CN110669696A - 一种解磷菌及其提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种解磷菌及其提取方法，解磷菌名称为B5菌株，B5菌株为假单胞菌属细菌；其生化指标测定结果为：革兰氏染色阴性，甲基红试验阴性，V‑P反应阴性，吲哚试验阴性，氧化酶试验阴性，菌株B5可以利用柠檬酸盐为碳源，产生胞外酶‑明胶酶液化明胶、产生过氧化氢酶、吲哚、且生成H2S；B5菌株在不同碳源下解磷能力强弱顺序为：葡萄糖＞半乳糖＞乳糖＞蔗糖＞可溶磷淀粉，在不同氮源下解磷能力顺序为硫酸铵＞氯化铵＞尿素＞硝酸钾；B5菌株最适生长温度为28～32℃，B5菌株最适生长pH为7～9。

Description

一种解磷菌及其提取方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种解磷菌及其提取方法。
背景技术
植物从土壤中获取磷素是为提供自身生长所需磷素的主要途径之一。然而土壤中磷含量虽为0.05％(w/w),但其中仅0.1％的可溶性磷可以被植物吸收，土壤中磷素吸收的磷素含量远达不到植物生长所需磷含量。在农业生产过程中，土壤中的磷素极易与土壤成分形成难溶磷酸盐和络合物，导致植物可利用的土壤磷素较少，对磷肥的利用率也较低，因此作物的生长受到严重抑制。不仅如此，大量的施用磷肥会使土壤肥力退化，尤其是耕作的土壤，扰乱了微生物多样性与其活性，从而导致农作物减产。再者磷肥的制作主要从不可再生的磷矿石中分离，全球的磷矿石资源在50～100年将被耗尽。解磷菌是一类可以将难溶性磷转化为能被植物吸收的有效磷的微生物，可以改善植物生长的磷素营养，有效的促进了植物的生长，提高农作物的产量。
截止目前，文献报道的解磷菌典型资源类群有：芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、肠细菌属(Enterbacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、色杆菌属(Chromobacterium)、多硫杆菌属(Thiobacillus)、产碱菌属(Alcaligenes)等；解磷放线菌绝大部分为链霉菌属(Streptom)；解磷真菌主要是曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和根霉属(Rhizopus)。随着研究工作的不断积累，将会有更多高活性解磷菌株被发现。
从已有的文献报道来看，解磷菌种类分布的比较广泛，而且解磷能力较强的种类并不十分集中，换句话来说，也就是不同类群的菌种资源都有可能存在解磷活性较高的菌株，从这个角度看，具有解磷能力野生菌株的筛选工作仍然意义重大，十分必要。
在不同土壤中的解磷菌的解磷能力不同，新疆多内陆地区和国外进口菌种，但由于对本地环境的不适应，多数菌剂不能发挥效用。
发明内容
本发明的目的是提供一种解磷菌及其提取方法、应用，不仅可以丰富野生解磷菌遗传资源，扩大解磷菌全基因组育种的后备库，而且可以为新疆的土地提供一种生物磷肥，可以更好的实现解磷菌的解磷能力。
为解决上述问题，本发明的技术方案为：
一种解磷菌，所述解磷菌名称为B5菌株，所述B5菌株为假单胞菌属细菌；
其生化指标测定结果为：革兰氏染色阴性，甲基红实验试性，V-P反应阴性，吲哚试验阴性，氧化酶试验阴性，菌株B5可以利用柠檬酸盐为碳源，产生胞外酶-明胶酶液化明胶、产生过氧化氢酶、吲哚、且生成H2S；
所述B5菌株在不同碳源下解磷能力强弱顺序为：葡萄糖＞半乳糖＞乳糖＞蔗糖＞可溶磷淀粉，在不同氮源下解磷能力顺序为硫酸铵＞氯化铵＞尿素＞硝酸钾；所述B5菌株最适生长温度为28～32℃，所述B5菌株最适生长pH为7～9。
本发明还提供了一种上述解磷菌的提取方法，包括以下步骤：
S1:土壤采样：采集于新疆昌吉市室外土壤，采集地面5cm下的土壤样品；
S2：取步骤S1采集的1g土壤，研钵研碎置于含90mL无菌水的锥形瓶内，摇床28℃、170r/min震荡混匀20min，静止10min；
S3：分离与提纯：取步骤S2中的溶液1μL无菌水的离心管内，设置浓度梯度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取1mL涂布于PVK固体培养基，每个浓度重复三次，3天后挑取周围有透明溶磷圈的菌落，在LB固体培养基上纯化5次。筛选出菌株置于30％的甘油中，-80℃冰箱中保存；
其中，PVK培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)2 5g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
