CN110643534B

CN110643534B - 一株可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌

Info

Publication number: CN110643534B
Application number: CN201910912474.6A
Authority: CN
Inventors: 闫艳春; 李先军
Original assignee: Graduate School of CAAS
Current assignee: Graduate School of CAAS
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110643534A

Abstract

本发明提供一种可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌。该菌命名为YC‑XJ2，保藏编号为CGMCC No.18049，其能够在24小时内将无机盐中的100mg/L TPhP降解99.7％。本发明的矢野口鞘氨醇菌株YC‑XJ2对温度有强适应性，在40℃下能保持对TPhP 95％的降解率；并且在pH值为4‑10时，对TPhP保持88％以上的降解率；盐浓度在0％‑10％之间时，菌株YC‑XJ2均具有74.8％以上的降解率，表现出极强的耐盐特性。本发明菌株能够应用于TPhP污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一株可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌

技术领域

本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一株可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2。

背景技术

磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate，TPhP)是一种有机磷酸酯，可作为阻燃剂用于泡沫中，也可作为增塑剂用于指甲油、液压油中。TPhP是一种添加剂，不与聚合物材料形成化学键，这意味着它可以很容易地释放到环境中。TPhP对生物体具有神经毒性和免疫毒性。

近年来，人们对TPhP的生物降解进行了一定的研究，但收效甚微，仅有少量报道，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)能在TPP初始浓度(3μmol/L)时，5天降解92.1％，这已经是报道的单菌株最快降解速度。由于磷酸酯键难以打开的缘故，至今能高效降解TPhP的单菌株还未见报道。

鞘氨醇菌属细菌(Sphingobium sp.)是较常见的细菌之一，它广泛存在于环境中，该种菌具有用于生物修复的潜力，但目前对于该菌降解磷酸三苯酯未见报道。近几十年来，人们对污染物的生物降解进行了相当详细的研究，并取得了许多成果。然而，微生物在电子垃圾污染区域的生物降解和土壤修复研究相对较少。因此，若能提供一种在高盐浓度下、宽泛的温度和pH值等条件下，能够高效快速降解磷酸三苯酯的菌株对于治理环境污染和土壤修复具有重要的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术中的缺陷，提供一种可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2。

本发明的菌株YC-XJ2是从电子垃圾污染区域的土壤中分离得到一株能够降解磷酸三苯酯的菌株。土壤样品采集于广东省汕头市贵屿镇。该菌可在24h内将无机盐离子培养基中100mg/L的磷酸三苯酯99.7％降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，降解能力稳定。

菌落呈白色、湿润、边缘整齐且中间略凸起、菌落表面光滑且不透明(图1)。在电镜下，该菌为椭球状，无鞭毛。菌株革兰氏染色反应为阴性。基于形态特征、生理生化特征，将该菌株鉴定为矢野口鞘氨醇菌Sphingobium yanoikuyae，命名为YC-XJ2。该菌株于2019年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.18049，分类名为Sphingobium yanoikuyae。

本发明提供了一株失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2，其保藏编号为CGMCC No.18049。

