CN110699303A - 一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属微生物技术领域，具体涉及一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。该菌株于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCCNo.17557。该菌能够高效地将难溶性无机磷转化为可溶性有效磷，以磷酸钙为唯一磷源时，其溶磷量可达793 mg/L。将该菌制备成解磷菌剂，可广泛用于农业生产中，能够有效提高土壤中有效磷的含量，达到节肥增产的效果，具有良好的社会、经济和环境效益。

Description

一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。
背景技术
磷是植物生长所必须的营养元素之一，参与植物体内大部分的新陈代谢过程。然而，环境中的磷通常以磷酸钙盐的形式存在，不能被植物直接吸收和利用，导致大部分耕地严重缺磷。由于磷是不可再生的矿质资源，土壤中磷含量不足已成为制约农作物产量的重要因素。因此，农业生产上通常以施用磷肥的方式来解决上述问题。但是，磷肥进去土壤后，大部分磷会淋失、挥发或者与土壤中的Ca+、Fe3+、Al3+等离子结合形成难溶的磷酸盐，作物仍然无法吸收利用，导致磷肥的利用率仅有20%左右。
微生物对土壤中磷利用率的影响作用较大，解磷菌能够将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性有效磷，供植物吸收利用。
发明内容
本发明的目的是为基于上述现有技术状况，提供一株基于自主分离筛选的高效解磷假单胞菌及其应用，本发明筛选得到的解磷菌1416X3，其原始解磷能力为741 mg/L，优化其生长的无机磷发酵培养基初始pH和培养温度后，其解磷能力可达793 mg/L，将该菌制成微生物菌剂，利用解磷菌剂和肥料的共同作用来促进植物生长，可增加作物产量，提高土壤中磷的有效利用率，改善土壤质量，对农业、经济和环境具有非常重要的意义。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的：
以磷酸钙作为控制磷源，采用平板筛选法从太湖沉积物样品中初筛得到12株具有溶磷圈的细菌，再采用摇瓶培养法复筛，得到一株高效解磷的假单胞菌1416X3，该菌的菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性。该菌株已于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其菌种保藏号为CGMCC No. 17557。
利用上述假单胞菌1416X3生产微生物菌剂的方法如下：
1）将上述假单胞菌1416X3接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期（菌量约108CFU/mL），震荡培养；培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm，500 mL三角瓶装液量150-250 mL，培养时间24-36 h；
所述LB培养基成分组成为：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0-7.2，121 ℃灭菌20 min。
2）按照1-5%接种量将培养好的种子液接种于含有磷酸钙的无机磷液体培养基中，初始pH 7.0-7.2，温度25-30℃，转速150-200 rpm，发酵24-36 h；
所述无机磷发酵培养基成分组成为：葡萄糖15 g/L，MgCl2·6H2O 5 g/L，MgSO4·7H2O0.25 g/L，KCl 0.2 g/L，(NH4)2SO4 0.2 g/L，Ca3(PO4)2 5 g/L，pH 7.0-7.2，115 ℃灭菌30min。
3）发酵结束后，培养液罐装成微生物菌剂。培养液中可溶性磷含量可达793 mg/L，解磷效果显著。
本发明所提供的菌株丰富了解磷菌菌种资源，减少了磷肥的用量，改善了土壤肥力、提高了农作物产量，降低了环境污染，应用前景广阔。
附图说明：
图1不同培养温度和初始pH值对假单胞菌1416X3的影响。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述，但不限于下列实例。
实施例1：解磷菌的筛选和溶磷能力测定
采用十倍梯度稀释法从湖水沉积物样品中分离筛选到一株解磷菌，申请人将其命名为1416X3，该菌的菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性，经16S rRNA基因测序确定细菌1416X3为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。
将菌株1416X3接入LB液体培养基，28℃、150 rpm振荡培养24 h后。分别接种2 mL种子液于装有100 mL无机磷液体培养基的250 mL三角瓶中，以不加任何菌的培养基作为空白对照，每个处理三个重复，28℃、150 rpm 振荡培养5天，每24 h取培养液，10000 rpm离心10 min，取上清液，用钼锑抗比色法测定其可溶性磷含量，结果表明菌株1416X3的解磷能力为741 mg/L。
其中，无机磷培养基组成为：葡萄糖15 g/L，MgCl2·6H2O 5 g/L，MgSO4·7H2O0.25 g/L，KCl 0.2 g/L，(NH4)2SO4 0.2 g/L，Ca3(PO4)2 5 g/L，pH 7.0-7.2，115 ℃灭菌30min。
其中，LB培养基组成为：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L， pH7.0-7.2，固体培养基加15 g琼脂，121 ℃灭菌20 min。
实施例2：解磷菌的发酵方法
（1）种子扩大培养：从斜面上取1-2环假单胞菌1416X3的菌苔，接种于已灭菌的LB液体培养基中震荡培养；培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm，500 mL三角瓶装液量150-250 mL，培养时间24-36 h，其中，LB培养基成分组成为：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0-7.2，固体培养基加15 g琼脂，121 ℃灭菌20 min。
（2）发酵培养：将上述种子液，以1-5%接种量（w/w）接入无机磷发酵培养基中，温度25-30℃，转速150-200 rpm，发酵时间24-36 h；无机磷培养基成分组成为：葡萄糖15 g/L，MgCl2·6H2O 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KCl 0.2 g/L，(NH4)2SO4 0.2 g/L，Ca3(PO4)2 5g/L，pH 7.0-7.2，115 ℃灭菌30 min。
（3）发酵结束后，培养液罐装成菌剂。
实施例3：不同培养温度和初始pH值对假单胞菌1416X3的影响
将假单胞菌1416X3接入LB液体培养基上，28℃、150 rpm振荡培养24 h。取2 mL培养好的假单胞菌1416X3种子液，接种于含有100 mL无机磷液体培养基的250 mL三角瓶中，以未接菌的培养液作为对照，分别在20℃、28℃、37℃、40℃条件下，150 rpm振荡培养5天，每个处理重复3次，每24 h取发酵液，10000 rpm离心10 min，取上清液，用钼锑抗比色法测定有效磷的含量，结果如图1所示。结果表明（图1），假单胞菌1416X3在28℃时解磷效果最好，优化培养温度后，其溶磷量从原来的741 mg/L增加到758 mg/L。
初始pH条件优化时，分别将无机磷液体培养基的pH值调为6、6.5、7、7.5、8，其他条件保持恒定。结果表明（图1），假单胞菌1416X3在pH值为7时解磷效果最好，优化无机磷液体培养基的初始pH值后，其溶磷量进一步增至793 mg/L。
实施例4：解磷菌的应用
采集郑州市郊区农田中土壤（0-20 cm），去除杂质。将30 g土壤加入95 mL无菌水中，并接种5 mL假单胞菌1416X3的种子液，同时以接种5 mL灭活的假单胞菌1416X3的种子液，作为对照，常温条件下，静置，每24 h取上清液，采用钼锑抗比色法测定其可溶性有效磷的含量。结果显示，与对照组相比，在假单胞菌1416X3的作用下，土壤可溶性有效磷含量提高了24%。

