CN113956995B - 甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶 - Google Patents

甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲基硫菌灵降解菌，其菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。本发明属于环保生物技术领域，本发明通过运用亲和层析技术，从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液中分离纯化得到该菌株降解甲基硫菌灵的甲基硫菌灵降解酶，在分离纯化得到甲基硫菌灵降解酶的基础上，运用固定化技术获得了可多次使用的固定化甲基硫菌灵降解酶，该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态果蔬产品中的甲基硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，对于环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。

Description

甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶
技术领域
本发明属于环保生物技术领域，尤其涉及甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶。
背景技术
甲基硫菌灵商品名称为甲基托布津，是一种具有内吸性强、低毒的强力杀菌剂，具有内吸和预防病原菌的作用，能够有效防治蔬菜、花卉、果树、麦类等多种作物的病害，主要用于烟草白粉病、番茄叶霉病、柑橘炭疽病等的防治。甲基硫菌灵的作用机理是：干扰病原菌的有丝分裂中纺锤体的形成，使病菌孢子萌发长出的芽管扭曲异常，芽管细胞壁扭曲等，因此病菌就不能正常生长，从而达到杀菌效果。
随着人们生活水平的不断提高，人们对食品的安全问题也是越来越重视。由于广泛、大量和长期使用甲基硫菌灵，导致果蔬中该农药残留量严重超标，而食用农残超标的蔬菜水果等食品产生的事故也屡见不鲜。农残仍是当今世界格外关注的一大食品安全问题，为有效控制食品中的各种农药残留，各国家地区和组织机构不断完善农药管理制度及残留限量标准，同时不断研发新型降低农残的技术。目前国内外用于农药残留降解的方法分为物理方法、化学方法、微生物降解方法，其中物理方法主要有超声波技术、吸附等，化学方法主要有水解、氧化分解和光化学降解等，生物降解方法主要有微生物、降解酶和工程菌等。微生物降解法是大家公认的一种有效、廉价、无二次污染的方法，具有操作简便、繁殖快、生态恢复性好等优点。迄今为止，各国科研人员已经从土壤、污泥、污水、天然水体、垃圾场和厩肥中分离到降解多种农药的活性微生物。
现有技术已有甲基硫菌灵的降解菌筛选相关报道，马俊红,周厚发,雷丽萍,等发表了题为“甲基硫菌灵降解菌的筛选与鉴定”的论文。然而，尚未发现有对菌株中降解酶分离纯化并固定后应用于食品农残消除的报道。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明以甲基硫菌灵为唯一碳源，从甲基硫菌灵污染土壤中筛选出一株可以降解甲基硫菌灵的菌株，经鉴定后命名为芽孢杆菌(Bacillussp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
亲和层析是一种分离纯化生物大分子尤其是蛋白质的一种极有效的方法，最大的特点是具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，并保持较高的活性，产率也高达75％以上。它是根据不同蛋白质对特定配体的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的，通过预分离的样品时，对层析柱上的配基有亲和力的目标物质利用之间的疏水、氮键、静电、弱共价、金属配位、结构互补等作用吸附在固相载体上，经洗脱得到目标物。
进一步地，本发明通过亲和层析技术及飞行质谱检测从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液中分离纯化和鉴定了该菌株降解甲基硫菌灵的蛋白酶，并利用固定化技术获得了可多次使用的固定化甲基硫菌灵降解酶。该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态果蔬产品中的甲基硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，对于环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。
