CN110699303A - 一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属微生物技术领域,具体涉及一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。该菌株于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,菌种保藏号为CGMCCNo.17557。该菌能够高效地将难溶性无机磷转化为可溶性有效磷,以磷酸钙为唯一磷源时,其溶磷量可达793 mg/L。将该菌制备成解磷菌剂,可广泛用于农业生产中,能够有效提高土壤中有效磷的含量,达到节肥增产的效果,具有良好的社会、经济和环境效益。

Description

一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用。
背景技术
磷是植物生长所必须的营养元素之一,参与植物体内大部分的新陈代谢过程。然而,环境中的磷通常以磷酸钙盐的形式存在,不能被植物直接吸收和利用,导致大部分耕地严重缺磷。由于磷是不可再生的矿质资源,土壤中磷含量不足已成为制约农作物产量的重要因素。因此,农业生产上通常以施用磷肥的方式来解决上述问题。但是,磷肥进去土壤后,大部分磷会淋失、挥发或者与土壤中的Ca+、Fe3+、Al3+等离子结合形成难溶的磷酸盐,作物仍然无法吸收利用,导致磷肥的利用率仅有20%左右。
微生物对土壤中磷利用率的影响作用较大,解磷菌能够将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性有效磷,供植物吸收利用。
发明内容
本发明的目的是为基于上述现有技术状况,提供一株基于自主分离筛选的高效解磷假单胞菌及其应用,本发明筛选得到的解磷菌1416X3,其原始解磷能力为741 mg/L,优化其生长的无机磷发酵培养基初始pH和培养温度后,其解磷能力可达793 mg/L,将该菌制成微生物菌剂,利用解磷菌剂和肥料的共同作用来促进植物生长,可增加作物产量,提高土壤中磷的有效利用率,改善土壤质量,对农业、经济和环境具有非常重要的意义。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的:
以磷酸钙作为控制磷源,采用平板筛选法从太湖沉积物样品中初筛得到12株具有溶磷圈的细菌,再采用摇瓶培养法复筛,得到一株高效解磷的假单胞菌1416X3,该菌的菌落呈圆形、黄色,细胞杆状,革兰氏染色阴性。该菌株已于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其菌种保藏号为CGMCC No. 17557。
利用上述假单胞菌1416X3生产微生物菌剂的方法如下:
1)将上述假单胞菌1416X3接种于LB液体培养基中,培养至对数生长期(菌量约108CFU/mL),震荡培养;培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm,500 mL三角瓶装液量150-250 mL,培养时间24-36 h;
所述LB培养基成分组成为:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0-7.2,121 ℃灭菌20 min。
2)按照1-5%接种量将培养好的种子液接种于含有磷酸钙的无机磷液体培养基中,初始pH 7.0-7.2,温度25-30℃,转速150-200 rpm,发酵24-36 h;
所述无机磷发酵培养基成分组成为:葡萄糖15 g/L,MgCl2·6H2O 5 g/L,MgSO4·7H2O0.25 g/L,KCl 0.2 g/L,(NH4)2SO4 0.2 g/L,Ca3(PO4)2 5 g/L,pH 7.0-7.2,115 ℃灭菌30min。
3)发酵结束后,培养液罐装成微生物菌剂。培养液中可溶性磷含量可达793 mg/L,解磷效果显著。
本发明所提供的菌株丰富了解磷菌菌种资源,减少了磷肥的用量,改善了土壤肥力、提高了农作物产量,降低了环境污染,应用前景广阔。
附图说明:
图1不同培养温度和初始pH值对假单胞菌1416X3的影响。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下是结合附图和实施例对本发明作的进一步阐述,但不限于下列实例。
实施例1:解磷菌的筛选和溶磷能力测定
采用十倍梯度稀释法从湖水沉积物样品中分离筛选到一株解磷菌,申请人将其命名为1416X3,该菌的菌落呈圆形、黄色,细胞杆状,革兰氏染色阴性,经16S rRNA基因测序确定细菌1416X3为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
将菌株1416X3接入LB液体培养基,28℃、150 rpm振荡培养24 h后。分别接种2 mL种子液于装有100 mL无机磷液体培养基的250 mL三角瓶中,以不加任何菌的培养基作为空白对照,每个处理三个重复,28℃、150 rpm 振荡培养5天,每24 h取培养液,10000 rpm离心10 min,取上清液,用钼锑抗比色法测定其可溶性磷含量,结果表明菌株1416X3的解磷能力为741 mg/L
其中,无机磷培养基组成为:葡萄糖15 g/L,MgCl2·6H2O 5 g/L,MgSO4·7H2O0.25 g/L,KCl 0.2 g/L,(NH4)2SO4 0.2 g/L,Ca3(PO4)2 5 g/L,pH 7.0-7.2,115 ℃灭菌30min。
其中,LB培养基组成为:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L, pH7.0-7.2,固体培养基加15 g琼脂,121 ℃灭菌20 min。
实施例2:解磷菌的发酵方法
(1)种子扩大培养:从斜面上取1-2环假单胞菌1416X3的菌苔,接种于已灭菌的LB液体培养基中震荡培养;培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm,500 mL三角瓶装液量150-250 mL,培养时间24-36 h,其中,LB培养基成分组成为:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨10g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0-7.2,固体培养基加15 g琼脂,121 ℃灭菌20 min。
(2)发酵培养:将上述种子液,以1-5%接种量(w/w)接入无机磷发酵培养基中,温度25-30℃,转速150-200 rpm,发酵时间24-36 h;无机磷培养基成分组成为:葡萄糖15 g/L,MgCl2·6H2O 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,KCl 0.2 g/L,(NH4)2SO4 0.2 g/L,Ca3(PO4)2 5g/L,pH 7.0-7.2,115 ℃灭菌30 min。
(3)发酵结束后,培养液罐装成菌剂。
实施例3:不同培养温度和初始pH值对假单胞菌1416X3的影响
将假单胞菌1416X3接入LB液体培养基上,28℃、150 rpm振荡培养24 h。取2 mL培养好的假单胞菌1416X3种子液,接种于含有100 mL无机磷液体培养基的250 mL三角瓶中,以未接菌的培养液作为对照,分别在20℃、28℃、37℃、40℃条件下,150 rpm振荡培养5天,每个处理重复3次,每24 h取发酵液,10000 rpm离心10 min,取上清液,用钼锑抗比色法测定有效磷的含量,结果如图1所示。结果表明(图1),假单胞菌1416X3在28℃时解磷效果最好,优化培养温度后,其溶磷量从原来的741 mg/L增加到758 mg/L。
初始pH条件优化时,分别将无机磷液体培养基的pH值调为6、6.5、7、7.5、8,其他条件保持恒定。结果表明(图1),假单胞菌1416X3在pH值为7时解磷效果最好,优化无机磷液体培养基的初始pH值后,其溶磷量进一步增至793 mg/L。
实施例4:解磷菌的应用
采集郑州市郊区农田中土壤(0-20 cm),去除杂质。将30 g土壤加入95 mL无菌水中,并接种5 mL假单胞菌1416X3的种子液,同时以接种5 mL灭活的假单胞菌1416X3的种子液,作为对照,常温条件下,静置,每24 h取上清液,采用钼锑抗比色法测定其可溶性有效磷的含量。结果显示,与对照组相比,在假单胞菌1416X3的作用下,土壤可溶性有效磷含量提高了24%。

