CN113583896A - 一种霍氏肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT‑2，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2021025；本发明涉及的霍氏肠杆菌SRT‑2具有耐高盐、高氯、碱性等特性，接种霍氏肠杆菌SRT‑2的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除具有明显的提高效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌及其应用。
背景技术
霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)，属于革兰氏阴性肠道杆菌，据报道能够引起人类或动物的腹泻、肠炎、胃肠道感染等，为一种兼性厌氧微生物。同样，也有文献报道霍氏肠杆菌可被用于降解农业废弃物，特别是在木质素高效降解中具有良好的应用潜力，例如专利文献CN201811358426.9、CN201811358429.2、CN201811344459.8中公开的相关内容。
目前国内处理环氧丙烷废水主要是生物法，通过对废水的冷却、沉降、曝气等处理使其达到污水的国家排放标准。其中最主要的环节是通过活性污泥里的微生物对污水中有机污染物进行降解，但是一般情况下高浓度的含氯废水对微生物具有毒害作用，主要表现在废水的高渗透压破坏了微生物的细胞膜和膜内酶，使其菌株的代谢能力受到影响。因此环氧丙烷废水在处理前先要经过稀释，降低氯离子浓度后，才能进行废水处理，从而造成了稀释用水的大量浪费。通过在自然环境中筛选耐盐微生物，配合原有的活性污泥，实现对环氧丙烷皂化废水原液COD的有效降解，能够减轻下游处理过程的压力，进一步降低水处理成本。
环氧丙烷是重要的化工原料，大量用于生产丙二醇、聚醚、表面活性剂等，是仅次于聚丙烯和丙烯晴的第三大丙烯衍生物。目前，世界丙烯消耗量的8％用于生产环氧丙烷。目前国内企业的环氧丙烷生产线都采用氯醇法生产工艺，通过该工艺产生的废水具有温度高、pH值高、氯根含量高、COD含量高、悬浮物含量高的“五高”特点，废水进水水温一般在30～40℃，pH值为9～11，CaCl2浓度约为3.5％～4.0％，COD约为1000mg/L，氯离子浓度约为23000-25000mg/L。成分的复杂性决定了它难以处理，并且每生产1吨环氧丙烷就产生约50吨皂化废水，废水量非常大，因此如何有效的处理废水中的COD是公司环保治理的最大难点和需要迫切解决的问题。
中国专利文献CN104388343A(申请号：201410608052.7)公开了一种用于处理高盐工业废水的微生物菌群；该发明针对高盐废水中盐分含量高、色度大，污染物复杂及COD高，BOD低，生化性质差的特征，进行功能菌群的筛选、驯化、复配和应用效果验证，得到了一个活性菌群，群落组成，即霍氏肠杆菌、巨大芽孢杆菌、日本色盐杆菌、先河盐单胞菌、吲哚金黄杆菌和生孢梭菌的数量比为2:2:1:1:1:1进行复配。但是，该发明公开的是通过筛选、驯化获得一个菌群，并未涉及霍氏肠杆菌的生长特性以及单独使用霍氏肠杆菌进行含高氯污水处理的应用研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种霍氏肠杆菌及其应用。
本发明涉及的霍氏肠杆菌具有高效去除环氧丙烷皂化污水中COD的作用，COD去除率为78.19％。
本发明针对环氧丙烷皂化废水的处理，从环氧丙烷皂化废水的活性污泥中筛选获得一株霍氏肠杆菌，经检测其具备高效降解环氧丙烷皂化废水COD的特性，可作为正常环氧丙烷皂化废水污泥的添加剂，提高其处理效果。
环氧丙烷造化废水是指使用氯醇法生产环氧丙烷时产生的废水。
本发明的技术方案如下：
一种霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2021025。
霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2以下简称“霍氏肠杆菌SRT-2”
上述霍氏肠杆菌SRT-2的形态特征：霍氏肠杆菌为革兰氏阴性、短杆状、周生鞭毛、兼性厌氧，其革兰氏染色情况如图1所示。
上述霍氏肠杆菌SRT-2的制备方法，包括如下步骤：
取霍氏肠杆菌SRT-2接种于固体培养基上，25-37℃倒置活化培养20-36h，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm培养12-18h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1-3％转接至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm扩大培养12-18h，制得霍氏肠杆菌SRT-2菌液。
根据本发明优选的，上述制备方法中，所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。
上述霍氏肠杆菌SRT-2在废水处理中的应用。
根据本发明优选的，上述霍氏肠杆菌SRT-2在含高盐废水处理中的应用。
进一步优选的，上述霍氏肠杆菌SRT-2在含高盐、高氯、碱性废水处理中的应用。
进一步优选的，上述霍氏肠杆菌SRT-2在含盐度(W/V)11％以下废水处理中的应用。
进一步优选的，上述霍氏肠杆菌SRT-2在环氧丙烷皂化废水处理中的应用。
有益技术效果
本发明涉及的霍氏肠杆菌SRT-2具有耐高盐、高氯、碱性等特性，接种霍氏肠杆菌SRT-2的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除具有明显的提高效果，去除率为78.19％，48h的去除速率12.1mg/(L·h)。
附图说明
图1为霍氏肠杆菌SRT-2的革兰氏染色图片；
图2为霍氏肠杆菌SRT-2的系统进化树；
图3为霍氏肠杆菌SRT-2在不同盐度条件下的生长曲线图；
图4为霍氏肠杆菌SRT-2在不同pH条件下的生长曲线图；
图5为环氧丙烷皂化污水活性污泥与接种霍氏肠杆菌SRT-2的环氧丙烷皂化污水活性污泥对环氧丙烷皂化污水的COD处理效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明内容的保护范围不局限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为普通市售产品。
实施例1
霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2的筛选，包括如下步骤：
菌株筛选自环氧丙烷皂化废水剩余污泥，取1mL剩余污泥样品，置于150mL无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水50mL，无菌玻璃珠2g，在25℃、180rpm条件下震荡15分钟，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，分别吸取100μL稀释液涂布至含有氯化钠质量浓度为5％、8％、10％的无菌LB固体培养基平板上，在25℃条件下静置培养2d，挑取生长快、菌落大的克隆至50mL含有氯化钠质量浓度为10％的LB液体培养基，在25℃、180rpm条件下培养2d，之后吸取100μL菌液涂布至含有氯化钠浓度为10％的无菌LB固体培养基，挑取单克隆。