一个方面，本发明提供甲基硫菌灵降解菌，其菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
另一个方面，本发明还提供甲基硫菌灵降解酶，分离自所述甲基硫菌灵降解菌的发酵液，属于二氢脂酰脱氢酶。
优选地，甲基硫菌灵降解酶，共含470个氨基酸，其氨基酸序列为：
MVVGDFPIETDTLVIGAGPGGYVAAIRAAQLGQKVTVVEKATLGGVCLNVGCIPSKALINAGHRYENAKHSDDMGITAENVSVDFTKVQEWKASVVNKLTGGVAGLLKGNKVDVVKGEAYFVDSNSVRVMDENSAQTYTFKNAIIATGSRPIELPNFKYTERVLNSTGALALKEIPKKLVVIGGGYIGTELGTAYANFGTELVILEGGDEILPGFEKQMSSLVTRRLKKKGNVEIHTNAMAKGVEEKSDGVTVTFEVKGEEKTVDADYVLITVGRRPNTDELGLEQVGIEMTDRGVVKTDKQCRTNVPNIYAIGDIIEGPPLAHKASYEGKIAAEAIAGEPAEIDYLGIPAVVFSEPELASVGYTEAQAKEEGLDIVAAKFPFGANGRALSLNETDGFMKLITRKEDGLVIGAQIAGASASDMISELSLAIEGGMTAEDIAMTIHAHPTLGEITMEAAEVAIGSPIHIVK，即SEQ ID NO：1。
再一个方面，本发明还提供固定化甲基硫菌灵降解酶，其制备方法包括如下步骤：
1)将甲基硫菌灵降解酶酶粉用水复溶，制备成8～12mg/mL的酶溶液；
2)在38～42℃水浴中，配制2％～4％质量百分含量的海藻酸钠溶液，并加入所述酶溶液中，搅拌均匀，得到酶-海藻酸钠混合液；
3)在38～42℃水浴中，将壳聚糖溶于4％～6％质量百分含量的乙酸水溶液中，然后加入0.2～0.4moL/L的CaCl2溶液，得到壳聚糖-CaCl2混合液；在搅拌条件下，将所述酶-海藻酸钠混合液滴入所述壳聚糖-CaCl2混合液中，反应完成后，过滤，得到圆球状固定化酶颗粒；
4)将所述圆球状固定化酶颗粒转移到0.2％～0.4％质量百分含量的戊二醛溶液中，交联，洗涤，得到固定化甲基硫菌灵降解酶。
优选地，所述搅拌条件的转速为160～200rpm。
优选地，所述交联的条件为3～5℃、交联5～8h。
此外，本发明还提供固定化甲基硫菌灵降解酶在果蔬农残、废水农残的生物降解中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明以甲基硫菌灵为唯一碳源，从甲基硫菌灵污染土壤中筛选出一株可以降解甲基硫菌灵的菌株，经鉴定后命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
(2)本发明通过运用亲和层析技术，从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液中分离纯化得到该菌株降解甲基硫菌灵的甲基硫菌灵降解酶，再运用飞行质谱检测确证其氨基酸序列，并进行了三维建模结构分析。
(3)在分离纯化得到甲基硫菌灵降解酶的基础上，运用固定化技术获得了可多次使用的固定化甲基硫菌灵降解酶，该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态果蔬产品中的甲基硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，产业化推广应用价值高，对于环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。
附图说明
图1芽孢杆菌(Bacillus sp)J2的菌落形态和镜检形态图。
图2甲基硫菌灵耐受菌16S保守序列相似度分析的系统发育树图。
图3亲和层析不同收集管OD值变化图。
图4甲基硫菌灵降解酶SDS-PAGE凝胶电泳图。
图5甲基硫菌灵降解酶同源性进化树图。
图6甲基硫菌灵降解酶结构示意图。
图7甲基硫菌灵与甲基硫菌灵降解酶分子对接示意图。
图8固定化甲基硫菌灵降解酶降解甲基硫菌灵的HPLC检测图；其中，上图为甲基硫菌灵标准品的HPLC检测图，下图为固定化甲基硫菌灵降解酶处理甲基硫菌灵标准品后的HPLC检测图。
图9固定化甲基硫菌灵降解酶重复使用多次的酶活变化率检测图。
芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，于2021年5月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1：甲基硫菌灵梯度培养、目标菌纯化和鉴定
