CN114107095B - 一种赤红球菌及其制剂在拟除虫菊酯农药污染修复中的应用 - Google Patents

一种赤红球菌及其制剂在拟除虫菊酯农药污染修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赤红球菌及其制剂在拟除虫菊酯农药污染修复的应用。所述菌株为革兰氏阳性细菌赤红球菌(Rhodococcus ruber)菌株Y14，并于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61813。该菌株具有显著的拟除虫菊酯类杀虫剂生物降解能力，尤其是对右旋苯醚氰菊酯活性最高，将其配制成菌体数量不低于1.0×106CFU·mL‑1的悬浮液，处理6天后可使水体中的50mg·L‑1右旋苯醚氰菊完全去除，同时对污染土壤也具有高效的生物修复作用。为解决农业生产中拟除虫菊酯类杀虫剂残留超标及环境污染问题提供一种新思路，也丰富了农药降解菌的种质资源库，对生产无毒无公害的绿色农产品，具有重要的实际应用价值。

Description

一种赤红球菌及其制剂在拟除虫菊酯农药污染修复中的应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种赤红球菌及其制剂在拟除虫菊酯农药污染修复中的应用。
背景技术
拟除虫菊酯类杀虫剂一种自然除虫菊素的人工合成相似物，其第一代产品是合成于1949年的丙烯菊酯。但随后发现人工合成的拟除虫菊酯存在光不稳定性，容易在自然环境中光解而失效。因此，上世纪70年代在拟除虫菊酯结构中的α手性碳位点引入了氰基，由此产生了第二代拟除虫菊酯类杀虫剂。到目前为止，拟除虫菊酯类杀虫剂在全球范围内的应用已有半个世纪。随着世界卫生组织对高毒高残留的氨基甲酸酯类和有机磷类杀虫剂的逐步淘汰，被标于低毒低残留的拟除虫菊酯类农药的全球市场份额近几年达到新高。据2018年的统计数据，拟除虫菊酯占全球杀虫剂市场份额的30％左右。拟除虫菊酯类农药是一类非极性农药，施用之后大部分的活性成分因各种因素到达不了靶标生物从而进入自然环境中，仅有不足1％的拟除虫菊酯抵达作用于农业害虫。拟除虫菊酯类杀虫剂进入土壤表面之后，一小部分被自然光解，大部分则被土壤颗粒吸附在土壤结构中。长期的不合理使用拟除虫菊酯类杀虫剂，已导致在世界范围内广泛报道了各种拟除虫菊酯的残留问题。有报道显示，加利福尼亚州南部多个流域的地表水和沉积物中检出了高浓度的联苯菊酯，检出率为41％。
随着地面径流和地下水的迁移，拟除虫菊酯残留越来越多的堆积在自然水体中，如湖泊。随着水生食物网的层层递进，通过生物放大作用以及农业灌溉等措施，拟除虫菊酯农药残留最终会累积在人体之中。Rousseau等人的研究显示，从当地菜市场购买的生菜和卷心菜中检测出三氟氯氰菊酯残留，即使14天后仍未消失。对泰国北部农业生产地区的多位消费者及农业生产者的尿液进行了拟除虫菊酯农药残留检测，从样品中普遍检测到拟除虫菊酯的代表性有毒中间产物3-苯氧基苯甲酸。
微生物生物修复是近几十年发展起来的一种有效控制污染环境的策略，相较于其他例如物理和化学措施，微生物生物修复具有低成本、无二次污染、操作简单等优点。但目前用于拟除虫菊酯类杀虫剂的微生物降解菌为：寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)和烟色曲霉(Aspergillusfumigatus)等；如专利CN108410759A公开了一株高效降解氯氟氰菊酯的玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrousL5菌株，但其降解率不高，对浓度为5mg/kg的氯氟氰菊酯降解率为71.44％，而且只能降解氯氟氰菊酯。
目前，已有少数国家和企业已经实现了微生物降解菌剂的开发和应用，但这方面仍然缺乏更多具有优良生物修复潜力的菌株。本发明旨在提供一种高效的拟除虫菊酯类杀虫剂的生物修复菌株及其降解菌剂的应用，为以后的污染环境生物修复提供了一种可选的解决方案。
发明内容
本发明提供了一株新的能降解拟除虫菊酯类杀虫剂的优良菌种，在对拟除虫菊酯类农药的污染和环境保护中具有很好的应用价值。
本发明的目的是提供一株可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的赤红球菌(Rhodococcusruber)菌株Y14。
本发明的另一目的是提供所述菌株Y14的应用。
本发明的再一目的是提供一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂。
本发明的再一目的是提供所述降解菌剂的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的赤红球菌(Rhodococcus ruber)菌株Y14，该菌株于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61813，GenBank数据库登录号为：MW485814。