Claims (6)

1.一株高效解磷假单胞菌，其特征在于：该菌株为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的菌株1416X3，该菌株于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No. 17557。
2.根据权利要求1所述的高效解磷假单胞菌，其特征在于，该菌株的16S rRNA基因序列已提交GenBank数据库，登录号为MK280701；该菌的菌落呈圆形、黄色，细胞杆状，革兰氏染色阴性。
3.一种用权利要求1-2所述的高效解磷假单胞菌生产的微生物菌剂，其特征在于，是通过以下方法生产：
（1）种子培养：将新鲜的假单胞菌1416X3接种于已灭菌的LB液体培养基中，震荡培养；培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm，500 mL三角瓶装液量150-250 mL，培养时间24-36 h；
（2）发酵培养：将上述种子液，以1-5%接种量（w/w）接入无机磷发酵培养基中，温度25-30℃，转速150-200 rpm，发酵时间24-36 h；
（3）发酵结束后，培养液罐装成菌剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述LB培养基成分组成为：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0-7.2，121 ℃灭菌20 min。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述无机磷发酵培养基成分组成为：葡萄糖15 g/L，MgCl2·6H2O 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KCl 0.2 g/L，(NH4)2SO40.2 g/L，Ca3(PO4)2 5 g/L，pH 7.0-7.2，115 ℃灭菌30 min。
6.一种根据权利要求3所述的微生物菌剂，应用于农业生产中，可有效提高土壤中有效磷的含量，具有节肥增产效果。
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