本发明提供了含有所述失野口鞘氨醇菌YC-XJ2的菌剂。

优选地，所述菌剂其为生物清洁剂或土壤修复剂。

本发明提供了失野口鞘氨醇菌YC-XJ2或含有该菌的菌剂在清洁环境中的应用。

本发明提供了失野口鞘氨醇菌YC-XJ2或含有该菌的菌剂在净化、修复土壤或工业废水中的应用。

具体地，所述应用为降解磷酸三苯酯。

进一步地，上述应用时的环境温度为45℃以下。优选地，所述环境温度为15℃-40℃。更优选地，所述环境温度为20℃-40℃。

进一步地，应用时的体系pH值为4-10。优选地，所述体系pH值6-10。

进一步地，应用时的体系的无机盐浓度为0-10％。

本发明提供了所述的失野口鞘氨醇菌YC-XJ2在制备生物清洁剂、降解剂或土壤修复剂中的应用。

本发明的矢野口鞘氨醇菌株YC-XJ2对温度有强适应性，在40℃下能保持对TPhP95％的降解率；并且在pH值为4-10时，对TPhP保持88％以上的降解率；盐浓度在0％-10％之间时，菌株YC-XJ2均具有74.8％以上的降解率，表现出极强的耐盐特性。本发明菌株能够在24小时内将无机盐中的100mg/L TPhP降解99.7％，具有高效、迅速的降解TPhP能力，能够应用于TPhP污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为矢野口鞘氨醇菌株YC-XJ2在培养基中生长菌落图、革兰氏染色图和在电镜下的形态结构图。

图2为矢野口鞘氨醇菌株YC-XJ2的系统发育树。

图3为菌株YC-XJ2在48小时内对TPhP的降解能力示意图，显示YC-XJ2在24小时后对TPhP的降解率高达99.7％，说明本发明的菌株YC-XJ2具有快速高效的降解磷酸三苯酯的能力。

图4为菌株YC-XJ2在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，24小时降解磷酸三苯酯能力示意图，显示菌株YC-XJ2在15℃能保持75％以上的降解率，即便在40℃高温的时候也能保持95％的降解率。

图5为菌株YC-XJ2在不同pH(4-10)的加入磷酸三苯酯至底物浓度100mg/L的无机盐离子培养基中，24小时降解磷酸三苯酯能力的示意图。

图6为菌株YC-XJ2在不同氯化钠浓度(0％-10％)的加入磷酸三苯酯至底物浓度100mg/L的无机盐离子培养基中，24小时降解磷酸三苯酯能力的示意图。

图7为实施例3中土壤灭菌组和未灭菌组中，阴性对照与添加不同浓度YC-XJ2菌液降解土壤过程中TPhP的残留量对比图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请使用的无机盐培养基具有以下组成：MSM(Minimal Salt Medium)培养基：NH₄NO₃(1.5g/L),KH₂PO₄·12H₂O(0.5g/L),K₂HPO₄(1.5g/L),MgSO₄·7H₂O(0.2g/L),NaCl(0.5g/L),1‰(v/v)TES培养基,pH＝7.0±0.2TES(Trace Element Solution)培养基:FeSO₄·7H₂O(2.0g/L),ZnSO₄(0.1g/L),CuSO₄·5H₂O(0.03g/L),MnCl·4H₂O(0.03g/L),CoCl·7H₂O(0.3g/L),Na₂MoO₄·2H₂O(0.03g/L),Na₂WO₄·2H₂O(0.02g/L)

实施例1失野口鞘氨醇菌YC-XJ2的分离和鉴定

从电子垃圾污染区域的土壤中采集土壤样品接种到100mL含50mg/L TPhP的无机盐离子培养基中，30℃，180rpm条件下培养。每培养7天，取培养基体积的10％接种于新鲜的无机盐离子培养基中，且每次将TPhP的浓度提高50mg/L，连续转接5次，无机盐培养基中TPhP浓度提高到300mg/L。

将驯化后的菌液划线到含有100mg/L TPhP的无机盐培养基平板上，30℃静置培养4天。挑取平板上的单菌落进行划线后培养，不断重复，直至分离获得纯化的菌株。保存生长良好、传代稳定且降解能力较好的菌株，命名为YC-XJ2。

1、菌株的形态学特征

该菌为革兰氏阴性菌。在含有100mg/L TPhP的无机盐培养基平板上，菌落呈白色球形菌落，表面光滑，周围存在清晰可见降解圈。现革兰氏阴性。电镜下菌体成球形或椭球形，大小约为0.5-2um之间，没有鞭毛，菌体周围存在大量分泌物，菌体往往首尾粘在一起形成长线状、分支状或堆积在一起形成菌团，(见图1)。

2、16S rDNA鉴定

将菌株YC-XJ2接种到LB液体培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

用于扩增16s rDNA序列的通用引物为：27F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，用基因组DNA作为模板，加入Premix TaqTM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pMD-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将该序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA 5.2软件构建系统发育树。