在喷施过甲基硫菌灵的田间，取三处不同区域的土壤各25g，分别溶于225mL超纯水中，充分震荡后静置取上清液1mL于小锥形瓶中，准确吸取9mL超纯水加入该锥形瓶中。按照上述操作将三处土壤稀释液浓度稀释至10-3即可。配制300mL缺少碳源的无机盐培养基，均分装入三个锥形瓶中，在无菌条件下，按照0.05g/100mL、0.25g/100mL、0.5g/100mL的浓度分别将甲基硫菌灵加入上述三个锥形瓶中，每个浓度需要倒4个平板，上述浓度梯度分别为甲基硫菌灵有效浓度的1倍、5倍和10倍。其中三个平板分别加入三处土壤稀释液0.1mL后将其涂布，剩余的一个平板作为空白对照。将涂布好的平板置于28℃恒温箱内培养并观察其菌落生长情况。
缺少碳源的无机盐培养基的配制：取(NH4)2SO4 1.0、KH2PO4 0.5、K2HPO4 1.5、MgSO40.2、NaCl 1.0溶于蒸馏水，并定容至1L，灭菌。
上述平板内培养出一株细菌，经鉴定后备命名为J2，将其转接到LB琼脂培养基上于37℃恒温箱内培养。为了防止其被杂菌污染，在培养基中加入0.5倍甲基硫菌灵。待培养基中纯化出单菌落，用封口膜将平板密封后转入4℃冰箱内保存。
甲基硫菌灵降解菌J2的16S rDNA序列如下：
ACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAAAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCGAAGGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCAAGCAGTTACTCTTGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGC，即SEQID NO：2。
芽孢杆菌(Bacillus sp)J2的菌落形态和镜检形态如图1所示。将J2的单菌落16SrDNA序列在NCBI上对比并构建系统发育树，如图2所示，发现J2与Bacullus CS16-13同源性最高。
实施例2：甲基硫菌灵降解酶的分离纯化
2.1亲和层析柱的制备：
1)准确吸取16mLSepharose4FF琼脂糖凝胶(沉降体积)，在G4砂芯漏斗中用10～20倍体积的去离子水将乙醇洗涤干净，并用真空泵真空抽滤至无水滴滴下。将漏斗中被抽干的介质转移至50mL锥形瓶内，向介质中依次加入20％、50％、70％体积百分含量的二甲基亚砜水溶液各20mL，搅拌清洗5min，然后真空抽滤掉清洗液，向抽干后的介质中依次加入二甲基亚砜15mL、环氧氯丙烷10mL和0.96g氢氧化钠。将上述悬浮液置于40℃恒温振荡箱中，150rpm振荡反应6h。反应结束后将反应混合物倒入砂芯漏斗中用10～20倍体积的去离子水清洗至无环氧基测出为止。琼脂糖凝胶上的环氧基修饰度检测用硫代硫酸钠滴定法检测定，每次测定取三份样品进行平行测定再取平均值。
2)甲基硫菌灵与琼脂糖凝胶CL-4B的偶联。取已经活化好的琼脂糖凝胶用去离子水溶胀30min，并真空抽干，转入小锥形瓶中。称取0.013g甲基硫菌灵加入12.5mL的0.05moL/L的碳酸盐溶液中，搅拌使其充分溶解，然后将该溶液倒入装有活化好的琼脂糖凝胶介质的锥形瓶中。将该锥形瓶置于37℃恒温振荡箱中110rpm振荡反应20h，让配基(甲基硫菌灵)与介质偶联。在上述溶液中加入1moL/L的乙醇胺溶液，于37℃恒温振荡箱中110rpm振荡反应4h来封闭剩余未反应的羟基基团。将与甲基硫菌灵偶联完的凝胶填料装于柱中，加入两倍柱床体积的20％乙醇置于4℃冰箱保存备用。让甲基硫菌灵与介质偶联是为了减少空间位阻，提高吸附特异蛋白的能力。
3)测定琼脂糖凝胶CL-4B的活化度以及甲基硫菌灵与琼脂糖凝胶CL-4B的偶联率。
式中，S为环氧基修饰密度(moL/L)；CHCL为盐酸标准溶液的浓度(moL/L)；V0为盐酸的初始体积(mL)；V1为滴定后盐酸的剩余体积(mL)；m为活化介质的质量(g)；ρ为介质密度取1.02g/mL。
本发明试验条件下，琼脂糖凝胶CL-4B活化度平均可达到229.73μmoL/mL。将甲基硫菌灵溶液与其偶联，通过计算，得到自制亲和层析柱配基的偶联量达到45μmoL/mL。
2.2亲和层析柱纯化甲基硫菌灵降解酶：
1)配制浓度为0.1mg/mL的BSA标准溶液，分别取6支1.5mL离心管，其中一支加入125μL考马斯亮蓝G-250和25μL去离子水作为空白，另外5支分别向内加入125μL考马斯G-250染液，然后分别向内加入不同体积浓度为0.1mg/mL的牛血清白蛋白标准液，最后补充去离子水至150μL。将6支离心管静置5min之后在紫外分光光度计下测定其OD595值。