该菌株分离自采集于广东省某化工厂附近的活性污泥，经形态学特征和16SrRNA系统发育分析鉴定为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。菌株Y14在LB固体平板上30℃培养48小时后，菌落在中呈现圆形、全缘、光滑、微凸起、有光泽。其主要生物学特性为：为革兰氏染色阳性菌，好氧，菌体为短杆状，大小约长1.0～3.0μm，宽约0.5μm，繁殖方式为裂殖。
该菌株Y14具有显著的降解右旋苯醚氰菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂残留的能力。因此，菌株Y14在降解拟除虫菊酯类杀虫剂中的应用，以及在制备拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌剂中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供所述菌株Y14在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体或土壤中的应用。
优选地，所述拟除虫菊酯类杀虫剂包括但不限于右旋苯醚氰菊酯、氰戊菊酯、丙烯菊酯、氯菊酯、炔丙菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯和溴氰菊酯。
本发明提供一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂，含有权利要求1所述菌株。
优选地，其降解菌剂的浓度为1.0×106～1.0×1010CFU/mL。
使用菌剂时，应使稀释后的菌剂中菌体数量不低于1.0×106CFU·mL-1。直接在水体中施用本菌剂，在较短时间内可使浓度为50mg/L右旋苯醚氰菊酯的降解率达到100％。
本发明还提供所述降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
S1.将菌株Y14培养至对数生长期，得菌种；
S2.将步骤S1所得菌种，按照体积比5～10％的接种量接种入种子培养基培养，得种子液；
S3.将步骤S2所得种子液，按照体积比5～10％的接种量接种入发酵培养基培养，进行发酵，得到培养液，把培养液制备成菌剂即得可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂。
优选地，步骤S1所述培养所用培养基为LB培养基。
优选地，步骤S2和步骤S3培养过程中通入无菌空气，无菌空气的通气量为0.45～1.0m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养温度30℃，全流程培养时间为24～48h。
更优选地，无菌空气的通气量为0.6～1.0m3/min。
优选地，发酵完成后菌体的数量不低于1.0×108CFU/mL。
本发明还提供述降解菌剂在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体或土壤中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一株拟除虫菊酯农药残留高效降解菌株赤红球菌菌株Y14，该菌株可以利用右旋苯醚氰菊酯等拟除虫菊酯类杀虫剂作为唯一碳源生长，在短时间内可有效降解拟除虫菊酯类杀虫剂，6天内对水体中浓度为50mg/L的右旋苯醚氰菊酯的去除率达到100％，表明该菌株具有良好的生物修复能力。该菌株可用于修复右旋苯醚氰菊酯污染的水体、土壤等自然环境。对土壤也具有高效的生物修复作用，可用于处理农业生产中拟除虫菊酯类杀虫剂残留超标及环境污染问题，从而生产绿色无公害的健康农产品，保护生态环境和人类健康。
使用菌株Y14生产制备得到的降解菌剂，具有生产成本低、使用方便、安全高效等优点，适合治理水体或土壤等自然环境中拟除虫菊酯类杀虫剂造成的残留污染。
附图说明
图1为菌株Y14的16S rDNA系统进化分析；
图2为菌株Y14的菌落形态和扫描电镜图；
图3为菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的响应曲面设计(a为pH和温度交互影响对菌株Y4降解右旋苯醚氰菊酯的影响，b为单因素因子对右旋苯醚氰菊酯降解的影响)；
图4为菌株Y14在右旋苯醚氰菊酯降解过程中的生长与降解动态图；
图5为菌株Y14对其他拟除虫菊酯类杀虫剂的降解能力；
图6为菌株Y14对不同浓度的右旋苯醚氰菊酯的降解能力；
