CN111647592A - 用于降解有机磷杀虫剂的菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于降解有机磷杀虫剂的菌剂及其制备方法与应用。所述菌剂是以海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的包埋交联产物为载体，与台湾嗜铜菌X1混合而成。用于制备本发明菌剂的材料环保，生物相容性强，可以有效保留菌株X1对有机磷杀虫剂的降解活性。通过将菌株固定化于复合材料中，提高其对复杂环境的耐受能力，降低复杂环境中污染物对菌株的毒害作用。本发明菌剂能高效降解不同种类的有机磷杀虫剂，可以广泛应用于环境中有机磷杀虫剂的生物修复。

Description

用于降解有机磷杀虫剂的菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及农药污染生物修复技术领域，具体地说，涉及一种用于降解有机磷杀虫剂的菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
有机磷杀虫剂不仅可以用于谷物、水果、观赏植物、棉花等经济作物上稻叶蛾、瘿蚊、棉铃虫、蚜虫、红蜘蛛等害虫的防治，还可用于住宅、工业建筑周围土壤中白蚁和地下害虫的防治。有机磷农药在农业中的持续大规模使用对环境、食品和公共卫生安全带来重大威胁。有机磷杀虫剂主要通过抑制昆虫体内乙酰胆碱酯酶活性影响其神经系统，进而导致昆虫死亡。但对于哺乳动物和水生生物等非靶标生物，有机磷农药同样具有神经毒性，有的还有基因毒性。这种潜在的生态风险和暴露于环境中的有机磷农药残留所带来的健康风险受到人们的日益关注。
微生物由于降解效率高、繁殖速度快、成本低等优势成为有机污染物降解修复研究的焦点，这些降解微生物可以利用农药作为唯一碳源及能源物质进行生长，利用这些微生物降解修复环境中的农药污染成为一种高效、环保且经济的绿色技术方向。然而，由于实际废水、污染土壤中成分的复杂性，如废水中除了含有农药成分，还经常伴有重金属、酚类等污染物质，这些化合物的存在直接影响降解菌株的降解活性，使得降解菌株难以直接利用于实际污染场景的原位修复。利用微生物固定化技术，可以有效改善降解菌在复杂环境下的存活性、稳定性和催化能力。但是，由于不同降解菌株的生理生化状态不同，不同的固定化材料和固定化条件对降解菌株降解性能影响较大，选择合适的固定化材料和条件尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于降解有机磷杀虫剂的菌剂及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明以从农药厂污水中筛选出的一株有机磷农药高效降解菌为材料，通过将降解菌株固定化于多种复合材料制成菌剂，将其应用于有机磷杀虫剂实际污染场景的原位修复。所述用于有机磷杀虫剂的降解菌为台湾嗜铜菌X1(Cupriavidustaiwanensis X1)，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M2010233，保藏日期2010年9月15日。
第一方面，本发明提供一种用于降解有机磷杀虫剂的菌剂，所述菌剂是以海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的交联产物为载体，与保藏编号为CCTCC NO：M2010233的台湾嗜铜菌X1(Cupriavidus taiwanensis X1)混合而成。
所述菌剂中海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的重量比为2∶1-3∶1-3∶8-10。台湾嗜铜菌X1的含量为108-109CFU/g。
优选地，所述菌剂中海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的重量比为2∶1∶2∶10。台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
第二方面，本发明提供用于降解有机磷杀虫剂的菌剂的制备方法，包括：
1)将1-3g壳聚糖溶解于0.05mol/L稀盐酸100mL中，加入1-3g硅藻土，室温搅拌1h，用0.05mol/L NaOH溶液调节体系pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体；
2)将2g海藻酸钠和8-10g聚乙烯醇置于100mL水中，在80℃水浴锅中溶解，向其中加入上述壳聚糖-硅藻土复合载体，混匀，冷却至室温，得到混合液；
3)向上述混合液中加入3-5g保藏编号为CCTCC NO：M2010233的台湾嗜铜菌X1湿菌体，混匀，得到菌体包埋液；
4)向上述菌体包埋液中滴加4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10-15mL溶液，4℃恒温静置交联24h，所得产物用水清洗，即得菌剂；