直接取单克隆的菌苔作为模板，以27F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG SEQ IDNO.2)和1492R(TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T SEQ ID NO.3)作为引物，利用PCR获得16S rDNA序列。PCR反应体系如下(50μL)见表1：
表1
菌落PCR程序参数设定如下所示：
PCR产物利用Omega胶回收试剂盒回收后送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，其16S rDNA序列含有1482bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank数据库进行BLAS(网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，并构建其系统进化树，如图2所示，结果表明该菌属于Stenotrophornonas rhizophila，命名为霍氏肠杆菌SRT-2。
霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2021025。
实施例2
霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2的发酵培养方法，包括如下步骤：
取霍氏肠杆菌SRT-2划线于LB固体培养基上，25℃倒置活化培养1天，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，25℃、200rpm摇床培养12h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1％转接至LB液体培养基中，25℃、200rpm扩大培养12h，制得菌液，经检测，菌液的菌体浓度为5.5×109cfu/mL。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
固体培养基为LB固体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，定容至1L，pH自然。
实验例
(1)霍氏肠杆菌SRT-2在不同盐度条件下的生长情况
取0.1mL霍氏肠杆菌SRT-2接种到LB培养基中，25℃、200rpm培养24h，制得活化后菌液；取制得的活化后菌液，按体积百分比1％接种至不同盐度LB液体培养基中。盐度(w/v)为1％、3％、5％、7％、9％、11％和15％，25℃、200rpm摇床培养，间隔6h取样一次，测定菌液OD600，绘制菌种生长曲线，结果如图3所示。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
不同盐度LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠的量根据盐度计算(盐度(w/v)为1％、3％、5％、7％、9％、11％和15％)，定容至1L，pH自然。
(2)霍氏肠杆菌SRT-2在不同pH条件下的生长情况
取0.1mL霍氏肠杆菌SRT-2接种到LB培养基中，25℃、200rpm培养24h，制得活化后菌液；取制得的活化后菌液，按体积百分比1％接种至不同pH的LB液体培养基中，pH为6、7、8、9、10和11，25℃、200rpm摇床培养，间隔6h取样一次，测定菌液OD600，绘制菌种生长曲线，结果如图4所示。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
不同pH的LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH分别调为6、7、8、9、10和11。
根据以上实验结果表明，本发明中霍氏肠杆菌SRT-2能够耐受11％的盐度，且在盐度低于11％时生长良好。此外，该菌能够适应中性及强碱性环境，即使在pH为9时，仍能生长良好。这说明该菌能够在高盐及强碱性环境中生长良好，将其应用于环氧丙烷皂化污水的处理具有巨大的优势。
应用例
利用霍氏肠杆菌SRT-2进行污水处理的实验及实验效果
将霍氏肠杆菌SRT-2在LB液体培养基中培养24h，取培养后的菌液在10000rpm下离心10min，倒掉上清液得离心管底部菌体。然后用5mL生理盐水重选菌体，再10000rpm下离心10min，重复两次，以消除菌液中LB液体培养基带入的有机物对污水COD的影响。最后将得到的菌体悬液以体积分数10％的接种量接种到装有200mL环氧丙烷皂化污水和环氧丙烷皂化活性污泥(MLSS约为30g/L)的锥形瓶中，25℃和200rpm下培养，0h、12h、24h、36h和48h分别取样测定接种霍氏肠杆菌SRT-2后环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除效果，并与不接种霍氏肠杆菌SRT-2的环氧丙烷皂化污水活性污泥处理效果作对比，结果如图5所示。从图中可以看到，未接种霍氏肠杆菌SRT-2的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除率仅为69.76％，而接种霍氏肠杆菌SRT-2的环氧丙烷皂化污水活性污泥在48h内对COD的去除速率为12.1mg/(L·h)，对COD的去除率为78.19％，污水COD去除率提高了8.43％，去除效果有了显著的提高。这说明，接种到污泥的霍氏肠杆菌SRT-2能够适应环氧丙烷皂化污水的高盐、高氯、高碱和高COD的环境，并迅速生长以降解环氧丙烷皂化污水中的有机物，进而有效降低环氧丙烷皂化污水的COD。
利用氯醇法生产环氧丙烷产生的废水除了高盐、高氯、高pH的特点外，还含有一定浓度的有机氯化物。有机氯化物因具有高稳定性，同时能够高效去除农作物害虫，因而常被用于高效杀虫剂，例如七氯双环庚二烯以及六六六、滴滴涕和六氯代苯等。这些有机氯化物不但对昆虫有致命影响，对微生物的生长和正常代谢也有一定的影响。本发明涉及的霍氏肠杆菌SRT-2克服了这些不利于微生物代谢的因素，能够有效降低环氧丙烷皂化污水的COD。
SEQUENCE LISTING
<110> 王学芳
<120> 一种霍氏肠杆菌及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggcaatata cttgttacga cttcacccca gtcatgaatc acaaagtggt aagcgccctc 60
ccgaaggtta agctacctac ttcttttgca acccactccc atggtgtgac gggcggtgtg 120
