CN108018246B - 一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株及其应用 - Google Patents

一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株产壳聚糖酶和聚谷氨酸的菌株及其应用，属于生物技术领域，所述菌株为沙福芽孢杆菌LZ303，分离自烟台海域海底沉积物，分类命名为沙福芽孢杆菌，已于2017年12月21日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.15111。本发明菌株具有壳聚糖酶和γ‑聚谷氨酸的双重合成能力，可以通过控制培养基和培养条件单独生产壳聚糖酶或γ‑聚谷氨酸，亦可联产壳聚糖酶和γ‑聚谷氨酸。且本发明菌株遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的壳聚糖酶酶活力高，可分泌于胞外，分离提取简单方便，底物特异性强，可直接用于转化生产壳寡糖，同时具有较高的γ‑聚谷氨酸产生能力，工业应用具有优势。

Description

一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株，以及利用该菌株制备壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
低分子量的壳寡糖在生物医学、食品、化学工业方面有着广泛的应用，具有潜在的多种生物活性如抗菌性和诱导植物产生植物抗菌素，在体内还具有抗胆固醇合成，通过免疫刺激抗肿瘤等活性因而越来越受到人们的注意。壳聚糖酶(chitosanase)又称壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，专一性水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键，是制备壳寡糖理想的酶制剂。除制备壳寡糖外壳聚糖酶还具有其他用途，如在农业上可作为生物防治剂以及在生物技术中可用于原生质分离、细胞化学定位和生产单细胞蛋白等。
壳聚糖酶在细菌、放线菌、真菌及病毒等微生物中均有存在，针对以上微生物产壳聚糖酶的应用研究较为广泛，主要集中在菌株筛选、培养条件优化及工程菌构建等多个方面，并取得了一定的成果。2012年王艳君等从福建潮间带泥样中筛选到1株青霉菌，通过优化培养条件壳聚糖酶活力达到18U/mL，同年Sinha等分离到1株链霉菌，利用壳聚糖无机盐培养基在32℃条件下培养3d，壳聚糖酶活力达到6U/mL。2015年阎贺静等研究了碳源对烟曲霉WHSW-01菌株诱导产生壳聚糖酶活力的影响，最终酶活力达到6.78U/mL，较优化前提高了83.24％。以上产酶菌株产酶量及酶活性普遍较低，难以规模化生产和广泛应用。因此继续筛选产酶量高的其他微生物来源的壳聚糖酶，得到具工业化潜在应用价值的新酶源，是充分发挥壳聚糖酶功能和壳寡糖工业化生产的关键。
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-/L-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成的一种高分子阴离子多肽型聚合物。生物合成的γ-聚谷氨酸通常由500～5000个谷氨酸单体组成，分子量为10kD～10000kD，γ-聚谷氨酸主链上含有大量游离羧基,可发生交联、螯合、衍生化等反应，具有强水溶性、生物相容性、生物降解性等。1937年Ivanovics等最先在炭疽芽孢杆菌的夹膜中发现了γ-PGA，随后Bovamick等发现有些芽孢杆菌属细菌能在发酵培养基中蓄积PGA，此后利用微生物发酵生成γ-PGA的研究便活跃起来。得益于聚谷氨酸的超强吸水性和缓释性，可以增强土壤保水性，改良土壤结构，减少水的深层渗漏和土壤养分流失，提高水分利用率，从一定程度上缓解农田干旱缺水现状，对缺水地区的农业生产具有重要用途。
本发明筛选到的一株壳聚糖酶生产菌株，具有较高的产酶活力，同时发现在培养基中加入L-谷氨酸时，可同时产生γ-聚谷氨酸，目前尚未见有联产壳聚糖酶和聚谷氨酸的菌株报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供从海洋中分离得到的一株高效生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株，并应用该菌株制备壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的方法。本发明所提供的产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株是从烟台海洋中采集样本分离得到，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于制备壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸。
本发明的技术方案如下：
一株产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株LZ303，分离自烟台海域海底沉积物，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2017年12月21日，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，保藏编号为：CGMCC No.15111,保藏地址:京市朝阳区北辰西路1号院3号。
进一步，该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ.NO.1。
本发明提供一种利用所述菌株用于生产壳聚糖酶的方法，它的步骤如下：(1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比5～20％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制10～30％，pH6.0～7.0，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到壳聚糖酶发酵液；所述的发酵培养基：胶体壳聚糖10～20g/L、酵母浸粉5～15g/L、MgSO40.1～0.5g/L、NaCl 1～2.5g/L、KH2PO4 1～2g/L、CaCl2 0.1～0.5g/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的液体种子培养基：蔗糖1～5g/L，酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨1～10g/L，胰蛋白胨1～10g/L，KH2PO4 1～2g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明还提供一种利用所述菌株生产γ-聚谷氨酸的方法，它的步骤如下：
(1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26～37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比5～20％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制20～50％，pH6.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到γ-聚谷氨酸的发酵液；所述的发酵培养基：蔗糖10～30g/L，甘油5～20g/L，L-谷氨酸10～30g/L，D-谷氨酸0～5g/L，CaCL2 0.5～2g/L，KH2PO4 1～5g/L，MgSO4 0.5～1g/L，酵母粉5～20g/L，丁二酸1～3g/L，(NH4)2SO4 2～5g/L，MnSO4 10～20mg/L，FeSO4 20～40mg/L，pH6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的液体种子培养基：蔗糖1～5g/L，酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨1～10g/L，胰蛋白胨1～10g/L，KH2PO4 1～2g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明还提供一种利用所述菌株联合生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的方法，它的步骤如下：