所述菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为108-109CFU/g。
菌剂的制备原理如下：利用海藻酸钠、壳聚糖或硅藻土可以与CaCl2反应，通过钙离子耦合作用，生成凝胶小球，起到包埋作用。聚乙烯醇可以与硼酸发生交联反应，硼与-OH形成络合体，达到交联目的。
用于制备菌剂的材料中，壳聚糖，硅藻土和海藻酸钠起到包埋作用，聚丙烯醇起交联作用。以上述复合材料制得的交联产物作为载体，将菌株X1固定化于复合材料中，可以提高菌株在复杂环境的耐受性。复合材料的含量会直接影响菌剂的性能。
优选地，用于降解有机磷杀虫剂的菌剂的制备方法包括：
1)将1g壳聚糖溶解于0.05mol/L稀盐酸100mL中，加入2g硅藻土，室温搅拌1h，用0.05mol/L NaOH溶液调节体系pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体；
2)将2g海藻酸钠和10g聚乙烯醇置于100mL无菌水中，在80℃水浴锅中溶解，向其中加入上述壳聚糖-硅藻土复合载体，混匀，冷却至室温，得到混合液；
3)向上述混合液中加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体，混匀，得到菌体包埋液；
4)向上述菌体包埋液中滴加4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10mL，4℃恒温静置交联24h，所得产物用无菌水清洗，即得菌剂；
所述菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
所述台湾嗜铜菌X1湿菌体的制备方法包括：从冻存管中挑取一环菌株X1划线于LB固体培养基中，37℃恒温培养24h；挑取单菌落于100mL LB液体培养基中，140r/min 37℃恒温振荡培养12h，获得菌悬液；6000r/min离心5min收集菌体，用无菌水清洗，即得。
LB固体培养基的制作方法如下：氯化钠5g，酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，琼脂18g，加热溶解于1L去离子水，调节pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。
LB液体培养基的制作方法如下：氯化钠5g，酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，加热溶解于1L去离子水，调节pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。
本发明提供的用于降解有机磷杀虫剂的菌剂为白色或淡黄色球状颗粒，粒径大小为3-5mm，表面光滑。
第三方面，本发明提供所述菌剂、或按照上述方法制备的菌剂在降解有机磷杀虫剂中的应用。
本发明中，所述有机磷杀虫剂可选自毒死蜱、辛硫磷、水胺硫磷、丙溴磷、三唑磷、甲基对硫磷等中的至少一种。
第四方面，本发明提供所述菌剂、或按照上述方法制备的菌剂在有机磷杀虫剂污染原位修复中的应用。
第五方面，本发明提供所述菌剂、或按照上述方法制备的菌剂在重金属离子胁迫下降解有机磷杀虫剂中的应用，其中，所述重金属离子选自Pb2+、Zn2+和Cd2+中的至少一种。
可选地，pb2+的浓度为0-100mg/L(优选74.4μg/L)
Zn2+的浓度为0-100mg/L(优选84.5mg/L)
Cd2+的浓度为0-100mg/L(优选9.3μg/L)。
第六方面，本发明提供所述菌剂、或按照上述方法制备的菌剂在降解污水中有机磷杀虫剂中的应用，其中，所述污水的COD为0-32500mg/L，BOD5为0-13000mg/L，NH3-N含量为0-55500mg/L，pH为5-10。优选地，所述污水的COD为32500mg/L，BOD5为13000mg/L，NH3-N含量为55500mg/L，pH为9.2。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)用于制备本发明菌剂的材料环保，生物相容性强，可以有效保留台湾嗜铜菌X1对有机磷杀虫剂的降解活性。通过将菌株交联并包埋于固定化材料中，提高其对复杂环境的耐受能力，降低复杂环境中污染物对菌株的毒害作用。可将菌剂直接应用于污染土壤与水体的修复。
(二)本发明菌剂可以快速降解水中的毒死蜱，20mg/L毒死蜱的降解半衰期为4.51h。
(三)本发明菌剂可以反复利用，重复利用6次后，对100mg/L毒死蜱的降解率仍达到60％。
(四)本发明菌剂能高效降解不同种类的有机磷杀虫剂，可以广泛应用于环境中有机磷杀虫剂的生物修复。
附图说明
图1为本发明菌剂的外观图。
图2为本发明较佳实施例中菌剂的透射电镜图。
图3为本发明较佳实施例中菌剂在纯水与高浓度工业废水中对毒死蜱降解动力学图。
图4为本发明较佳实施例中菌剂重复利用效果图。