LB培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母5g，蒸馏水1000mL，pH值为6.8～7，121℃灭菌20min；
S4：菌株的鉴定：将步骤S3筛选出的菌株接种于NBRIP固体培养基内，32℃下倒置培养7天后，获得四株溶磷圈大而显著的菌株，菌株编号为A14、A12、B5、C5；
其中，NBRIP培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4 ·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
S5：采用钼蓝比色法对A14、A12、B5、C5进行解磷能力的确定，选择出解磷能力最强的菌株B5。
具体的，步骤S5具体为将步骤S4筛选出来的A14、A12、B5、C5菌株在NB液体培养基中，培养24h后，取0.5mL菌液于含50mL Ca3(PO4)2的NBRIP液体培养基中，32℃170r/min的条件下培养7天，每24h取三角瓶中的培养液1mL，超声波震碎细胞后，10000r/min条件下离心2min，采用钼蓝比色法测定有效磷的含量，选择出有效磷含量最多的菌株B5。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
本发明提供了一种新的解磷菌B5，通过生理生化特征、16SrDNA同源序列和系统进化树分析，确定B5隶属于假单胞菌属细菌(Pseudomonas)。该解磷菌为之后在新疆地区的生物磷肥的应用奠定基础，为后面对该菌的研究提供材料。
在获取该菌种的方法过程中，本发明创新了解磷菌的筛选培养基，并丰富筛选技术体系。获取具有较强解磷能力的野生菌株活体纯培养物，丰富了专利菌株资源。
附图说明
图1为本发明实施例提供的B5菌株溶磷圈特征图；
图2为本发明实施例提供的B5菌株的系统进化树示意图；
图3为B5菌株的最适生长温度测定结果示意图；
图4为B5菌株的最适pH测定结果示意图；
图5为B5菌株对不同碳源的解磷效果示意图；
图6为B5菌株对不同氮源的解磷效果示意图；
图7为B5菌株对不同磷源的解磷效果的示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种解磷菌及其提取方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
本实施例提供了一种解磷菌的提取方法，包括以下步骤：
S1:土壤采样：采集于新疆昌吉市室外土壤，采集地面5cm下的土壤样品；
在不同土壤中的解磷菌的解磷能力不同，新疆多内陆地区和国外进口菌种，但由于对本地环境的不适应，多数菌剂不能发挥效用，所以采集新疆本地的土壤，从本地土壤中筛选出高效解磷菌，作为生物磷肥可以更好的实现解磷菌的解磷能力。
S2：取步骤S1采集的1g土壤，研钵研碎置于含90mL无菌水的锥形瓶内，摇床28℃、170r/min震荡混匀20min，静止10min；
S3：分离与提纯：取步骤S2中的溶液1μL无菌水的离心管内，设置浓度梯度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取1mL涂布于PVK固体培养基，每个浓度重复三次，3天后挑取周围有透明溶磷圈的菌落，在LB固体培养基上纯化5次。筛选出菌株置于30％的甘油中，-80℃冰箱中保存；
其中，PVK培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)2 5g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
LB培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母5g，蒸馏水1000mL，PH值为6.8～7，121℃灭菌20min；
S4：菌株的鉴定：将步骤S3筛选出的菌株接种于NBRIP固体培养基内，32℃下倒置培养7天后，测定溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)及D/d的比值，获得四株溶磷圈大而显著的菌株，菌株编号为A14、A12、B5、C5，图1为菌株B5的透明溶磷圈；
其中，NBRIP培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
S5：步骤S5具体为将步骤S4筛选出来的A14、A12、B5、C5菌株在NB液体培养基中，培养24h后，取0.5mL菌液于含50mL Ca3(PO4)2的NBRIP液体培养基中，32℃170r/min的条件下培养7天，每24h取三角瓶中的培养液1mL，超声波震碎细胞后，10000r/min条件下离心2min，采用钼蓝比色法测定有效磷的含量，选择出有效磷含量最多的菌株B5。