(1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比5～20％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制20～50％，pH6.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸混合发酵液；所述的发酵培养基：蔗糖10～30g/L，胶体壳聚糖10～20g/L，L-谷氨酸10～30g/L，D-谷氨酸0～5g/L，CaCL2 0.5～2g/L，KH2PO4 1～5g/L，MgSO40.5～1g/L，酵母粉5～20g/L，丁二酸1～3g/L，(NH4)2SO4 2～5g/L，MnSO4 10～20mg/L，FeSO420～40mg/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的液体种子培养基：蔗糖1～5g/L，酵母浸粉1～10g/L，蛋白胨1～10g/L，胰蛋白胨1～10g/L，KH2PO4 1～2g/L，NaCl 1～5g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明提供的沙福芽孢杆菌LZ303，具有壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的双重合成能力，可以通过控制培养基和培养条件单独生产壳聚糖酶或γ-聚谷氨酸，亦可联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸。
2、本发明所提供的沙福芽孢杆菌LZ303遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的壳聚糖酶酶活力高，可分泌于胞外，分离提取简单方便，底物特异性强，可直接用于转化生产壳寡糖，同时具有较高的γ-聚谷氨酸产生能力，工业应用具有优势。
附图说明
图1基于16S rRNA序列的系统发育树。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)LZ303，分类命名为沙福芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)，已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.15111，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1：沙福芽孢杆菌菌株分类
1)菌种特性
在保藏培养基上菌落呈灰白色，近圆形、表面光滑湿润凸起、边缘不规则；通过光学显微镜观察，菌体直杆状、不成链，两端钝圆，有芽孢，革兰氏阳性。菌株LZ303能够分解蔗糖、葡萄糖、山梨糖，不能分解淀粉。甲基红试验、V-P试验、氧化酶、触酶、过氧化氢酶、脲酶试验结果为阳性，硝酸盐还原、吲哚产生及明胶液化等试验结果为阴性。10％NaCl培养基中生长良好，试验结果详见表1。综合上述试验结果，依据《常见细菌系统鉴定手册》，初步将菌株LZ303鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。具体生理生化特征对照结果如表1所示。
表1菌株LZ303生理生化特征
Figure BDA0001546935150000061
2)菌株鉴定
经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rRNA基因序列长度为1458bp，在GenBank上进行BLAST比对，得出该菌株与Bacillus safensis(KR140177)碱基相似性达99％(见图1)，结合生理生化指标，将LZ303菌株鉴定为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。16S rRNA序列信息如下：
ccatatctggaccttcggcggctggctccataaaggttacctcaccgacttcgggtgttgcaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttatgggattggctaaaccttgcggtcttgcagccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtccccgaagggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagtttcccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccgggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctgggttaggtaccgtcaaggtgcggagcagttactctcgcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattaccccaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgacagccgaaaccgtctttcatccttgaaccatgcggttcaaggaactatccggtattagctccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatccgggagcaagctcccttctgtccgctcgactgcatgtatagcagcccccactgcca。
3)壳聚糖酶底物特异性
考察了沙福芽孢杆菌LZ303壳聚糖酶的底物特异性。由表2中可见，壳聚糖酶对胶体壳聚糖具有较好的底物特异性，对胶体甲壳素、羧甲基纤维素及羧甲基壳聚糖基本无催化活性。
表2底物特异性
Figure BDA0001546935150000071
4)遗传稳定性
采用划线法将沙福芽孢杆菌LZ303在固体培养基上连续传代50次，测定菌体形态、生长速度及生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的能力，与原代菌株无明显差异，遗传稳定性良好。
5)菌种保藏
本项发明所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)LZ303，已于2017年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.15111，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2菌株培养与壳聚糖酶发酵
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；划线接种于恒温培养箱30℃培养20h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，液体种子培养基组分：蔗糖3g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨3g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 2.5g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按5％接种量向组成成分为葡萄糖10g/L，胶体壳聚糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO4 0.3g/L，(NH4)2SO4 2g/L，NaCl 2.5g/L KH2PO4 1g/L，CaCl20.1g/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养36h，得到壳聚糖酶的发酵液，测定酶活为87.9U/mL。酶活测定方法为：发酵液离心取上清液(必要时作适当稀释)0.1mL加入0.02mol/L pH 5.6的HAc-NaAc缓冲液1mL，pH 5.6，10g/L粉末壳聚糖的HAc溶液0.9mL，50℃水浴15min后加3,5-二硝基水杨酸试剂1.5mL终止反应，沸水浴5min显色，冷却后定容至25mL，离心，取上清液测520nm波长处的吸光度。等量煮沸灭活的发酵液作为空白对照。并绘制氨基葡萄糖标准曲线，计算反应液中的还原糖含量，换算壳聚糖酶的酶活力。酶活力单位定义：每毫升酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)毫升酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