图5为本发明较佳实施例中菌剂对不同有机磷杀虫剂的降解动力学图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中，4％CaCl2-饱和硼酸水溶液的配制方法如下：称取5g硼酸，用110mL热水溶解足量硼酸，充分搅拌至自然冷却，取上层清液100mL加入4g CaCl2至完全溶解，即得4％CaCl2-饱和硼酸水溶液。
实施例1 用于降解有机磷杀虫剂的菌剂的制备
1、从冻存管中挑取一环菌株X1划线于LB固体培养基中，恒温培养箱中37℃恒温孵育24h。挑取单菌落于100mL LB液体培养基，140r/min 37℃恒温振荡培养12h，获得菌悬液。6000r/min离心5min收集菌体，并用无菌水洗涤3次，得到台湾嗜铜菌X1的湿菌体。所得湿菌体中台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
2、将1g壳聚糖溶解于0.05mol/L的稀盐酸100mL中，加入2g硅藻土，室温条件下搅拌1h，用0.05mol/L NaOH调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体。
3、称取2g海藻酸钠和10g聚乙烯醇置于100mL无菌水中，在80℃水浴锅中溶解，加入制备好的壳聚糖-硅藻土复合载体，充分混匀，冷却至室温后，得到混合液。
4、向混合液中加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体，混合均匀，得到菌体包埋液。
5、将包埋液中滴入4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10mL，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
制备得到的菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
由图1可以看出，所得菌剂为白色或淡黄色球形颗粒，粒径大小为3-5mm，表面光滑。
图2为本发明菌剂的透射电镜图，可以看出，以海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的交联产物为载体，可以形成粗糙的蜂窝状结构，便于菌株固定于载体上。
其中，菌剂中降解菌的含量，包埋材料的浓度均会影响所得菌剂的降解性能。选取对菌剂性能影响较大的4个因素(菌量，硅藻土含量，壳聚糖含量，聚乙烯醇含量)，采用4因素3水平设计正交试验(表1)，确定最优的固定化材料配比。
表1 4因素3水平正交试验设计(％，质量百分数)
Figure BDA0002574084690000051
9组试验制得的菌剂对20mg/L毒死蜱均有良好的降解效果(表2和表3)。
表2 不同试验制得的菌剂对20mg/L毒死蜱的一级降解动力学参数
编号 一级动力学方程 R2 半衰期(h)
1 C<sub>t</sub>＝20.06e<sup>-0.081t</sup> 0.983 8.51
2 C<sub>t</sub>＝20.39e<sup>-0.083t</sup> 0.967 8.37
3 C<sub>t</sub>＝20.64e<sup>-0.132t</sup> 0.920 5.24
4 C<sub>t</sub>＝20.78e<sup>-0.088t</sup> 0.969 7.84
5 C<sub>t</sub>＝19.57e<sup>-0.109t</sup> 0.962 6.35
6 C<sub>t</sub>＝20.32e<sup>-0.100t</sup> 0.980 6.93
7 C<sub>t</sub>＝20.40e<sup>-0.105t</sup> 0.983 6.58
8 C<sub>t</sub>＝20.55e<sup>-0.137t</sup> 0.982 5.06
9 C<sub>t</sub>＝21.23e<sup>-0.154t</sup> 0.930 4.51
表3 不同试验组合制备的菌剂的正交结果分析
Figure BDA0002574084690000052
Figure BDA0002574084690000061
由表2和表3可知，极差最大的为因素1与因素2，表明聚乙烯醇含量与菌量对菌剂的性能影响最大。从半衰期结果可以看出，试验9具有最好的降解性能，其材料组合为聚乙烯醇10％，菌量5％，硅藻土2％，壳聚糖1％，对应的所有材料的最佳重量比为菌量∶海藻酸钠∶硅藻土∶壳聚糖∶聚乙烯醇＝5∶2∶2∶1∶10。
对应于上述最佳配比，菌剂的制备方法如下：
1、将1g壳聚糖溶解于0.05mol/L的稀盐酸100mL中，加入2g硅藻土，室温条件下搅拌1h，用0.05mol/L NaOH调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体。
2、称取2g海藻酸钠和10g聚乙烯醇置于100mL无菌水中，在80℃水浴锅中溶解，加入制备好的壳聚糖-硅藻土复合载体，充分混匀，冷却至室温后，得到混合液。