以下为B5菌株的鉴定：
1、B5菌株的生理生化鉴定
将筛选出来的优势菌株B5，进行革兰氏染色、氧化酶试验、接触酶试验、吲哚试验、V-P、柠檬酸盐、明胶液化、硫化氢、甲基红等生理生化试验；
其中，吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛1g，乙醇95mL，浓盐酸20mL。先将二甲基氨基苯甲醛用乙醇溶解，再加浓盐酸；
V-P试验
A液：6gα-萘酚溶解于94mL的乙醇溶液中；
B液：40g KOH溶于60mL蒸馏水中。
试验表明(如表1所示)，该菌株为革兰氏阴性菌株，菌株B5可以利用柠檬酸盐为碳源，产生胞外酶-明胶酶液化明胶、产生过氧化氢酶、吲哚、且生成H2S，而甲基红试验、V-P反应、吲哚试验、氧化酶试验为阴性。
表1菌株B5生理生化鉴定结果
Figure BDA0002251279190000061
2、16SrDNA序列鉴定
将将优势菌株B5在LB固体培养基上培养24h后，挑取菌落。16SrDNA引物为细菌通用引物(27F:5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇和1540R:5＇－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3＇)，首先进行PCR扩增，将扩增2h后的产物按照表中体系配制，在琼脂糖浓度为1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳后在稀释的溴化乙锭(EB)浸泡3-5min后，在凝胶成像仪中分析，该菌株在1500bp左右。将菌株活化后，交由上海生物工程有限公司进行测序，得到的菌株序列在NCBI上Blast数据库中比对。
优势菌株B5经16SrDNA测序获得1495bp的基因序列。将测序结果与在NCBI中的Blast核酸数据库中进行同源性对比，鉴定菌株，并用MEGA6.0软件构建系统进化树，如图2所示，其中bootstrap值为1000，并分析菌株的遗传性质。对比显示菌株B5与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)具有高度同源性。与荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌相似度为99％。
最适pH测定：
配制NBRIP液体培养基，初始PH分别设置为5、6、7、8、9五个浓度，121℃灭菌20min。在LB固体培养基上活化优势菌株，将菌株在液体NB培养基培养过夜，使其OD600nm＝1。在含50mL NBRIP液体培养基的玻璃品中加入0.5mL的菌液，32℃，170r/min培养5天后取1mL溶液在10000r/min、2min条件下离心，用pH计测pH、分光光度计测定溶液中的有效磷含量。B5菌株的最适pH测定结果如图3所示。当菌株B5在pH值为5.0时解磷效果较弱，在pH为7～9时均可以产生较高的溶磷量，说明该菌在碱性土壤中的解磷效果较好，其中pH为7时溶液中的有效磷含量最高。
最适生长温度测定：
配制含磷酸三钙的NBRIP液体培养基，按照上述条件培养后接种0.5％的菌液，分别于4℃、8℃、20℃、27℃、32℃、37℃下培养5天后取1mL溶液于10000r/min，2min条件下离心，测定试液中有效磷含量。结果如图4所示，当菌株处于27℃、32℃时，有效磷的含量分别为352.28mg/L、342.75mg/L，37℃时有效磷含量降低，表明假单胞菌在30℃左右时生长较好，菌株在4℃时解磷效果最差,有效磷含量仅为53.57mg/L。
不同碳源下解磷能力测定：
将B5菌株在LB固体培养基中活化，NB液体培养基震荡培养24h，设定菌悬液的OD600nm＝1，配置NBRIP液体培养基，分别用等量的乳糖、半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉替换，28℃下170r/min震荡培养5d，测定产生的有效磷含量及pH值。结果如图5所示，碳源为葡萄糖时有效磷的含量最高有效磷含量为505.62mg/L，此时pH值最低为4.37，其次是同为单糖的半乳糖，有效磷含量为259.23mg/L，pH值为4.63。但以二糖及多糖时解磷菌的利用率较低，有效磷含量为10mg/L以下，其pH值较高。以上分析表明，菌株B5相对于其他糖类对单糖的利用率较高；pH值在单糖中下降幅度较大表明此时产酸的能力活跃，以可溶性淀粉为碳源时pH值最高其解磷能力也较单糖低。试液中pH值的下降与有效磷含量相一致。目前，解磷菌利用葡萄糖分泌低分子的有机酸，从而释放有效磷，为解磷菌溶解无机磷的普遍解磷机制。因此B5菌株在不同碳源下解磷能力强弱顺序为：葡萄糖＞半乳糖＞乳糖＞蔗糖＞可溶磷淀粉。
