用。本发明研究表明植物内生菌耐辐射甲基杆菌L321能产铁载体，有助于植物吸收土壤中营养元素，能促进植物生长；L321菌株还能够以DBP、DEHP为唯一碳源生长，同时具有降解邻苯二甲酸酯的能力，在以DBP(200mg/L)为唯一碳源的无机盐液体培养基中培养5d后，其对DBP的降解率为12.7±0.6％，具有降解有机污染物的潜力。耐辐射甲基杆菌L321能在邻苯二甲酸酯污染的土壤中生长，能实现土壤修复和促进植物生长。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域。更具体地，涉及耐辐射甲基杆菌L321在降解邻苯二甲酸酯以及促生长中的应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯(Phthalic acid esters，PAEs)，又称酞酸酯，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。是一大类人工合成有机物，主要作为增塑剂被广泛应用于多个化工行业中。自然环境中PAEs浓度一般较低，经生产使用后，残留在环境中PAEs极易通过食物链在人体中富集，对生物体造成不可逆损伤。PAEs及其代谢物能够对机体造成致畸性、致突变性、致癌性。而PAEs在环境中的水解、光解的速率非常缓慢，PAEs对整个生态系统造成潜伏、广泛和深远的危害。世界各国对PAEs污染的治理给予了高度重视，其中邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)等9种PAEs类增塑剂已经被列入环境内分泌干扰物质优先控制的污染物。
植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。在污染严重的地区，植物内生菌可以利用有机污染物作为其生长所需的原料，来增强植株对逆境的耐受性，也能提高植物对有机污染物的耐受能力，更好地适应污染环境。而目前对于PAEs的治理，大多通过微生物降解菌的分离，来实现降解环境中的PAEs污染物。但是，现有技术中关于报道的能降解PAEs的植物内生菌种质资源匮乏。因此，需要筛选出新的植物内生菌应用于作物和土壤中PAEs的降解，能很好地降解植物或自然环境中的邻苯二甲酸酯，也能促进内生菌与植物互利共生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供耐辐射甲基杆菌L321在降解邻苯二甲酸酯以及促生长中的应用。
本发明的目的是提供耐辐射甲基杆菌L321的新应用。
本发明另一目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长的制剂。
本发明再一目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了植物内生菌耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321的新应用，该菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61950，保藏地址为广州市先烈中路100号。本发明研究显示L321菌株具有很强的产铁载体能力，有助于植物吸收土壤中营养元素，从而促进植物生长；还能在以DBP、DEHP为唯一碳源的培养基上生长，能够利用这些有机污染物作为碳源和能源；L321菌株能够降解邻苯二甲酸二丁酯，对200mg/L DBP的降解率为12.7±0.6％。L321菌株具有产铁载体促进植物生长、降解有机污染物的能力，能很好适应污染物环境，降解土壤污染物。
因此，本发明提供耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321和/或其菌液在降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长、修复邻苯二甲酸酯污染的土壤中、在制备降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长的制剂中的应用。
优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。
本发明提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长的制剂，含有耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液。
本发明提供一种降解邻苯二甲酸酯的方法，采用耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液对邻苯二甲酸酯污染的土壤或直接对邻苯二甲酸酯进行处理。
优选地，所述菌液为菌悬液。
优选地，所述所述菌悬液的浓度为1.0×106～2.0×1010cfu/ml。
优选地，所述处理条件为15～40℃。
优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。
特别地，由于土壤环境中污染物底物浓度低，富含其他碳源物质，而L321菌株还能以其他污染物为碳源进行生长，能更好地适应污染土壤；因此，可以通过降低有机污染物底物浓度、适量添加葡萄糖等碳源来优化降解条件，将菌株L321继续驯化以提高降解能力，增加菌株L321对土壤污染物的降解率。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321菌株的新应用，本发明研究显示，菌株L321具有很强的产铁载体能力，有助于植物吸收土壤中营养元素，能促进植物生长；L321菌株能在以DBP、DEHP为唯一碳源的培养基上生长，能够利用这些有机污染物作为碳源和能源，并降解邻苯二甲酸酯，其对200mg/LDBP的降解率为12.7±0.6％。菌株L321属于植物内生菌，具有产铁载体促进植物生长、降解有机污染物的能力，能很好适应污染物环境，降解土壤污染物。