3、向混合液中加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体，混合均匀，得到菌体包埋液。
4、将包埋液中滴入4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10mL，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
制备得到的菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
实施例2 菌剂在纯水与工业废水中对毒死蜱的降解
将1g按照实施例1最优配比制备的菌剂分别加入到20mL含有100mg/L毒死蜱的纯水与工业废水(取自山东潍坊某农药生产企业废水，水质指标如下：
COD：32500mg/L，BOD5：13000mg/L，Zn2+：84.5mg/L，Pb2+：74.4ug/L，Cd2+：9.3ug/L，NH3-N：55500mg/L，pH 9.2)中，在150r/min、37℃摇床中恒温振荡培养24h，每2h取样测定毒死蜱的残留浓度。
结果如图3所示，无论是在纯水中还是在高浓度的工业废水中，制备得到的菌剂均能够保持良好的降解效率，可以在24h内降解50％100mg/L毒死蜱。
实施例3 菌剂的重复使用
将1g按照实施例1最优配比制备的菌剂加入到20mL含有20mg/L毒死蜱的纯水中，在150r/min、37℃摇床中恒温振荡培养24h取样测定毒死蜱的残留浓度。将使用过的菌剂过滤，用灭菌水洗涤3次，再次加入到20mL含有20mg/L毒死蜱的纯水中，测定其降解效果，重复数次。
结果如图4所示，菌剂重复2次后，对毒死蜱降解率保持在90.0％以上；重复6次后，菌剂对毒死蜱的降解效率仍可以稳定在60％以上。
实施例1制备的菌剂在室温保存30天后，仍能保持降解活性。
实施例4 菌剂对其他有机磷杀虫剂的降解试验
将1g按照实施例1最优配比制备的菌剂加入到20mL含有20mg/L甲基对硫磷、辛硫磷、三唑磷、丙溴磷、水胺硫磷的纯水中，在150r/min、37℃摇床中恒温振荡培养24h，定时取样测定残留浓度。
结果如图5所示，菌剂对甲基对硫磷，辛硫磷也有很好的降解效果，1h可以完全降解20mg/L的甲基对硫磷，8h降解98％辛硫磷，48h降解93％丙溴磷，24h降解88％水胺硫磷，6h降解97％三唑磷。
实施例5 固定化材料的优化
常用的固定化菌剂制备机理是利用海藻酸钠与CaCl2反应生成凝胶小球，将降解菌株包埋在凝胶小球中。在此基础上添加壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇等吸附与交联材料可进一步提高菌剂对污染物的降解能力。单独使用海藻酸钠，与使用海藻酸钠-壳聚糖，海藻酸钠-硅藻土，海藻酸钠-聚乙烯醇制备得到的固定化菌剂对20mg/L毒死蜱降解动力学参数如表4所示。相比而言，本发明使用4种材料按最优配比混合制备的菌剂，降解性能进一步提高了1.925倍。
单独使用海藻酸钠为固定化材料(组1)，菌剂的制备方法如下：称取2g海藻酸钠溶解于100mL无菌水中，并加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体混合均匀，利用注射器逐滴将混合溶液加入到4％CaCl2水溶液中，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
使用壳聚糖为固定化材料(组2)，菌剂的制备方法如下：称取2g海藻酸钠与2g壳聚糖与溶解于100mL无菌水中，并加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体混合均匀，利用注射器逐滴将混合溶液加入到4％CaCl2水溶液中，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
使用硅藻土为固定化材料(组3)，菌剂的制备方法如下：称取2g海藻酸钠与2g硅藻土溶解于100mL无菌水中，并加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体混合均匀，利用注射器逐滴将混合溶液加入到4％CaCl2水溶液中，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
使用聚乙烯醇为固定化材料(组4)，菌剂的制备方法如下：称取2g海藻酸钠与10g聚乙烯醇溶解于100mL无菌水中，并加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体混合均匀，利用注射器逐滴将混合溶液加入到4％CaCl2-饱和硼酸水溶液中，4℃恒温静置交联24h，所得菌剂用去离子水洗净后置于4℃保存。
表4 单一材料制备菌剂对20mg/L毒死蜱的一级降解动力学参数
组别 固定化菌剂 一级动力学方程 R<sup>2</sup> 半衰期(h)
1 海藻酸钠 C<sub>t</sub>＝19.22e<sup>-0.072x</sup> 0.969 9.53