图7为菌株Y14降解不同浓度右旋苯醚氰菊酯过程中的抑制曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4 2.0g；CaCl2·2H2O 0.01g；FeSO4·7H2O0.001g；Na2HPO4·12H2O 1.5g；MgSO4·7H2O 0.2g；KH2PO4 1.5g。
Luria-Bertani培养基(LB，g/L)：酵母提取物5.0g；蛋白胨10.0g；氯化钠10.0g。
种子培养基和发酵培养基的配方与LB培养基一致。
以上培养基以蒸馏水配成，pH为7.2，于高压湿热灭菌锅121灭菌20分钟。固体培养基：每1L培养基加入15g琼脂粉。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、菌株的分离筛选
样品：采集自广东省某化工厂附近的活性污泥。
分离筛选方法采用富集培养法，具体如下：
取活性污泥样品10g加入50mL基础培养基中，同时加入右旋苯醚氰菊酯母液(丙酮为溶剂)，使右旋苯醚氰菊酯最终质量浓度为50mg/L，于30℃，200r/min摇床下进行耐受菌富集培养。培养7天后，按10％的接种量转接到第二批含100mg/L右旋苯醚氰菊酯的MSM培养基中。相同条件培养7天后，再按10％的接种量转接到含右旋苯醚氰菊酯浓度为200mg/L的MSM中，继续培养7天。以此类推，不断成倍增加右旋苯醚氰菊酯的质量浓度，连续富集培至800mg/L。将富集培养液逐步稀释成不同浓度，取20μL稀释液均匀涂到含50mg/L右旋苯醚氰菊酯的MSM固体LB平板中，30℃培养，直至长出单菌落，把分离出来的耐受菌在LB固体培养基上反复划线3次以纯化菌株，最终利用30％的甘油在-80℃条件下保存菌种。随后对样品进行萃取处理后使用高效液相色谱仪(HPLC)验证其降解效果。
采用上述方法从环境样品中成功分离获得一株右旋苯醚氰菊酯高效降解菌株，编号为Y14，该菌株可以利用右旋苯醚氰菊酯作为唯一碳源生长，6天内对浓度为50mg/L的右旋苯醚氰菊酯的降解率达到100％。
2、菌株鉴定
将菌株Y14在LB固体平板上30℃培养48小时后，菌落在中呈现圆形、全缘、光滑、微凸起、有光泽。其主要生物学特性为：为革兰氏染色阳性菌，好氧，菌体为短杆状，大小约长1.0～3.0μm，宽约0.5μm，繁殖方式为裂殖。
16S rDNA分子生物学鉴定：
提取菌株Y14基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR产物委托金唯智(广州)生物科技有限公司进行测序。测序结果提交GenBank数据库并进行注册，其登录号为：MW485814。同时，将菌株测得的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用MAGE软件构建系统进化树及分析进化关系。
16S rDNA的系统发育树如图1所示，本发明分离纯化得到的菌株Y14与赤红球菌(Rhodococcus ruber)的相似度达到92％，因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。菌株Y14的菌落形态及其扫描电镜图如图2所示。并于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:61813，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2菌株Y14降解菌剂的制备
1、使用上述分离出的菌株Y14制备降解菌剂的生产工艺流程为：
菌种—摇瓶种子液—种子罐培养—生产罐发酵—产品(剂型可为悬浮剂或粉剂)。
2、具体方法如下：
将菌株Y14的菌种在LB固体平板上活化48小时。将活化后的菌株Y14接种于含250mL LB培养基的1000mL锥形瓶中，30℃恒温振荡培养至生长对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭好菌的种子培养基，装液量为50～80％。将培养好的250mL菌液按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为120～200r/min，培养至对数生长期备用。
将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至常温后，通无菌空气，通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为120～200r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程时间为30～56小时，发酵结束后菌体数量≥1.0×108CFU/mL，发酵完成后，培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用无菌生物质粉末吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例3 Y14菌剂最佳降解工艺条件
