CN114196570B - 一种金黄杆菌及其在降解草甘膦中的应用 - Google Patents

一种金黄杆菌及其在降解草甘膦中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金黄杆菌及其在降解草甘膦中的应用。本发明研究得到一株金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)Y16C，该菌株已于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61817。该菌株能够在4天内完全降解400mg·L‑1的草甘膦，可用于修复草甘膦污染的水体、土壤等自然环境，直接施用5天后可使土壤中草甘膦残留量(400mg·Kg‑1)能降低76.2％以上；本发明提供的金黄杆菌Y16C丰富了农药降解菌的种质资源库，在草甘膦残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，且能制备成优良的降解菌剂应用于草甘膦污染土壤等环境的生物修复，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。

Description

一种金黄杆菌及其在降解草甘膦中的应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种金黄杆菌及其在降解草甘膦中的应用。
背景技术
迄今为止，草甘膦已成为世界上应用最广、产量最大、年销售额最高的除草剂品种。目前，草甘膦约占全球农药总用量15％，占据全球除草剂40％市场份额，仅2017年全球草甘膦产能达106.5万吨/年，其中孟山都产能38万吨/年，中国产能为68.5万吨/年，我国现已成为全球草甘膦原药产能最大的生产国，草甘膦也成为我国主要的农药出口品种(杨益军，2020)。由于草甘膦除草效率高、效果好、成本低以及抗草甘膦转基因作物大面积种植，为草甘膦的发展提供了广阔的应用市场和发展前景，也明确了其未来一段时间内在除草剂领域不可替代的行业态势。
草甘膦农药作为现代农业种植生产中重要的除草剂被广泛使用，生产及使用过程中的残留是导致草甘膦农药环境污染的主要来源。同时，越来越多的研究表明草甘膦并不是一种环境友好型农药，其对非光合生物具有一定的毒性，其毒性大小受制剂类型、生物种类、环境等多种因素影响。草甘膦作为近年来日益受到关注的潜在环境生态危险源，对其生态毒性的研究日益增多，如何评价及预测其环境风险得到越来越多的关注。有研究发现，草甘膦的使用会破坏土壤的微生态，影响微生物群落和土壤酶活性(Ermakova et al.,2010)，尤其是抑制放线菌和土壤脲酶的活性。同时，土壤残留的草甘膦会流经地表水，破坏水生生态系统的平衡(Lupi et al.,2015)。此外，草甘膦会影响孕期动物的胚胎发育，导致形态变异。由此可见，环境中残留的草甘膦不仅对生态系统造成影响，破坏生态平衡，还能通过食物链的富集进入人体内，进而威胁人类健康。因此，如何去除草甘膦的土壤残留污染已成为当前亟待解决的问题。
土壤环境中的草甘膦存在水解、光化学降解、生物降解等降解方式。微生物降解是草甘膦在自然环境中一种主要的代谢途径，具有高效且不产生二次污染的特点，已成为21世纪修复污染土壤的主流策略。现有已报道的能降解草甘膦微生物包括胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)菌株ZM-1、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamultivorans)菌株WS-FJ9、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株CB4、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株K7和苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)菌株DGG-1-3、Ge-4和B18等，如专利CN105602872A公开了一株具有草甘膦农药高效降解特性的菌株Aquamicrobiumdefluvii YU 1-1，但微生物降解草甘膦的能力因菌株不同而存在一定的差异性。目前筛选获得的草甘膦降解微生物效率不高，严重制约了草甘膦降解菌的进一步研究利用。筛选获得遗传稳定性好、降解效率高、适应性强的草甘膦降解菌株是修复草甘膦污染土壤的首要前提，也成为微生物降解草甘膦的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服以上的缺陷和不足，筛选出新的草甘膦降解菌，为降解环境中污染物提供更多更高效的菌株选择。
本发明的目的是提供一株金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)Y16C。
本发明的第二个目的是提供所述金黄杆菌Y16C的应用。
本发明的第三个目的是提供一种草甘膦除草剂的降解菌剂。