2)通过1)中所绘制蛋白标准曲线所得得到的线性回归方程为y＝0.0751x+0.1071，R2＝0.9921。取1支1.5mL离心管，加入125μL考马斯亮蓝G-250和25μL去离子水，最后加入10μL待测的J2号菌发酵上清液，静置5min之后利用紫外分光光度计检测其OD595值为0.169，带入回归方程，得到上清液总蛋白浓度为0.08μg/μL。
3)将J2号菌37℃、180rpm摇床培养24h的发酵上清液通过亲和层析柱之后，利用1×PBS缓冲液冲洗柱子，将杂蛋白清洗下来。待亲和柱流出液OD280值稳定在基线时，说明杂蛋白已经被清除干净。改用0.1moL/L的碳酸盐溶液过柱子后，层析柱环境中pH值发生改变，与甲基硫菌灵结合的转化酶会脱离出来，重新成为游离态，并且被洗脱下来，洗脱所得8管洗脱液的OD值记录见图3。
如图3所示，刚开始洗脱时，由于洗脱液碳酸盐溶液并未完全浸润亲和层析柱，所以检测到的蛋白含量比较低，但呈现上升趋势，在收集了4管之后，洗脱液中的蛋白含量上升到最高值，即收集到第5管时，洗脱液中的蛋白含量为最高，其OD280值为0.141，之后洗脱液中蛋白含量开始逐渐降低。可以得知，从亲和层析柱上洗脱下来的蛋白质浓度呈现出一个先升后降的趋势，并且存在一个峰值，峰值为0.141。
2.3 SDS-PAGE凝胶电泳：
将经过亲和层析纯化的蛋白液合并成一管，通过透析除盐、冷冻干燥浓缩后，利用SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，结果见图4所示。该结果表明，经过亲和层析获得的目的蛋白纯度较高。
实施例3：甲基硫菌灵降解酶的鉴定
将含有目标蛋白(甲基硫菌灵降解酶)的SDS-PAGE凝胶条带通过脱色、溶胶、酶切等，获得转化酶酶解溶液，于基质辅助激光解析电离飞行质谱仪(MALDI-TOF/TOF-MS)上分析，然后将所得分析数据于NCBI数据库内进行搜库和匹配。结果表明，该目标菌为枯草芽孢杆菌，该目标蛋白为dihydrolipoyl dehydrogenase(NCBI Reference Sequence:WP_148963694.1)，属于二氢脂酰脱氢酶，共有470个氨基酸，理论分子量为49.67KDa，与SDS-PAGE凝胶电泳结果一致。其氨基酸序列为：
MVVGDFPIETDTLVIGAGPGGYVAAIRAAQLGQKVTVVEKATLGGVCLNVGCIPSKALINAGHRYENAKHSDDMGITAENVSVDFTKVQEWKASVVNKLTGGVAGLLKGNKVDVVKGEAYFVDSNSVRVMDENSAQTYTFKNAIIATGSRPIELPNFKYTERVLNSTGALALKEIPKKLVVIGGGYIGTELGTAYANFGTELVILEGGDEILPGFEKQMSSLVTRRLKKKGNVEIHTNAMAKGVEEKSDGVTVTFEVKGEEKTVDADYVLITVGRRPNTDELGLEQVGIEMTDRGVVKTDKQCRTNVPNIYAIGDIIEGPPLAHKASYEGKIAAEAIAGEPAEIDYLGIPAVVFSEPELASVGYTEAQAKEEGLDIVAAKFPFGANGRALSLNETDGFMKLITRKEDGLVIGAQIAGASASDMISELSLAIEGGMTAEDIAMTIHAHPTLGEITMEAAEVAIGSPIHIVK，即SEQ ID NO：1。
将目标蛋白氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST序列同源分析，获取同源性最高的10种蛋白质氨基酸序列，利用MEGA-X构建与目标蛋白同源的系统进化树，如图5所示。与目标蛋白同源性最高的蛋白为同样来源于芽孢杆菌属微生物的二氢脂酰脱氢酶(NCBIReference Sequence：WP_202656970.1)。
将目标蛋白的氨基酸序列导入phyre2(Protein Fold Recognition Server)中，以远程同源检测方法来构建转化酶三维模型结构。如图6所示，phyre2分析结果表明，该结构除了前6个氨基酸以及后8个氨基酸的建模可信度不高，其余部分结构的正确性可信度均在90％以上(精度为)，达到了蛋白结构实验验证水准。该酶由8个长α结构、5个短α结构以及17个β结构构成，在靠中心的位置有一个明显的空腔，为反应活性中心。
采用Chemidraw构建甲基硫菌灵并使用经典MM3力场和半经验PM6力场进行优化，确保分子以最佳的活性形式存在。然后利用AutoDock-Vina就目标蛋白与甲基硫菌灵分子进行分子对接分析，结果如图7所示。甲基硫菌灵分子恰好处于目标蛋白活性空腔内，且分子与目标蛋白的结合能为-6.5kcal/moL，说明这种结合是有利的。