利用Design Expert软件根据响应曲面法Box-Behnken设计原则进行试验设计，详见表1。选择影响菌株Y14生长与降解的相关因子温度(X1)、pH值(X2)和接菌量(X3)作为自变量，以右旋苯醚氰菊酯残留量为响应值(Y1)即因变量，构建二次多项式回归方程。随后根据二次多项式回归方程得到菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的三维响应曲面图。最后对二次多项式回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即Y14菌剂降解右旋苯醚氰菊酯的最佳降解工艺条件。
通过Design Expert软件分析，获得Y14菌剂降解右旋苯醚氰菊酯的二次多项式回归方程如下：
Y1＝100.00+7.11X1+8.79X2+1.68X3+7.42X1X2-1.50X1X3+0.25X2X3-11.96X1 2-11.91X2 2-1.09X3 2
其中：X1相关因子温度、X2 pH值、X3接菌量、Y1响应值。
表1响应曲面基于Box-Behnken设计矩阵
Figure BDA0003343751630000071
统计分析结果表明，二次多项式回归方程能够很好的对菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的生物降解过程进行评估，P值为0.0087。温度(X1)和pH值(X2)的单因素项对菌株Y14降解效果的达到显著水平(P<0.05)；其平方项X1 2和X2 2对菌株Y14降解效果也达到显著水平(P<0.05)；但模型显示，三种因素的相关作用项即X1X2、X1X3和X2X3对菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯无显著影响，方差分析如下表2所示。
表2菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的响应曲面拟合模型的方差分析
Figure BDA0003343751630000081
为了能更直观的反映出各因素及其交互效应，利用Design Expert软件程序绘制响应曲面图，如图3所示。图3a表示pH和温度交互影响菌株Y14菌剂对右旋苯醚氰菊酯的降解，从图中可以看出，pH和温度在编码值为零时，菌剂的代谢活性最高。图3b表示三个自变量温度、pH和接菌量对菌株Y14菌剂降解右旋苯醚氰菊酯的影响，从图3b的单因素曲线中可以直观看出，pH和温度在编码值范围为0～0.5之间表现出最佳的代谢能力。其接菌量随着接菌量的提高而降解率提高不显著，这暗示着即使使用低数量的菌剂也能达到较高的拟除虫菊酯修复效果。
为了获得菌株Y14菌剂降解工艺条件的最佳组合，对所得的二次多项式回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的最高临界值，即菌剂最优降解条件：温度33.67℃，pH9.12，接菌量为9.74×106CFU·mL-1。
实施例4菌株Y14对右旋苯醚氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解效果实验
1、实验方法
(1)接种菌体制备：将纯化后的菌株Y14接入10mL LB液体培养基中过夜活化培养至对数期(24～48小时)，调节OD值为1.0，取1mL菌液6000rpm离心3分钟后，菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)冲洗两次，所得菌体作为接种体。
(2)降解性能测定：将上述菌体分别接种至50mL含有右旋苯醚氰菊酯、胺菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、丙烯菊酯、高效氯氰菊酯、炔丙菊酯、溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药(50mg/L)的MSM培养基中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养6天，每24小时取样一次，测定菌株Y14的生长情况，并采用高效液相色谱仪(HPLC)测定其对右旋苯醚氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的降解情况。
(3)色谱条件：用配备有Phenomenex C18反相色谱柱(250nm×4.60mm，5μm)和UV检测器的Waters 2690HPLC系统对各种拟除虫菊酯进行定量。流动相由乙腈和去离子水(75:25)组成，流速为1.0mL·min-1。进样量和检测波长分别为10μL和253nm。右旋苯醚氰菊酯、胺菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、丙烯菊酯、高效氯氰菊酯、炔丙菊酯、溴氰菊酯的保留时间分别为13.229、6.801、13.579、14.302、7.304、11.473、5.559、12.785分钟。