本发明的第四个目的是提供一种修复草甘膦污染的自然环境的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)Y16C，该菌株已于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61817，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明经过大量探索研究获得一株新的对除草剂草甘膦具有降解作用的降解菌，即金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)，并筛选得到一株高效快速降解草甘膦的金黄杆菌Y16C，该菌株是从广州市花都区某农药厂废水处理池的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对草甘膦具有高效的降解效能，在以草甘膦为唯一碳源的基础盐培养基中培养4天，对400mg·L-1草甘膦的降解率达到100％，可耐受800mg·L-1高浓度草甘膦；将该菌株接种污染土壤5天后，土壤中草甘膦残留量(400mg·Kg-1)降低76.2％；其降解能力优异，可高效快速去除水体和土壤中该类农药残留量，可以作为优良的生物降解菌应用于草甘膦污染位点的生物修复。
因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
一种含有所述金黄杆菌Y16C和/或其发酵液的高效降解草甘膦除草剂的降解菌剂，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述金黄杆菌Y16C为菌悬液。
优选地，所述菌剂中菌体数量不低于1.0×105CFU/mL。
另外，还可采用吸附材料吸附金黄杆菌Y16C和/或其发酵液制成固体剂型。
所述吸附材料可以是泥炭。
同时，利用所述降解菌剂修复草甘膦污染的自然环境的应用和方法，也在本发明保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明探索研究显示，金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)对草甘膦具有明显的降解作用，并筛选得到了一株高效快速降解草甘膦的金黄杆菌Y16C，该菌株可用于修复草甘膦污染的水体、土壤等自然环境，直接施用5天后可使水体和土壤中草甘膦残留量(400mg·Kg-1)降低76.2％以上。本发明提供的金黄杆菌Y16C丰富了农药降解菌的种质资源库，在草甘膦残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。
另外，本发明还为挖掘新型、优良的草甘膦微生物和降解基因资源奠定基础，为发展绿色安全的草甘膦农药残留去除技术提供科学依据，以及可构建新型抗草甘膦除草剂的转基因作物，丰富我国拥有自主知识产权的转基因作物产品，提升我国大国农业竞争力。
附图说明
图1为菌株Y16C在LB固体培养基上菌落形态图。
图2为菌株Y16C的扫描电镜图。
图3为菌株Y16C的16S rRNA系统进化分析结果。
图4为金黄杆菌Y16C生长与草甘膦降解曲线。
图5为金黄杆菌Y16C对草甘膦的降解产物及途径分析。
图6为金黄杆菌Y16C对土壤中草甘膦的降解图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4，2.0g/L；CaCl2·2H2O，0.01g/L；FeSO4·7H2O，0.001g/L；Na2HPO4·12H2O，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.2g/L；KH2PO4，1.5g/L。
Luria-Bertani培养基(LB，g/L)：酵母提取物，5.0g/L；蛋白胨，10.0g/L；氯化钠，10.0g/L。
种子培养基和发酵培养基的配方与LB培养基一致。
以上培养基以蒸馏水配成，pH7.2，于高压湿热灭菌锅121灭菌20分钟。固体培养基：每1L培养基加入15g琼脂粉。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、草甘膦降解菌株的筛选分离
采集广州市花都区某农药厂废水处理池的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50mL含有草甘膦(50mg/L)的MSM液体培养基中，经30℃，200r/min培养7d后，每次按2％的接种量，将农药质量浓度从50mg/L依次升至100mg/L、200mg/L、400mg/L和800mg/L连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有400mg/L和800mg/L草甘膦的MSM固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在LB固体培养基上多次划线纯化，随后使用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS)验证其降解效果。
最后分离获得一株菌株，并利用20％的甘油将该菌株保存于-80℃。该菌株可以利用草甘膦作为唯一的碳源和能源生长，4天内对草甘膦的降解率达到100％。
2、菌株的鉴定
(1)形态学鉴定：