实施例4：固定化甲基硫菌灵降解酶
采用海藻酸钠-壳聚糖制备固定化甲基硫菌灵降解酶，具体制备方法包括如下步骤：将甲基硫菌灵降解酶酶粉复溶，制备成0.5mL 10mg/mL的酶溶液；在40℃水浴中配制3％质量百分含量的海藻酸钠溶液5mL，并加入酶溶液，搅拌均匀；同样在40℃水浴中，将0.1g壳聚糖溶于5mL 5％质量百分含量的乙酸水溶液中，然后加入1mL 0.3moL/l的CaCl2溶液，于40℃、180rpm转速的恒温搅拌器中，将酶-海藻酸钠混合液滴入壳聚糖-CaCl2混合液中，滴完酶液后，相同条件下继续反应30min，反应完成后过滤获得圆球状固定化酶颗粒，将其转移到0.3％质量百分含量的戊二醛溶液中，于4℃下交联6h；分别用0.1moL/L碳酸氢钠(pH＝8.0)、0.1moL/L氯化钠、0.1moL/L乙酸钠和0.1moL/L Tris-HCl(pH＝8.0)洗涤固定化酶颗粒，清洗过程中，始终将固定化酶置于摇床上轻轻震荡，清洗液用量为固定化酶体积的5倍，每两种清洗液之间用双蒸水清洗2次，最后再用双蒸水清洗，于低温保藏。
采用HPLC分析固定化甲基硫菌灵降解酶对甲基硫菌灵的降解能力。按0.2mg/mL配制甲基硫菌灵的双蒸水溶液2管，每管1mL，其中一管加入1mg固定化酶，于37℃轻微震荡孵育2h，另一管作为对照。HPLC检测条件包括：色谱柱为Kromasil 100-5-C18(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇:水(60:40，v/v)，流速0.5mL/min，波长270nm，柱温25℃，进样量20μL。HPLC检测结果图如图8所示，经过固定化甲基硫菌灵降解酶处理后，溶液中的甲基硫菌灵全部被降解。
采用紫外分光光度计对酶活力进行检测。结果表明，固定化甲基硫菌灵降解酶的比酶活可以达到0.84U/mg(按固定化酶质量计)，显著提高。另外，通过对固定化甲基硫菌灵降解酶重复使用后的酶活变化率检测分析，如图9可知，该固定化酶每次使用后效果减弱程度较低，至少可以使用7次以上，且酶活只降低了不到20％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
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序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 470
<212> PRT
<213> Bacillus sp
<400> 1
Met Val Val Gly Asp Phe Pro Ile Glu Thr Asp Thr Leu Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Val Ala Ala Ile Arg Ala Ala Gln Leu Gly
20 25 30
Gln Lys Val Thr Val Val Glu Lys Ala Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu
35 40 45
Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Ile Asn Ala Gly His Arg
50 55 60
Tyr Glu Asn Ala Lys His Ser Asp Asp Met Gly Ile Thr Ala Glu Asn
65 70 75 80
Val Ser Val Asp Phe Thr Lys Val Gln Glu Trp Lys Ala Ser Val Val
85 90 95
Asn Lys Leu Thr Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Lys Gly Asn Lys Val
100 105 110
Asp Val Val Lys Gly Glu Ala Tyr Phe Val Asp Ser Asn Ser Val Arg
115 120 125
Val Met Asp Glu Asn Ser Ala Gln Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Ala Ile
130 135 140
Ile Ala Thr Gly Ser Arg Pro Ile Glu Leu Pro Asn Phe Lys Tyr Thr
145 150 155 160