按照下式计算拟除虫菊酯的降解率：降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，
其中：A1为降解菌处理后拟除虫菊酯残留数量，A0为对照处理后的拟除虫菊酯残留数量。
质量控制：采用内标法校正标准物质制作标准曲线。
2、实验结果
菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的结果如图4所示，菌株Y14能高效降解右旋苯醚氰菊酯，并可利用其作为生长的唯一碳源。且右旋苯醚氰菊酯的去除率与菌株Y14生长呈正相关。在右旋苯醚氰菊酯作为唯一碳源条件下，菌株Y14生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期，48小时内为菌株Y14的生长对数期，此时该菌株对丙烯菊酯的降解最快；随着菌株生长达到稳定期，此时右旋苯醚氰菊酯的降解曲线趋于平缓(2～4天)。培养6天后，菌株Y14对右旋苯醚氰菊酯的降解率达到100％，而对照组的自然降解率仅为5.0％。表明该菌株具有高效快速降解右旋苯醚氰菊酯的能力。
表3显示了菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的降解动力学参数。结果表示菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯过程遵循一级动力学模型。如表所示，菌剂处理组与未接菌的对照组的降解常数分别为0.755和0.0074。处理组的理论半衰期显著短于对照组，分别为0.92天和93.67天。此外，处理组和对照组的决定系数(R2)分别为0.9868和0.8134，这表明实际降解数据能够与一级降解动力学模型拟合良好。这些结果进一步说明了菌株Y14具有高效降解右旋苯醚氰菊酯的潜力。
表3菌株Y14降解丙烯菊酯的动力学参数
Figure BDA0003343751630000101
注：k表示降解常数；R2是决定系数；t1/2是指理论半衰期(天)。
图5为降解菌剂降解其他不同拟除虫菊酯类杀虫剂的能力。菌株Y14在分别含有浓度为50mg/L氰戊菊酯、丙烯菊酯、氯菊酯、炔丙菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯和溴氰菊酯的MSM培养基中30℃、200r/min条件下震荡培养6天。其中，氰戊菊酯的降解率最高，达到98％。其次为联苯菊酯，降解率为84％。随后依据降解率的高低排序分别为氯菊酯、胺菊酯、丙烯菊酯、高效氯氰菊酯、炔丙菊酯和溴氰菊酯，对应的降解率为78％、72％、67％、65％、63％和52％。菌株Y14对多种拟除虫菊酯的降解结果表明，由菌株Y14制作而成的降解菌剂在多种拟除虫菊酯杀虫剂污染的自然环境中也能够起到良好的作用。
实施例5菌株Y14对右旋苯醚氰菊酯的降解浓度测试
1、实验方法
将纯化后的菌株Y14接入10mL LB液体培养基中过夜活化培养至对数期(24～48小时)，调节OD值为1，取1mL菌液6000rpm离心3分钟后，菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)冲洗两次。然后将菌体分别接种至50mL含有不同浓度右旋苯醚氰菊酯(10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L和500mg/L)的MSM培养基中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养至第6天取样，采用HPLC测定其对不同浓度右旋苯醚氰菊酯的降解情况。由于拟除虫菊酯类杀虫剂既能作为菌株Y14的生长底物，同时也能作为一种生长抑制物，因此采用Andrews方程菌株Y14降解不同浓度右旋苯醚氰菊酯的过程进行拟合。方程如下所示：
Figure BDA0003343751630000111
其中：S为右旋苯醚氰菊酯浓度(mg/L)；q为右旋苯醚氰菊酯比降解速率(d-1)；qmax为右旋苯醚氰菊酯的最大比降解速率(d-1)；Ks为半速率常数(mg/L)；Ki为右旋苯醚氰菊酯对菌株Y14的抑制系数(mg/L)。
2、实验结果
菌株Y14降解不同浓度右旋苯醚氰菊酯的结果如图6所示。当浓度为25mg/L时，右旋苯醚氰菊酯的降解速率最快，第1天就超过了75％，第4天去除率达到100％。而浓度更低的10mg/L在第4天同样也被完全降解。培养6天后的结果表明，即使右旋苯醚氰菊酯的农药残留浓度高达500mg/L，菌株Y14降解菌剂对右旋苯醚氰菊酯的降解能力也能维持在80％以上。图7为菌株Y14降解不同浓度右旋苯醚氰菊酯的代谢速率及其抑制曲线。