将菌株接种于LB固体平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态，分析菌株的生物学特性以及扫描电镜下的形态。
菌株在LB固体平板培养2d的菌落形态如图1所示，呈现黄色，半透明，边缘规则，表面光滑。其主要生物学特性为：革兰氏阴性，好氧。菌株的扫描电镜图如图2所示，可以看出，扫描电镜下可以观察到该菌株细胞呈杆状。
(2)16S rDNA分子生物学鉴定：
提取菌株基因组DNA为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R:5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR产物委托金唯智(广州)生物科技有限公司进行测序。将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用CLUSTAL-W及MEGA-X软件构建系统进化树及分析进化关系。
菌株的16S rRNA系统进化分析结果如图3所示，可以看出，本发明分离纯化得到的菌株的16S rDNA序列与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)R6-353同源性达91％，进化距离最近。该菌株的培养特征、扫描电镜观察特征也与金黄杆菌最为相似。因此，鉴定该菌株属于金黄杆菌。
基于上述鉴定结果，将该菌株命名为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)Y16C，并于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61817，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2金黄杆菌Y16C降解菌剂的制备
使用实施例1中分离的得到金黄杆菌Y16C制备降解菌剂的生产工艺流程为：斜面菌种-摇瓶种子液-种子罐培养-生产罐发酵-降解菌剂(剂型可为悬浮剂或粉剂)。具体方法如下：
(1)将金黄杆菌Y16C菌种在LB固体平板上活化，接种于LB试管斜面上备用。
(2)将金黄杆菌Y16C的试管种接种于含250mL LB培养基的1000mL摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭菌的种子培养基，装液量为70％。将培养好的摇瓶菌液按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210rpm/min，培养至对数生长期备用。
(3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.8m3/min，搅拌速度为210r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程时间为36小时，发酵结束后菌体数量≥1.0×109CFU/mL，发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。
实施例3金黄杆菌Y16C对草甘膦的降解效果实验
1、实验方法
(1)种子液制备：将纯化后的金黄杆菌Y16C接入含有5mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，4000rpm离心后，菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)冲洗两次，所得菌体作为接种体。
(2)降解性能测定：将100mg/L的菌体接种至50mL含有草甘膦(400mg/L)的MSM培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm条件下恒温摇床培养7天，每1d取样一次，利用紫外-可见光分光光度计测定金黄杆菌Y16C的生长情况(OD600)，并采用超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)测定其对草甘膦的降解情况。
(3)草甘膦检测条件：
UPLC-MS/MS：液相系统ACQUITY UPLC；
质谱系统XEVO-TQD(Waters,USA)；
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，1.7μm，2.1*100mm色谱柱；
流速：0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样体积：5μL；
流动相：A：水(含2mM乙酸铵+0.1％氨水)，B：甲醇；
Figure BDA0003343238090000061
离子源：电喷雾离子化源ESI负离子，MRM模式；
毛细管电压：3.5kV；
源温度：150℃；
雾化气温度：350℃；
雾化气流速：800L/h；
按照以下式计算草甘膦降解率：
降解率(％)＝(1-A1/A0)×100
A1为降解菌处理后草甘膦残留浓度，A0为对照处理后的草甘膦残留浓度；
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
2、实验结果