不同氮源下解磷能力测定：
菌液培养条件同上，将NBRIP中的(NH4)2SO4替换成等量的尿素、NH4Cl、KNO3，28℃条件下170r/min振荡培养5d后测定试液的有效磷含量及PH值。结果如图为6所示，菌株B5在以硫酸铵为氮源时，有效磷含量最高为498.63mg/L，氮源为硝酸钾时解磷能力最弱约为38mg/L，氮源为氯化铵与尿素其溶磷量分别为89.3mg/L、92.59mg/L，菌株B5在不同氮源下的解磷能力由强至弱依次为，(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、KNO3。
不同磷源下解磷能力测定：
菌液培养条件同上，将NBRIP中的磷酸三钙替换成等量的磷酸铝、磷酸铁、植酸钙、卵磷脂，28℃下170r/min震荡培养5d后测定试液中有效磷的含量与PH值。结果如图7所示，以磷酸三钙为磷源时，有效磷含量最高为523.45mg/L，之后为植酸钙，有效磷含量为108.96mg/L，当磷源为磷酸铝、卵磷脂、磷酸铁时，有效磷含量较低分别为26mg/L、24.85mg/L、6.38mg/L。除了以有机磷的卵磷脂为磷源时，溶液的PH值升高至8.05，其余以无机磷为磷源时，溶液的PH值不同程度的减小。试验结果表明，菌株B5可以溶解有机磷，但相比无机磷效果较差。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明作出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种解磷菌，其特征在于，所述解磷菌名称为B5菌株，所述B5菌株为假单胞菌属细菌；
其生化指标测定结果为：革兰氏染色阴性，甲基红试验阴性，V-P反应阴性，吲哚试验阴性，氧化酶试验阴性，菌株B5可以利用柠檬酸盐为碳源，产生胞外酶-明胶酶液化明胶、产生过氧化氢酶、吲哚、且生成H2S；
所述B5菌株在不同碳源下解磷能力强弱顺序为：葡萄糖＞半乳糖＞乳糖＞蔗糖＞可溶磷淀粉，在不同氮源下解磷能力顺序为硫酸铵＞氯化铵＞尿素＞硝酸钾；所述B5菌株最适生长温度为28～32℃，所述B5菌株最适生长pH为7～9。
2.一种权利要求1所述的解磷菌的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:土壤采样：采集于新疆昌吉市室外土壤，采集地面5cm下的土壤样品；
S2：取步骤S1采集的1g土壤，研钵研碎置于含90mL无菌水的锥形瓶内，摇床28℃、170r/min震荡混匀20min，静止10min；
S3：分离与提纯：取步骤S2中的溶液1μL无菌水的离心管内，设置浓度梯度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取1mL涂布于PVK固体培养基，每个浓度重复三次，3天后挑取周围有透明溶磷圈的菌落，在LB固体培养基上纯化5次。筛选出菌株置于30％的甘油中，-80℃冰箱中保存；
其中，PVK培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)25g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
LB培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母5g，蒸馏水1000mL，pH值为6.8～7，121℃灭菌20min；
S4：菌株的鉴定：将步骤S3筛选出的菌株接种于NBRIP固体培养基内，32℃下倒置培养7天后，获得四株溶磷圈大而显著的菌株，菌株编号为A14、A12、B5、C5；
其中，NBRIP培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，Ca3(PO4)2 5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，120℃灭菌20min；
S5：采用钼蓝比色法对A14、A12、B5、C5进行解磷能力的确定，选择出解磷能力最强的菌株B5。
3.根据权利要求2所述的解磷菌的提取方法，其特征在于，步骤S5具体为将步骤S4筛选出来的A14、A12、B5、C5菌株在NB液体培养基中，培养24h后，取0.5mL菌液于含50mL Ca3(PO4)2的NBRIP液体培养基中，32℃170r/min的条件下培养7天，每24h取三角瓶中的培养液1mL，超声波震碎细胞后，10000r/min条件下离心2min，采用钼蓝比色法测定有效磷的含量，选择出有效磷含量最多的菌株B5。
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