实施例3菌株培养与γ-聚谷氨酸发酵
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；划线接种于恒温培养箱30℃培养18h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，液体种子培养基组分：蔗糖3g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 2g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按10％接种量向组成成分为蔗糖30g/L，甘油5g/L，L-谷氨酸30g/L，D-谷氨酸1g/L，CaCL2 2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，酵母粉10g/L，丁二酸2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MnSO4 20mg/L，FeSO4 20mg/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养40h，测得发酵液中γ-聚谷氨酸含量为25g/L。γ-聚谷氨酸测定方法为：硫酸调发酵液pH至2.0，加入2倍蒸馏水稀释，8000r/min离心10min去除菌体，用NaOH回调pH7.0，加入3倍体积乙醇进行沉淀过夜，真空干燥称重计算γ-聚谷氨酸含量。
实施例4菌株LZ303联合生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸
1)菌株活化：挑取菌种划线接种至固体斜面培养基：蔗糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；划线接种于恒温培养箱30℃培养18h；
2)液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，液体种子培养基组分：蔗糖3g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，胰蛋白胨5g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 2g/L，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min；八层纱布封口，于30℃，200r/min摇床振荡培养18h，得液体种子；
3)液体发酵：按10％接种量向组成成分为蔗糖30g/L，胶体壳聚糖5g/L，L-谷氨酸30g/L，D-谷氨酸1g/L，CaCL2 2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.5g/L，酵母粉10g/L，丁二酸2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MnSO4 20mg/L，FeSO4 20mg/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min制备的发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min，溶氧控制20～30％，pH7.0，温度30℃，通气培养40h，测得壳聚糖酶活力为67.9U/mL，γ-聚谷氨酸含量为15g/L。壳聚糖酶活力测定方法同实施例2，γ-聚谷氨酸测定方法同实施例3。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一株联产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1458
<212> DNA
<213> 沙福芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)
<400> 1
ccatatctgg accttcggcg gctggctcca taaaggttac ctcaccgact tcgggtgttg 60
caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 120
tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180
gaactgagaa cagatttatg ggattggcta aaccttgcgg tcttgcagcc ctttgttctg 240
tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 300
accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 360
aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420
acaaccatgc accacctgtc actctgtccc cgaagggaaa gccctatctc tagggttgtc 480
agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca 540
ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag 600
gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca 660
ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg 720
ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct 780
ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagtttccca 840
gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc 900
tgcgagccct ttacgcccaa taattccggg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct gggttaggta ccgtcaaggt gcggagcagt 1020
tactctcgca cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact 1080
cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc 1140
cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta 1200
cgcatcgtcg ccttggtgag ccattacccc accaactagc taatgcgccg cgggtccatc 1260
tgtaagtgac agccgaaacc gtctttcatc cttgaaccat gcggttcaag gaactatccg 1320
gtattagctc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac 1380
tcacccgtcc gccgctaaca tccgggagca agctcccttc tgtccgctcg actgcatgta 1440
tagcagcccc cactgcca 1458

Claims (9)

1.一株产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的菌株LZ303，其特征在于所述菌株LZ303，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2017年12月21日，分类命名为沙福芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCC No. 15111，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种利用权利要求1所述菌株LZ303生产壳聚糖酶的方法，其特征在于它的步骤如下：
（1）菌株活化：挑取菌株LZ303的菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
（2）液体种子制备：挑取步骤（1）活化的菌株接种于装有液体种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