金黄杆菌Y16C生长与降解草甘膦的动态图如图4所示，可以看出，金黄杆菌Y16C能高效降解草甘膦，并可利用其作为生长的唯一碳源。且草甘膦降解与金黄杆菌Y16C生长呈正相关。在草甘膦作为唯一碳源条件下，金黄杆菌生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期，1～3天为菌株的生长对数期，此时该菌株对草甘膦的降解最快；随着菌株生长达到稳定期，此时草甘膦的降解曲线趋于平缓。培养4天后，金黄杆菌Y16C对草甘膦的降解率达到100％，而对照组(自然降解率)为13.0％。表明该金黄杆菌Y16C具有高效快速降解草甘膦的能力。
实施例4金黄杆菌Y16C对草甘膦的降解产物测定及降解途径分析
1、实验方法
在含有50mL MSM培养基的锥形瓶中加入草甘膦，使其终浓度为400mg/L。接入金黄杆菌Y16C，以未接菌的为对照，置于30℃恒温摇床中200rpm连续培养5天，每天定期取样，应用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS/MS)检测草甘膦的降解产物，检测条件与草甘膦检测条件一致，同实施例3，并根据降解产物化学结构分析降解途径。
2、实验结果
基于UPLC-MS/MS结果，如图5所示得到了草甘膦的微生物降解途径：首先，草甘膦通过断裂C-N键生成AMPA和乙醛酸，乙醛酸进入三羧酸循环进一步代谢，而AMPA可被继续分解成磷酸和甲胺，用于菌株的生长合成和代谢或者直接被排出体外。最终，草甘膦被降解生成二氧化碳和水。
实施例5金黄杆菌Y16C对草甘膦污染土壤的修复实验
1、供试土样
森林表层土(5～20cm)，取自广州市华南农业大学树木园，属红壤土，5年内没有施用草甘膦和其他农药的记录。土壤的理化参数表征为(g/kg，干重)：有机物，10.5；总氮，0.5；总磷，0.4；总钾，18.2；pH值为6.9。土壤由65.0％沙子，28.0％淤泥和7.0％黏土组成。
土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过10目筛(2mm)，随后一部分土壤拿去121℃高温湿热灭菌1小时。分别取一定量的草甘膦母液用喷壶均匀喷晒在土壤上，然后搅拌均匀，使土壤中草甘膦的终浓度为400mg/kg，然后置于30℃恒温培养箱中培养，按100mg/Kg的接种量接入金黄杆菌Y16C，以加蒸馏水(即未加菌)作为对照，土壤的持水量保持在15％左右。在30℃和避光条件下连续培养5天，并定期取样，UPLC-MS/MS法测定草甘膦残留量并计算降解率，降解率计算方法同以上实施例3。
2、实验结果
金黄杆菌Y16C在土壤中降解草甘膦的曲线和动力学参数分别如图6和表1所示，可以看出，草甘膦降解过程遵循一阶动力学模型，其k值范围为0.09129至0.26724。草甘膦降解的回归系数(R2：0.93996～0.97439)表明降解数据与模型具有很好的相关性。在灭菌和未灭菌土壤中，草甘膦降解的t1/2值分别为7.5天和4.6天。在灭菌和未灭菌土壤中加入100mg/kg金黄杆菌Y16C草甘膦降解的t1/2值显着降低至3.0和2.6天。说明金黄杆菌Y16C在灭菌和未灭菌土壤中均显著提高了草甘膦的降解率。
表1金黄杆菌Y16C在土壤中降解草甘膦的动力学参数
Figure BDA0003343238090000081
通过加入金黄杆菌Y16C，在未灭菌的土壤中观察到最大的草甘膦降解效果，这可能是由于存在多种微生物群落所致。同样，与未加金黄杆菌Y16C的对照相比，在未灭菌土壤中也观察到良好的降解效果。在灭菌和未灭菌的土壤中，对照的t1/2分别为7.5和4.6天，而在用金黄杆菌Y16C处理的同一土壤中，t1/2分别显着降低至3.0和2.6天。说明金黄杆菌Y16C在土壤中也能发挥高效的降解潜力，可用于大规模污染土壤或地下水的处理。
金黄杆菌Y16C降解菌剂在直接施入土壤中后，能够快速降解土壤中的草甘膦，没有出现不降解或降解滞后效应现象，其降解性能稳定，为金黄杆菌Y16C对草甘膦的土壤修复提供了科学依据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)Y16C，其特征在于，该菌株已于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：61817。
2.权利要求1所述金黄杆菌Y16C在降解草甘膦中的应用。
3.权利要求1所述金黄杆菌Y16C在制备草甘膦降解菌剂中的应用。
4.权利要求1所述金黄杆菌Y16C在修复草甘膦除草剂污染的自然环境中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体或土壤。
6.一种草甘膦除草剂的降解菌剂，其特征在于，含权利要求1所述金黄杆菌Y16C和/或其发酵液。
7.根据权利要求6所述的降解菌剂，其特征在于，所述金黄杆菌Y16C为菌悬液。
8.根据权利要求6或7所述降解菌剂，其特征在于，降解菌剂中菌体数量为1.0×105～1.0×109CFU/mL。
9.根据权利要求6所述降解菌剂，其特征在于，采用吸附材料吸附金黄杆菌Y16C和/或其发酵液制成固体剂型。
10.一种修复草甘膦污染的自然环境的方法，其特征在于，用权利要求6-9任一所述降解菌剂处理自然环境。
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