实施例5土壤修复实验
1、供试土样
本实验的土壤样品采自于华南农业大学一个5年内无农药使用记录的菜地3～20cm深度的表土。该土样的物理化学参数为：有机质含量10.5g/kg；硝酸根离子含量20mg/kg；有效磷和有效钾含量分别为37.5mg/kg和105mg/kg；土壤电导率和pH值分别为375μS/cm和6.9；土壤由65.0％砂土、28.0％壤土和7.0％黏土组成。
将土壤样品在室内自然风干并过筛(2mm)以进行接下来的生物修复模拟研究。其中一半土样进行121℃高温湿热灭菌1小时，另一半土壤不灭菌。设置灭菌和未灭菌处理组，取一定量的右旋苯醚氰菊酯母液于无菌雾化喷壶中，随后将其一边喷撒一边搅拌，并利用少量无菌水洗涤两次喷壶并将洗涤液喷入土壤中，并使土壤中含水量维持在40％左右，右旋苯醚氰菊酯在土壤中的终浓度为50mg/kg，然后置于30℃恒温恒湿培养箱中培养。将OD600值为1.0的菌液以20mL/kg的接种量接菌进处理组中，以添加蒸馏水作为对照组。在避光条件下连续培养25天，并定期取样，萃取之后利用HPLC定量分析右旋苯醚氰菊酯的残留量。降解率计算方法见实施例4。
2、实验结果
还在灭菌和未灭菌土壤中研究了菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的能力，以探索其在自然条件下的降解功效。动力学数据表明结果详见表4，右旋苯醚氰菊酯在生物降解过程遵循一阶动力学模型，其k值范围为0.0303至0.1001。菌株Y14降解右旋苯醚氰菊酯的回归系数(R2：0.9617至0.9919)表明降解数据与模型具有很好的拟合度。在灭菌和未灭菌土壤未加菌处理的对照组中，右旋苯醚氰菊酯的t1/2值分别为22.8761天和16.6622天。在灭菌和未灭菌土壤经菌株Y14处理的右旋苯醚氰菊酯t1/2值显着降低至10.4863天和6.9246天。结果表明，在灭菌和未灭菌处理土壤中加入拟除虫菊酯降解菌Y14能够显著提高土壤中右旋苯醚氰菊酯的去除率。
表4菌株Y14在右旋苯醚氰菊酯污染土壤中的降解动力学参数
Figure BDA0003343751630000121
注：k表示降解常数；R2是决定系数；t1/2是指理论半衰期(天).
在灭菌土壤和未灭菌土壤中添加菌株Y14，对右旋苯醚氰菊酯的去除效果均得到显著的提升。在灭菌和未灭菌的土壤中，用菌株Y14处理后，t1/2分别显着降低至10.4863天和6.9246天。我们的结果表明，菌株Y14在土壤中也能发挥高效的降解潜力，可被用于拟除虫菊酯污染土壤或水体的修复处理。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的赤红球菌（Rhodococcus ruber）菌株Y14，其特征在于，该菌株于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61813。
2.权利要求1所述菌株Y14在降解拟除虫菊酯类杀虫剂中的应用。
3.权利要求1所述菌株Y14在制备拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂中的应用。
4.权利要求1所述菌株Y14在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体或土壤中的应用。
5.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述拟除虫菊酯类杀虫剂包括右旋苯醚氰菊酯、氰戊菊酯、丙烯菊酯、氯菊酯、炔丙菊酯、胺菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯或溴氰菊酯中的一种或几种。
6.一种可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述菌株Y14和/或其发酵液。
7.根据权利要求6所述的降解菌剂，其特征在于，其降解菌剂的浓度为1.0×106～1.0×1010 CFU/mL。
8.根据权利要求6所述的降解菌剂，其特征在于，采用如下方法制备得到：
S1.将菌株Y14培养至对数生长期，得菌种；
S2.将步骤S1所得菌种，按照体积比5～10%的接种量接种入种子培养基培养，得种子液；
S3.将步骤S2所得种子液，按照体积比5～10%的接种量接种入发酵培养基培养，进行发酵，得到培养液，把培养液制备成菌剂即得可降解拟除虫菊酯类杀虫剂的降解菌剂。
9.根据权利要求8所述的降解菌剂，其特征在于，发酵完成后菌体的数量不低于1.0×108 CFU/mL。
10.权利要求6～7任一所述降解菌剂在修复拟除虫菊酯类杀虫剂污染的水体或土壤中的应用。
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