（3）液体发酵：按体积比5～20%接种量向发酵培养基接入步骤（2）制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制10～30%，pH6.0～7.0，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到壳聚糖酶发酵液；所述的发酵培养基的成分及终浓度：胶体壳聚糖10～20 g/L、酵母浸粉5～15 g/L、MgSO4 0.1～0.5 g/L、NaCl 1～2.5 g/L、KH2PO4 1～2 g/L、CaCl2 0.1～0.5 g/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
3.根据权利要求2所述生产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的固体斜面培养基的成分及终浓度：蔗糖 2 g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 5 g/L，胰蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 18 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
4.根据权利要求2所述生产壳聚糖酶的方法，其特征在于所述的液体种子培养基的成分及终浓度：蔗糖 1～5 g/L，酵母浸粉1～10 g/L，蛋白胨1～10 g/L，胰蛋白胨 1～10 g/L，KH2PO4 1～2 g/L，NaCl 1～5 g/L， pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20 min。
5.一种利用权利要求1所述菌株LZ303生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于它的步骤如下：
（1）菌株活化：挑取菌株LZ303的菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
（2）液体种子制备：挑取步骤（1）活化的菌株接种于装有液体种子培养基的容器中，纱布封口，于26～37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
（3）液体发酵：按体积比5～20%接种量向发酵培养基接入步骤（2）制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制20～50%，pH6.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到γ-聚谷氨酸的发酵液；所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖 10～30 g/L，甘油 5～20g/L，L-谷氨酸 10～30 g/L，D-谷氨酸0～5 g/L，CaCL2 0.5～2 g/L，KH2PO4 1～5 g/L，MgSO4 0.5～1 g/L， 酵母粉 5～20 g/L， 丁二酸 1～3 g/L， (NH4)2SO4 2～5 g/L，MnSO410～20mg/L， FeSO420～40mg/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
6.根据权利要求5所述生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的固体斜面培养基的成分及终浓度：蔗糖 2 g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 5 g/L，胰蛋白胨 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 18 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
7.根据权利要求5所述生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液体种子培养基的成分及终浓度：蔗糖 1～5 g/L，酵母浸粉1～10 g/L，蛋白胨1～10 g/L，胰蛋白胨 1～10g/L，KH2PO4 1～2 g/L，NaCl 1～5 g/L， pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20 min。
8.一种利用权利要求1所述菌株LZ303联合生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于它的步骤如下：
（1）菌株活化：挑取菌株LZ303的菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28～30℃培养14～20h；
（2）液体种子制备：挑取步骤（1）活化的菌株接种于装有液体种子培养基的容器中，纱布封口，于26-37℃，150～200r/min摇床振荡培养18～24h，得液体种子；
（3）液体发酵：按体积比5～20%接种量向发酵培养基接入步骤（2）制备的液体种子，转速300～650r/min，溶氧控制20～50%，pH6.0～7.5，温度26～37℃，通气培养24～48h，得到壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸混合发酵液；所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖 10～30 g/L，胶体壳聚糖 10～20 g/L，L-谷氨酸 10～30 g/L，D-谷氨酸0～5 g/L，CaCL2 0.5～2 g/L，KH2PO4 1～5 g/L，MgSO4 0.5～1 g/L， 酵母粉 5～20 g/L， 丁二酸 1～3 g/L， (NH4)2SO4 2～5 g/L，MnSO4 10～20mg/L， FeSO420～40mg/L，pH 6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。
9.根据权利要求8所述联合生产壳聚糖酶和γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的固体斜面培养基的成分及终浓度：蔗糖 2 g/L，酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 5 g/L，胰蛋白胨 5g/L，NaCl 5 g/L，琼脂 18 g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min；
所述的液体种子培养基：蔗糖 1～5 g/L，酵母浸粉1～10 g/L，蛋白胨1～10 g/L，胰蛋白胨 1～10 g/L，KH2PO4 1～2 g/L，NaCl 1～5 g/L， pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌20 min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191191A (zh) * 2010-12-20 2011-09-21 中南大学 一株对重金属具有耐受性的菌株及其应用
CN104195077A (zh) * 2014-08-18 2014-12-10 南开大学 一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191191A (zh) * 2010-12-20 2011-09-21 中南大学 一株对重金属具有耐受性的菌株及其应用
WO2015097567A1 (en) * 2013-12-23 2015-07-02 Alkaloids Corporation Process for the conversion of colchicinoids to their 3-glycosylated derivatives via their respective 3-demethyl analogues
CN104195077A (zh) * 2014-08-18 2014-12-10 南开大学 一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因的克隆、重组表达及其活性;段静等;《水产学报》;20171031;第41卷(第10期);全文 *

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