16S rRNA基因序列(1478bp)比对和系统发育树分析表明，菌株YC-XJ2与Sphingobium yanoikuyae ATCC51230一致性为99.34％，初步确定YC-XJ2为Sphingobiumyanoikuyae，见图2。

综合菌体形态、培养特性和16S rDNA基因序列，菌株YC-RL1被鉴定为矢野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)。该菌株YC-XJ2于2019年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.18049，分类名为Sphingobiumyanoikuyae。

实施例2失野口鞘氨醇菌YC-XJ2的降解性能试验

1、菌株YC-XJ2对磷酸三苯酯的降解

将菌株YC-XJ2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.7，按照体积比1％的接种量接种到含磷酸三苯酯各100mg/L混合物的无机盐培养基中，以未接种菌株的磷酸三苯酯100mg/L的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，每隔12小时取样检测磷酸三苯酯的浓度。

在磷酸三苯酯降解样品中加入等体积乙腈，上下震荡混匀，取1mL TPhP降解样品，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析，检测TPhP浓度。

高效液相色谱法检测菌株YC-XJ2对无机盐培养基中磷酸三苯酯的浓度进行检测。HPLC分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150×4.6mm×5μm)，流动相为乙腈:水＝90:10(v/v)，进样量5μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测。磷酸三苯酯的检测波长为205nm，磷酸三苯酯的保留时间2.2min。利用磷酸三苯酯标准品绘制浓度与205nm处吸收峰面积之间的标准曲线。

如图3所示，菌株YC-XJ2经过24小时的降解后，TPhP的降解率高达99.7％，说明本发明的菌株YC-XJ2具有快速高效的降解磷酸三苯酯的能力。

2、鞘氨醇菌YC-XJ2降解磷酸三苯酯时对温度的耐受能力

将菌株YC-XJ2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.7，按照体积比1％的接种量接种无机盐离子培养基中，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的同时加入磷酸三苯酯至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下，180rpm摇床振荡避光培养。24小时后取样测定磷酸三苯酯浓度。

菌株YC-XJ2在15℃还能保持75％以上的降解率，即便在40℃高温的时候也能保持95％的降解率，说明菌株对温度有很强的适应性，见图4。

3、鞘氨醇菌YC-XJ2降解磷酸三苯酯时对pH耐受能力

分别配制不同pH(4-10)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中同时加入磷酸三苯酯至底物浓度100mg/L。将菌株YC-XJ2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.7，按照体积比1％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株不同pH的同时加入磷酸三苯酯至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在30℃下，180rpm摇床振荡避光培养。24小时后测定磷酸三苯酯浓度。

pH影响菌株YC-XJ2对磷酸三苯酯的降解，如图5所示。当pH值为4.0时，磷酸三苯酯12.4％。当pH值5.0时34.2％，当pH值6.0时降解率达到最高值99.6％，当pH值7.0-10.0之间时，均保持较高的降解率，降解率均在88.9％以上，显示出菌株有很强耐碱性，在很宽泛的pH值6.0-10.0之间，均有较强的降解活性。

4、鞘氨醇菌YC-XJ2降解磷酸三苯酯时对盐的耐受能力

分别配制不同盐度(NaCl)(0％-10％，g/ml)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中同时加入磷酸三苯酯至底物浓度100mg/L。将菌株YC-XJ2接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD600＝0.7，按照体积比1％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

如图6所示，盐浓度在0％-10％之间时，菌株YC-XJ2均具有74.8％以上的降解率，表现出极强的耐盐特性。

实施例3鞘氨醇菌YC-XJ2在土壤修复中的应用

本研究中所用的土壤取自中国农业科学院花园土壤。土壤用40目筛子除去较大块的硬质土和沙石后，分别称取10g置于50mL离心管中，并首先做以下两种处理：灭菌(121℃，30min)和不灭菌。