附图说明
图1为菌株L321在LB培养基上的生长形态；
图2为菌株L321的16S rRNA系统发育树；
图3为菌株L321产铁载体效果；
图4为菌株L321在以DBP、DEHP为唯一碳源的无机盐培养基中的生长形态。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株的分离鉴定
将采集的植物野生稻先冲洗干净后，放在超净工作台中处理，进行消毒后洗涤，再将其研磨后的液体接种于LB固体培养基(酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，加超纯水至1L，调节pH为7.0)，恒温培养箱中28℃养1～3天。待细菌长出来后，采用稀释涂布法和平板划线法对菌株进行分离纯化。取分离得到的菌株在LB固体培养基上划线培养7天，观察菌落形态，再进行革兰氏染色和生理生化特性测定。
菌落形态如图1所示，菌落呈粉红色，圆形，不透明，边缘规则，有光泽。是革兰氏阴性菌，菌株的适宜的生长温度为15～40℃，pH范围5～8，生长适宜的NaCl浓度范围≤4，乙酰甲基甲醇(V-P)测定呈阳性，过氧化氢酶测定呈阳性，吲哚测定呈阳性，淀粉水解测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，明胶液化测定呈阴性，硝酸盐还原测定呈阴性，产氨试验测定呈阴性，脲酶测定呈阴性，纤维素酶测定呈阴性。
将菌株转接至LB液体培养基扩大培养，离心收集菌体，采用细菌提取试剂盒提取菌体总DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，将PCR产物送测序分析。
将所得菌株序列与NCBI上登陆的核酸序列库进行同源比对分析，结果如图2所示，本发明分离纯化得到的菌株的16S rRNA基因序列与耐辐射甲基杆菌Methylobacteriumradiotolerans JCM 2831T(CP001001)同源性最高。根据上述形态学鉴定、16Sr DNA以及同源性比对结果确定该菌株为耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)，命名为耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321菌株，该菌株于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No.61950，保藏地址：广东广州市越秀区先烈中路100号。
实施例2菌株L321产铁载体效果分析
(1)菌种悬液的制备
将上述纯化后的菌种L321接入含有10mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000rpm离心10min收集菌体，用pH7.0的0.05mol/LPBS缓冲液洗菌3次后重悬，调节OD600nm＝1.0作为菌种悬液。OD值测定采用岛津UV-2450型紫外可见光分光光度计。
(2)菌株L321的分泌铁载体性能测定
将制备得到的菌株L321菌悬液接种至MSA-CAS液体培养基中，置于摇床中28℃、120r·min-1培养2天。液体培养基从蓝色变为红色、橙黄色或紫色为能够分泌铁载体，变色程度越深说明产铁载体能力越强。菌株L321产铁载体效果如图3所示，液体培养基从蓝色变为红色，不接菌对照仍为蓝色培养基，效果直观明显，表明菌株L321具有很强的产铁载体能力，铁载体有助于植物吸收土壤中营养元素，能促进植物生长。
实施例3菌株L321降解有机污染物的效果
(1)菌悬液的制备
取实施例1中纯化后的菌种L321接入含有10mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000rpm离心10min收集菌体，采用pH 7.0的0.05mol/LPBS缓冲液洗菌3次后重悬，调节OD600 nm＝1.0，即得菌悬液。
(2)菌株L321的降解性能测定
定性测定：取L321菌株划线接种，分别接种至含有200mg/L邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和200mg/L邻苯二甲酸二酯(DEHP)为唯一碳源的MSM固体培养基(K2HPO4 5.8g，KH2PO44.5g，(NH4)2SO4 2.0g，MgCl2 0.16g，CaCl2 0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.0024g，KNO3 0.0012g，FeCl3 0.0018g，MnCl2·2H2O 0.0015g，调节培养基的pH为7.0)上，每个处理重复三次，恒温培养箱中28℃养1～5天，观察菌株的生长情况。
定量测定：采用灭菌后的MSM固体培养基，以每瓶50mL分装在250mL玻璃三角瓶中待用，加入DBP浓度为200mg/L，得到以DBP为唯一碳源的MSM培养基。向MSM固体培养基中接种1mL制备得到的L321菌悬液，同时设置不接菌株处理为对照组(CK)，每组三个重复。将摇瓶置于恒温摇床30℃，150rpm/min的条件下避光培养5天。在第5d时取样并抽提样品，经GC/MS测定样品中DBP的浓度。