Glu Arg Val Leu Asn Ser Thr Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Ile Pro
165 170 175
Lys Lys Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Thr Glu Leu Gly
180 185 190
Thr Ala Tyr Ala Asn Phe Gly Thr Glu Leu Val Ile Leu Glu Gly Gly
195 200 205
Asp Glu Ile Leu Pro Gly Phe Glu Lys Gln Met Ser Ser Leu Val Thr
210 215 220
Arg Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asn Val Glu Ile His Thr Asn Ala Met
225 230 235 240
Ala Lys Gly Val Glu Glu Lys Ser Asp Gly Val Thr Val Thr Phe Glu
245 250 255
Val Lys Gly Glu Glu Lys Thr Val Asp Ala Asp Tyr Val Leu Ile Thr
260 265 270
Val Gly Arg Arg Pro Asn Thr Asp Glu Leu Gly Leu Glu Gln Val Gly
275 280 285
Ile Glu Met Thr Asp Arg Gly Val Val Lys Thr Asp Lys Gln Cys Arg
290 295 300
Thr Asn Val Pro Asn Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Ile Glu Gly Pro
305 310 315 320
Pro Leu Ala His Lys Ala Ser Tyr Glu Gly Lys Ile Ala Ala Glu Ala
325 330 335
Ile Ala Gly Glu Pro Ala Glu Ile Asp Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Val
340 345 350
Val Phe Ser Glu Pro Glu Leu Ala Ser Val Gly Tyr Thr Glu Ala Gln
355 360 365
Ala Lys Glu Glu Gly Leu Asp Ile Val Ala Ala Lys Phe Pro Phe Gly
370 375 380
Ala Asn Gly Arg Ala Leu Ser Leu Asn Glu Thr Asp Gly Phe Met Lys
385 390 395 400
Leu Ile Thr Arg Lys Glu Asp Gly Leu Val Ile Gly Ala Gln Ile Ala
405 410 415
Gly Ala Ser Ala Ser Asp Met Ile Ser Glu Leu Ser Leu Ala Ile Glu
420 425 430
Gly Gly Met Thr Ala Glu Asp Ile Ala Met Thr Ile His Ala His Pro
435 440 445
Thr Leu Gly Glu Ile Thr Met Glu Ala Ala Glu Val Ala Ile Gly Ser
450 455 460
Pro Ile His Ile Val Lys
465 470
<210> 2
<211> 1354
<212> DNA
<213> Bacillus sp
<400> 2
acctcaccga cttcgggtgt tgcaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca 120
gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg tgggattggc taaaccttgc 180
ggtctcgcag ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttaaagt 300
gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgtc cccgaaggga 420
aagccctatc tctagggttg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc 600
ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg 720
ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc 780
tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc 840
acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt 900
gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta 960
ccgtcaaggt gcaagcagtt actcttgcac ttgttcttcc ctaacaacag agctttacga 1020
tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc attgcggaag 1080
attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag tgtggccgat 1140
caccctctca ggtcggctac gcatcgttgc cttggtgagc cgttacctca ccaactagct 1200
aatgcgccgc gggtccatct gtaagtgaca gccgaaaccg tctttcatcc ttgaaccatg 1260
cggttcaagg aactatccgg tattagctcc ggtttcccgg agttatccca gtcttacagg 1320
caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgc 1354

Claims (1)

1.固定化甲基硫菌灵降解酶在果蔬农残、废水农残的生物降解中的应用，其特征在于：所述农残为甲基硫菌灵，所述固定化甲基硫菌灵降解酶的制备方法包括如下步骤：
1）将甲基硫菌灵降解酶酶粉用水复溶，制备成8~12 mg/mL的酶溶液；
2）在38~42℃水浴中，配制2%~4%质量百分含量的海藻酸钠溶液，并加入所述酶溶液中，搅拌均匀，得到酶-海藻酸钠混合液；
3）在38~42℃水浴中，将壳聚糖溶于4%~6%质量百分含量的乙酸水溶液中，然后加入0.2~0.4 moL/L的CaCl2溶液，得到壳聚糖- CaCl2混合液；在搅拌条件下，将所述酶-海藻酸钠混合液滴入所述壳聚糖- CaCl2混合液中，反应完成后，过滤，得到圆球状固定化酶颗粒；
4）将所述圆球状固定化酶颗粒转移到0.2%~0.4%质量百分含量的戊二醛溶液中，交联，洗涤，得到固定化甲基硫菌灵降解酶；
所述甲基硫菌灵降解酶分离自甲基硫菌灵降解菌的发酵液，属于二氢脂酰脱氢酶，共含470个氨基酸，其氨基酸序列为：
MVVGDFPIETDTLVIGAGPGGYVAAIRAAQLGQKVTVVEKATLGGVCLNVGCIPSKALINAGHRYENAKHSDDMGITAENVSVDFTKVQEWKASVVNKLTGGVAGLLKGNKVDVVKGEAYFVDSNSVRVMDENSAQTYTFKNAIIATGSRPIELPNFKYTERVLNSTGALALKEIPKKLVVIGGGYIGTELGTAYANFGTELVILEGGDEILPGFEKQMSSLVTRRLKKKGNVEIHTNAMAKGVEEKSDGVTVTFEVKGEEKTVDADYVLITVGRRPNTDELGLEQVGIEMTDRGVVKTDKQCRTNVPNIYAIGDIIEGPPLAHKASYEGKIAAEAIAGEPAEIDYLGIPAVVFSEPELASVGYTEAQAKEEGLDIVAAKFPFGANGRALSLNETDGFMKLITRKEDGLVIGAQIAGASASDMISELSLAIEGGMTAEDIAMTIHAHPTLGEITMEAAEVAIGSPIHIVK，即SEQ ID NO：1；
所述甲基硫菌灵降解菌的菌株名称为芽孢杆菌（Bacillus sp）J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
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马俊红等.甲基硫菌灵降解菌的筛选与鉴定.江苏农业科学.2019,第47卷(第47期),摘要，第299-300页2.3，第302页左栏最后1段-右栏第1段，表3. *

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