2 海藻酸钠-壳聚糖 C<sub>t</sub>＝20.21e<sup>-0.079x</sup> 0.994 8.80
3 海藻酸钠-硅藻土 C<sub>t</sub>＝23.22e<sup>-0.087x</sup> 0.576 7.97
4 海藻酸钠-聚乙烯醇 C<sub>t</sub>＝21.52e<sup>-0.080x</sup> 0.987 8.67
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于降解有机磷杀虫剂的菌剂，其特征在于，所述菌剂是以海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的交联产物为载体，与保藏编号为CCTCC NO：M2010233的台湾嗜铜菌X1(Cupriavidus taiwanensis X1)混合而成。
2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的重量比为2∶1-3∶1-3∶8-10；
台湾嗜铜菌X1的含量为108-109CFU/g。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中海藻酸钠、壳聚糖、硅藻土和聚乙烯醇的重量比为2∶1∶2∶10；
台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
4.用于降解有机磷杀虫剂的菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
1)将1-3g壳聚糖溶解于0.05mol/L稀盐酸100mL中，加入1-3g硅藻土，室温搅拌1h，用0.05mol/L NaOH溶液调节体系pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体；
2)将2g海藻酸钠和8-10g聚乙烯醇置于100mL水中，在80℃水浴锅中溶解，向其中加入上述壳聚糖-硅藻土复合载体，混匀，冷却至室温，得到混合液；
3)向上述混合液中加入保藏编号为CCTCC NO：M2010233的台湾嗜铜菌X1湿菌体，混匀，得到菌体包埋液；
4)向上述菌体包埋液中滴加4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10-15mL，4℃恒温静置交联24h，所得产物用水清洗，即得菌剂；
所述菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为108-109CFU/g。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：
1)将1g壳聚糖溶解于0.05mol/L稀盐酸100mL中，加入2g硅藻土，室温搅拌1h，用0.05mol/L NaOH溶液调节体系pH至中性，离心收集沉淀，干燥后研磨，过200目筛，得到壳聚糖-硅藻土复合载体；
2)将2g海藻酸钠和10g聚乙烯醇置于100mL无菌水中，在80℃水浴锅中溶解，向其中加入上述壳聚糖-硅藻土复合载体，混匀，冷却至室温，得到混合液；
3)向上述混合液中加入5g台湾嗜铜菌X1湿菌体，混匀，得到菌体包埋液；
4)向上述菌体包埋液中滴加4％CaCl2-饱和硼酸水溶液10mL，4℃恒温静置交联24h，所得产物用无菌水清洗，即得菌剂；
所述菌剂中台湾嗜铜菌X1的含量为109CFU/g。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述台湾嗜铜菌X1湿菌体的制备方法包括：从冻存管中挑取一环菌株X1划线于LB固体培养基中，37℃恒温培养24h；挑取单菌落于100mL LB液体培养基中，140r/min 37℃恒温振荡培养12h，获得菌悬液；6000r/min离心5min收集菌体，用无菌水清洗，即得。
7.权利要求1-3任一项所述菌剂、或按照权利要求4-6任一项所述方法制备的菌剂在降解有机磷杀虫剂中的应用；
优选地，所述有机磷杀虫剂选自毒死蜱、辛硫磷、水胺硫磷、丙溴磷、三唑磷、甲基对硫磷中的至少一种。
8.权利要求1-3任一项所述菌剂、或按照权利要求4-6任一项所述方法制备的菌剂在有机磷杀虫剂污染原位修复中的应用；
优选地，所述有机磷杀虫剂选自毒死蜱、辛硫磷、水胺硫磷、丙溴磷、三唑磷、甲基对硫磷中的至少一种。
9.权利要求1-3任一项所述菌剂、或按照权利要求4-6任一项所述方法制备的菌剂在重金属离子胁迫下降解有机磷杀虫剂中的应用，其中，所述重金属离子选自Pb2+、Zn2+和Cd2+中的至少一种。
10.权利要求1-3任一项所述菌剂、或按照权利要求4-6任一项所述方法制备的菌剂在降解污水中有机磷杀虫剂中的应用，其中，所述污水的COD为0-32500mg/L，BOD5为0-13000mg/L，NH3-N含量为0-55500mg/L，pH为5-10。
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