(3)DBP提取和测定方法
取上述培养样品置于三角瓶内，加入20mL色谱级的二氯甲烷，振荡10min，倒进分液漏斗中，待样品分层稳定后，取下层有机相转移到鸡心瓶中；将上层水相倒回原来的三角瓶并加入二氯甲烷重复萃取两遍，合并有机相二氯甲烷，并过15cm的无水Na2SO4柱，将过滤液全部转移至鸡心瓶中，旋转蒸发至近干，将浓缩液全部转移至10ml容量瓶中，并用色谱纯甲醇洗涤鸡心瓶加入容量瓶定容至10mL。取1mL经0.45um微孔滤膜过滤，滤液收集于进样瓶中，进行GC-MS分析。
采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5柱子(0.25μm×0.25mm×30μm)，进样温度为250℃，离子源(EI)温度为220℃，采用不分流进样，进样体积1μL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100℃，30℃/min梯度上升至280℃，保持6min。采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。DBP的基质加标平均回收率为89.3～105.5％，相对偏差低于10.8％，仪器检测限为0.13～0.45ug/g。该方法满足痕量有机物定量分析要求。
结果如图4所示，菌株L321能在以DBP、DEHP为唯一碳源的培养基生长，说明菌株L321能够利用这些有机污染物作为碳源和能源。在以DBP(200mg/L)为唯一碳源的无机盐液体培养基中培养5d后，菌株L321对DBP的降解率为12.7±0.6％。可以将菌株L321继续驯化以提高降解能力，优化降解条件，降低有机污染物底物浓度适量添加葡萄糖等碳源，增加菌株L321对复合污染物的降解率。
综上所述，本发明提供耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321菌株的新应用，本发明研究显示，菌株L321具有很强的产铁载体能力，铁载体有助于植物吸收土壤中营养元素，能促进植物生长；L321菌株能在以DBP、DEHP为唯一碳源的培养基上生长，能够利用这些有机污染物作为碳源和能源。能够降解邻苯二甲酸二丁酯对200mg/LDBP的降解率为12.7±0.6％。菌株L321属于植物内生菌，具有产铁载体促进植物生长、降解有机污染物的能力，能很好适应污染物环境，降解土壤污染物，从而更好地适应环境。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)L321和/或其菌液在降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长中的应用，其特征在于，所述耐辐射甲基杆菌L321菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61950。
2.耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液在修复邻苯二甲酸酯污染的土壤中的应用，其特征在于，所述耐辐射甲基杆菌L321菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61950。
3.耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液在制备降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长的制剂中的应用，其特征在于，所述耐辐射甲基杆菌L321菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61950。
4.根据权利要求1-3任一所述应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。
5.一种降解邻苯二甲酸酯和/或促进植物生长的制剂，其特征在于，含有耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液，所述耐辐射甲基杆菌L321菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61950。
6.一种降解邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于，采用耐辐射甲基杆菌L321和/或其菌液对邻苯二甲酸酯污染的土壤或直接对邻苯二甲酸酯进行处理，所述耐辐射甲基杆菌L321菌株已于2021年9月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61950。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述菌液为菌悬液。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述所述菌悬液的浓度为1.0×106～2.0×1010cfu/ml。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述处理条件为15～40℃。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二丁酯。
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