tacaaggccc gggaacgtat tcaccgtggc attctgatcc acgattacta gcgattccga 180
cttcatggag tcgagttgca gactccaatc cggactacga cgcactttat gaggtccgct 240
tgctctcgcg aggtcgcttc tctttgtatg cgccattgta gcacgtgtgt agccctactc 300
gtaagggcca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc cagtttatca ctggcagtct 360
cctttgagtt cccggcctaa ccgctggcaa caaaggataa gggttgcgct cgttgcggga 420
cttaacccaa catttcacaa cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tctcagagtt 480
cccgaaggca ccaaagcatc tctgctaagt tctctggatg tcaagagtag gtaaggttct 540
tcgcgttgca tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcat 600
ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga cttaacgcgt tagctccgga 660
agccacgcct caagggcaca acctccaagt cgacatcgtt tacggcgtgg actaccaggg 720
tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctgagc gtcagtcttt gtccaggggg 780
ccgccttcgc caccggtatt cctccagatc tctacgcatt tcaccgctac acctggaatt 840
ctacccccct ctacaagact ctagcctgcc agtttcgaat gcagttccca ggttgagccc 900
ggggatttca catccgactt gacagaccgc ctgcgtgcgc tttacgccca gtaattccga 960
ttaacgcttg caccctccgt attaccgcgg ctgctggcac ggagttagcc ggtgcttctt 1020
ctgcgggtaa cgtcaatcga caaggttatt aaccttatcg ccttcctccc cgctgaaagt 1080
actttacaac ccgaaggcct tcttcataca cgcggcatgg ctgcatcagg cttgcgccca 1140
ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg gaccgtgtct cagttccagt 1200
gtggctggtc atcctctcag accagctagg gatcgtcgcc taggtgagcc gttaccccac 1260
ctactagcta atcccatctg ggcacatccg atggcaagag gcccgaaggt ccccctcttt 1320
ggtcttgcga cgttatgcgg tattagctac cgtttccagt agttatcccc ctccatcagg 1380
cagtttccca gacattactc acccgtccgc cactcgtcag caaagcagca agctgcttcc 1440
tgttaccgtt cgacttgcat ggtagcctcg cccccccctc cc 1482
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22
Claims (8)
1.一种霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2021025。
2.权利要求1所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取霍氏肠杆菌SRT-2接种于固体培养基上，25-37℃倒置活化培养20-36h，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm培养12-18h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1-3％转接至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm扩大培养12-18h，制得霍氏肠杆菌SRT-2菌液。
3.如权利要求2所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2的制备方法，其特征在于，所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。
4.权利要求1所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonas rhizophila)SRT-2在废水处理中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonasrhizophila)SRT-2在含高盐废水处理中的应用。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonasrhizophila)SRT-2在含盐度(W/V)11％以下废水处理中的应用。
7.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonasrhizophila)SRT-2在含高盐、高氯、碱性废水处理中的应用。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述霍氏肠杆菌(Stenotrophornonasrhizophila)SRT-2在环氧丙烷皂化废水处理中的应用。
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| CN104388343A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-04 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种用于处理高盐工业废水的微生物菌群 |
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2021
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