然后具体实验流程按照表1进行，接YC-XJ2菌液，添加TPhP。每个样品确保添加的TPhP母液体积和无机盐培养基体积的总和为5mL。涡旋仪上震荡混匀。将样品放置于室外自然环境下进行培养，期间每隔6小时震荡混匀一次。培养2天后对10g土壤样品进行萃取，测定TPhP的浓度。以相同条件下不接菌的土壤样品作为对照，处理组和对照组中每个处理均设3个重复。

表1菌株YC-XJ2土壤修复实验设计

菌悬液制备：挑YC-XJ2单菌落接种至100ml LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝1.0，取50mL菌液于离心管中6000rpm 10min，弃上清并将菌体用MSM培养基重悬混匀，离心洗涤，重复操作3次，调节菌液浓度，制备OD₆₀₀值为1.0的MSM菌悬液。

萃取方法：每个样品中加入20mL甲醇，在摇床中剧烈震荡4小时，4℃静置1小时，离心收集甲醇液体于50mL离心管中，重复操作一次。将收集到的液体(约40mL)于通风橱蒸干，并溶解于10mL乙腈中，取1mL经0.22μm的有机相滤膜进行过滤，用于HPLC检测。

如图7所示，未灭菌组中TPhP的残留量普遍低于相应的灭菌组，并且随着加入接菌量的增加TPhP的残留量明显下降，灭菌组中当接菌量5％时，两天后PhP的残留量为3.56mg/kg比对照组14.05mg/kg大幅度下降，表现出菌株YC-XJ2在土壤实际修复过程中的TPhP降解能力优异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院研究生院

<120> 一株可降解磷酸三苯酯的失野口鞘氨醇菌

<130> KHP191113604.6

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcatgc ctaatacatg caagtcgaac 60

gagatcttcg gatctagtgg cgcacgggtg cgtaacgcgt gggaatctgc ccttgggttc 120

ggaataactt ctggaaacgg aagctaatac cggatgatga cgtaagtcca aagatttatc 180

gcccaaggat gagcccgcgt aggattagct agttggtggg gtaaaggccc accaaggcga 240

cgatccttag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagta gggaatattg gacaatgggg gaaaccctga tccagcaatg 360

ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt tacccgggat gataatgaca 420

gtaccgggag aataagctcc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggag 480

ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggctattc aagtcagagg 540

tgaaagcccg gggctcaacc ccggaactgc ctttgaaact agatagcttg aatccaggag 600

aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggaag aacaccagtg 660

gcgaaggcgg ctcactggac tggtattgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 720

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgata actagctgtc agggcacatg 780

gtgttttggt ggcgcagcta acgcattaag ttatccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840

taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900

agcaacgcgc agaaccttac caacgtttga catccctatc gcggatcgtg gagacacttt 960

ccttcagttc ggctggatag gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgcct ttagttgcca gcatttagtt 1080

gggtactcta aaggaaccgc cggtgataag ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1140

tcatggccct tacgcgttgg gctacacacg tgctacaatg gcgactacag tgggcagcca 1200

cctcgcgaga gggagctaat ctccaaaagt cgtctcagtt cggatcgttc tctgcaactc 1260

gagagcgtga aggcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1320

ccaggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gattcactcg aaggcgttga 1380

gctaaccgta aggaggcagg cgaccacagt gggtttagcg actggggtga agtcgtaaca 1440

aggtagccgt aggggaacct gcggctggat cacctcctt 1479

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2，其保藏编号为CGMCCNo.18049。

2.含有权利要求1所述失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2的菌剂。

3.如权利要求2所述的菌剂，其为生物清洁剂或土壤修复剂。

4.权利要求1所述的失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2或权利要求2或3所述的菌剂在清洁环境中的应用。

5.权利要求1所述的失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2或权利要求2或3所述的菌剂在净化、修复土壤或工业废水中的应用。

6.权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用为降解磷酸三苯酯。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用时的环境温度为45℃以下。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用时的体系pH值为4-10。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用时的体系的无机盐浓度为0-10％。

10.权利要求1所述的失野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)YC-XJ2在制备生物清洁剂、降解剂或土壤修复剂中的应用。