Claims (6)

1.一株高效解磷假单胞菌,其特征在于:该菌株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株1416X3,该菌株于2019年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为 CGMCC No. 17557。
2.根据权利要求1所述的高效解磷假单胞菌,其特征在于,该菌株的16S rRNA基因序列已提交GenBank数据库,登录号为MK280701;该菌的菌落呈圆形、黄色,细胞杆状,革兰氏染色阴性。
3.一种用权利要求1-2所述的高效解磷假单胞菌生产的微生物菌剂,其特征在于,是通过以下方法生产:
(1)种子培养:将新鲜的假单胞菌1416X3接种于已灭菌的LB液体培养基中,震荡培养;培养条件为温度25-30 ℃、转速150-200 rpm,500 mL三角瓶装液量150-250 mL,培养时间24-36 h;
(2)发酵培养:将上述种子液,以1-5%接种量(w/w)接入无机磷发酵培养基中,温度25-30℃,转速150-200 rpm,发酵时间24-36 h;
(3)发酵结束后,培养液罐装成菌剂。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂,其特征在于,所述LB培养基成分组成为:酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0-7.2,121 ℃灭菌20 min。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂,其特征在于,所述无机磷发酵培养基成分组成为:葡萄糖15 g/L,MgCl2·6H2O 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,KCl 0.2 g/L,(NH4)2SO40.2 g/L,Ca3(PO4)2 5 g/L,pH 7.0-7.2,115 ℃灭菌30 min。
6.一种根据权利要求3所述的微生物菌剂,应用于农业生产中,可有效提高土壤中有效磷的含量,具有节肥增产效果。
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